СПИСОК ДОКУМЕНТОВ

2297451 Способ размножения кроветворных стволовых клеток

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ

(54) СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ КРОВЕТВОРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
(57) Реферат:
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно, к выделению кроветворных стволовых клеток, и может быть использовано для трансплантации. Полученные из костного мозга Lin-отрицательные или слабоположительные клетки культивируют в присутствии макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF) в концентрации приблизительно от 5 до 20 нг/мл, вместе с композицией цитокинов, включающей фактор стволовых клеток (SCF), интерлейкин-11 (IL-11) и лиганд fms-подобную тирозинкиназу (FLT) или тромбоцитопоэтин (ТРО). При этом цитокины используют в следующем весовом соотношении: 1-4 M-CSF:20 SCF:20 IL-11:20 (FLT или ТРО). Изобретение позволяет направленно размножить кроветворные стволовые клетки при культивировании популяции Lin-отрицательных или слабоположительных клеток, полученных из костного мозга. 4 н.п. ф-лы, 1 табл., 3 ил.
Область техники
Настоящее изобретение относится к способу размножения кроветворных стволовых клеток с макрофагальным колониестимулирующим фактором (M-CSF). Изобретение, в частности, относится к способу культивирования Lin-отрицательных или слабоположительных клеток в присутствии M-CSF, к размножению кроветворных стволовых клеток путем культивирования Lin-отрицательных или слабоположительных клеток в присутствии M-CSF, к популяциям кроветворных стволовых клеток, полученных по указанному способу размножения, к набору, который используют для культивирования Lin-отрицательных или слабоположительных клеток, содержащих M-CSF, и к средству, которое используют для размножения кроветворных стволовых клеток, содержащих M-CSF.
Предпосылки изобретения
Кроветворными стволовыми клетками называют клетки, которые обладают как способностью продуцировать все гемоциты, такие как эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, Т- и В-лимфоциты (полипотентность), так и способностью самообновлять самих себя (способность к самообновлению). При трансплантации костного мозга кроветворные стволовые клетки играют основную роль в пересаженном костном мозге, а потому трансплантацию костного мозга можно иными словами назвать трансплантацией кроветворных стволовых клеток. В настоящее время трансплантация костного мозга является радикальным методом лечения многих трудноизлечимых заболеваний, таких как различные заболевания крови, рак, иммунодефицит, врожденное расстройство обмена веществ. Однако при таких трансплантациях общие антигены лейкоцитов человека (HLA-антигены) донора должны быть такими же, что и у реципиента, и дефицит доноров в настоящее время вызывает беспокойство общественности.
Периферическую кровь часто используют в настоящее время в качестве источника кроветворных стволовых клеток вместо костного мозга. Лишь небольшое количество CD34-положительных клеток, в том числе кроветворных стволовых клеток, может содержаться в периферической крови здорового человека, однако большое количество таких клеток может быть мобилизовано в периферическую кровь из костного мозга этого человека в том случае, если ему постоянно вводят гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF). С помощью сепаратора компонентов крови на этой стадии из периферической крови можно собрать большое количество периферических кроветворных стволовых клеток/предшественников кроветворных клеток, которые могут быть использованы при трансплантации. Однако при этом необходимо решить некоторые проблемы, которые касаются эффективности мобилизации кроветворных стволовых клеток в периферическую кровь и безопасности донора.
В качестве другого источника кроветворных стволовых клеток для трансплантации стволовых клеток пуповинной крови можно использовать пуповинную кровь. Однако поскольку количество кроветворных стволовых клеток в пуповинной крови мало, то подобную трансплантацию стволовых клеток пуповинной крови проводят только детям.
Из рассмотренных предпосылок понятно, что необходима методика размножения кроветворных стволовых клеток ex vivo, и с этой целью к настоящему времени были опробованы многочисленные способы. Например, имеются сообщения, касающиеся размножения кроветворных стволовых клеток, в которых приводятся результаты культивирования клеток в присутствии цитокинов, таких как фактор стволовых клеток (SCF), интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-11 (IL-11), G-CSF, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), лиганд (FL) fms-подобной тирозинкиназы-3 (Flt-3), тромбоцитопоэтин (TPO). Предшественники кроветворных клеток и дифференцированные из них клетки могут значительно размножиться, если их культивируют совместно с такими цитокинами или другими факторами роста, однако степень размножения кроветворных стволовых клеток, культивированных указанным путем, возрастает лишь в несколько раз и не является достаточной (Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 13648-13653, 1997; Matsunaga et al., Blood, 92, 452-461, 1998; Bryder et al., Blood, 96, 1748-1755, 2000). Предшественники кроветворных клеток в общем случае определяют как клетки, которые обладают колониеобразующей способностью в условиях in vitro. Но поскольку они не самообновляются и не обладают способностью продуцировать клетки крови в течение длительного времени, предшественники кроветворных клеток бесполезны в качестве источника гемоцитов для трансплантации.
Далее, была опробована методика размножения кроветворных стволовых клеток при совместном культивировании с клетками стромы костного мозга, однако она также позволяет увеличить объем клеток лишь в несколько раз (Moore et al., Blood, 89, 4337-4347, 1997).
С другой стороны, если цитокин, фактор роста и т.п. могли бы непосредственно вводиться в живые организмы с целью значительно увеличить в них объем кроветворных стволовых клеток, то тогда, например, в качестве источника для трансплантации могла бы использоваться пуповинная или аналогичная кровь, которая содержит лишь небольшое количество кроветворных стволовых клеток. Однако никто еще не сообщал об успешном проведении подобных экспериментов.
Целью настоящего изобретения является применение в клинических условиях кроветворных стволовых клеток, которые размножают в условиях ex vivo путем увеличения уровня размножения кроветворных стволовых клеток с помощью цитокинов или факторов роста в условиях ex vivo, что до настоящего времени оказывалось неэффективным. Еще одной целью настоящего изобретения является размножение кроветворных стволовых клеток in vivo путем прямого введения цитокина в живой организм.
Описание изобретения
В результате интенсивных исследований, которые проводились для решения указанных выше проблем, авторы настоящего изобретения обнаружили, что когда клетки, которые являются отрицательными или слабоположительными в отношении маркера линии дифференцировки (Lin) и которые могут содержать кроветворные стволовые клетки, активируют с помощью макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF) или другого цитокина, то уровень размножения кроветворных стволовых клеток может быть увеличен, что и составляет суть настоящего изобретения.
Таким образом, изобретение относится к способу культивирования Lin-отрицательных или слабоположительных клеток в присутствии макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF).
Изобретение также относится к способу размножения кроветворных стволовых клеток путем культивирования Lin-отрицательных или слабоположительных клеток в присутствии макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF).
Далее, изобретение относится к популяциям кроветворных стволовых клеток, полученных указанным выше способом размножения.
Кроме того, изобретение относится к набору, который используют для культивирования Lin-отрицательных или слабоположительных клеток и который содержит макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF).
Наконец, изобретение относится к агенту для усиления размножения кроветворных стволовых клеток, содержащему макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF).
Путь осуществления изобретения
Способ культивирования и способ размножения согласно изобретению отличаются тем, что Lin-отрицательные или слабоположительные клетки культивируют в присутствии M-CSF. Авторы настоящего изобретения культивировали Lin-отрицательные или слабоположительные клетки в присутствии M-CSF с целью изучения того, смогут ли или не смогут кроветворные стволовые клетки размножаться. В результате было обнаружено, что клеточная культура в присутствии M-CSF приводит к значительному размножению кроветворных клеток по сравнению с клеточной культурой в отсутствие M-CSF. Таким образом, способ культивирования согласно настоящему изобретению применим для размножения кроветворных стволовых клеток. Далее, популяция кроветворных стволовых клеток, которую размножали способом согласно изобретению, может использоваться в качестве источника для трансплантации кроветворных стволовых клеток.
Lin-отрицательные или слабоположительные клетки предпочтительно отбирают с помощью маркера клеточной поверхности, который служит в качестве показателя для Lin. Lin означает "маркер линии (направления) дифференцировки" и включает в себя, например, маркер эритроцитов, Ter119; маркер гранулоцитов, Gr-1; маркер Mac-1 моноцитарных макрофагов (CD11b) и Т-клеточный маркер Ly1. Известно, что кроветворные стволовые клетки содержатся в Lin-отрицательных или слабоположительных фракциях.
Lin-отрицательные или слабоположительные клетки можно собрать путем обработки суспензии отдельных клеток из клеток костного мозга с помощью содержащих метку антител, которые распознают Lin, и путем отделения содержащих метку клеток с помощью клеточного сортера, такого как проточный цитофлуориметр. Что касается клеток мыши, то, например, клетки, обработанные с помощью StemSepTM (StemCell Technologies Inc.), которые содержат смесь антител для приготовления предшественников кроветворных клеток, широко используются для Lin-отрицательных или слабоположительных клеток. В приведенном ниже примере клетки, обработанные с помощью StemSepTM, составляют около 0,5% от количества необработанных клеток.
Полученные указанным способом клетки культивируют в присутствии M-CSF, для чего условия культивирования, включая среду, период культивирования и планшет специально не оговариваются, однако предпочтительно их выбирают таким образом, чтобы клетки могли хорошо сохраняться в выбранных условиях. Так, в приведенном далее примере полученные Lin-отрицательные или слабоположительные клетки высевают в 6-луночные микропланшеты для выращивания культур тканей (Iwaki) в количестве 4×104 клеток на лунку и культивируют в течение 6 дней в среде RPMI 1640 (Gibco-BRL), содержащей 5% сыворотки плода коровы и 10 мкг/мл гентамицина (Sigma), в присутствии 5% CO2 при температуре 37°С. Однако изобретение не ограничивается этим примером.
M-CSF может быть, например, получен от компании Pepro Tech Inc., однако его можно получить обычными методами генной инженерии путем введения гена, кодирующего M-CSF, в подходящий вектор экспрессии белка. Не существует специальных ограничений на использование M-CSF согласно изобретению. Желательно выбирать M-CSF в соответствии с образцами клеток животного, которые используют при осуществлении настоящего изобретения, однако в приемлемом интервале реакционной способности можно использовать и M-CSF, полученный от любых других видов.
Более предпочтительно, в культивируемые клетки добавляют подходящий цитокин или фактор роста. Добавляемым цитокином или фактором роста являются такие цитокины или факторы роста, для которых известно, что они эффективны для сохранения, активирования роста и инициирования дифференцировки кроветворных стволовых клеток (Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 13648-13653, 1997; Matsunaga et al., Blood, 92, 452-461, 1998; Bryder et al., Blood, 96, 1748-1755, 2000), такие как SCF, IL-3, IL-6, IL-11, G-CSF, GM-CSF, FLT, TPO, фактор ингибирования лейкемии (LIF), основной фактор роста фибробластов (основной FGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), однако изобретение ими не ограничивается.
Как указано выше, кроветворными стволовыми клетками являются такие клетки, которые обладают не только способностью продуцировать все гемоциты (полипотентность), но и способностью самообновлять самих себя (способность к самообновлению). Следовательно, для выяснения того, можно ли размножить кроветворные стволовые клетки, предпочтителен метод, который позволяет подтвердить обе указанные способности клеток. Например, когда используют клетки мыши, то это можно подтвердить с помощью продолжительного анализа репопуляции. Такой метод будет подробно рассмотрен в примере. Если коротко, то клетки, содержащие кроветворные стволовые клетки, трансплантируют животному и затем за животным наблюдают на предмет того, смогут ли клетки крови, продуцированные из стволовых клеток, существовать в крови животного в течение длительного времени. В настоящее время это наиболее надежный метод количественного определения кроветворных стволовых клеток (Harrison et al., Exp. Hematol., 21, 206-219, 1993).
В том случае, если используют клетки человека, можно применить метод, в котором в качестве животных для имплантации используют NOD/SCID (не страдающих ожирением, но пораженных тяжелым комбинированным иммунодефицитом) мышей или NOD/SCID мышей с 2-микроглобулиновой недостаточностью (Larochelle et al., Nat. Med., 2, 1329-1337, 1996; Kollet et al., Blood., 95, 3102-3105, 2000).
Количество M-CSF, которое необходимо добавить в среду с клеточной культурой, предпочтительно составляет от 0,1 до 100 нг/мл или около того, более предпочтительно - от 1 до 50 нг/мл или около того, наиболее предпочтительно - от 5 до 20 нг/мл или около того. Способность к размножению кроветворных стволовых клеток исследовали путем добавления к среде 0, 1, 10 или 100 нг/мл M-CSF, и в итоге было обнаружено, что при добавлении M-CSF в количестве 10 нг/мл он значительно способствовал размножению клеток, однако добавление M-CSF в количестве 100 нг/мл скорее замедляло, чем способствовало размножению клеток. Можно предположить, что для размножения кроветворных стволовых клеток существует оптимальная концентрация M-CSF.
Далее клетки, выделенные из Lin-отрицательных или слабоположительных клеток методом положительной селекции с помощью c-набора и Sca-1, которые известны как маркеры кроветворных стволовых клеток, не проявляют способности к размножению при обработке с помощью M-CSF. В Lin-отрицательных или слабоположительных клетках кроветворные стволовые клетки обнаруживаются во фракции клеток (c-fms)-отрицательной в отношении рецептора M-CSF. Из этого можно заключить, что M-CSF не оказывает прямого воздействия на кроветворные стволовые клетки, а скорее воздействие M-CSF на размножение кроветворных стволовых клеток является опосредованным другими клетками, такими как (c-fms)-положительные клетки, или неким фактором, полученным из клеток.
В изобретении далее предлагается набор, содержащий M-CSF для культивирования Lin-отрицательных или слабоположительных клеток. Культуральный набор содержит M-CSF вместе с подходящим цитокином, среду и т.д., а потому подходит для ex vivo выращивания Lin-отрицательных или слабоположительных клеток.
Далее, поскольку, как указано ранее, M-CSF усиливает размножение клеток, которые сдержат кроветворные стволовые клетки, он может быть использован в качестве агента для усиления размножения кроветворных стволовых клеток. Агент для усиления размножения кроветворных стволовых клеток, содержащий M-CSF, может помимо M-CSF, включать подходящие цитокины и факторы роста. Если клеточная культура, в которую добавлен подобный агент для усиления размножения кроветворных стволовых клеток, обеспечивает эффективное ex vivo размножение кроветворных стволовых клеток, то клетки, размноженные из небольшого количества костного мозга в условиях ex vivo, или периферической крови или пуповинной крови могут быть использованы в качестве источника кроветворных стволовых клеток. Более того, если in vivo прямое введение M-CSF стимулирует значительное in vivo размножение кроветворных стволовых клеток, то даже небольшого количества кроветворных стволовых клеток будет достаточно для трансплантации, а если это так, то метод трансплантации пуповинной крови может быть применен не только для детей, но и для взрослых людей.
Краткое описание чертежей
На Фиг.1 показаны графики проточной цитометрии для популяции клеток, полученных из костного мозга мыши, в которые с помощью StemSepTM вводят метку смеси анти-Lin-антител. График "до обработки на колонке" показывает анализируемые результаты для популяции клеток, которые не проходили обработку на колонке MACS LS+; а график "после обработки на колонке" показывает анализируемые результаты для популяции клеток, которые проходили обработку на колонке. Очевидно, что обработка с помощью StemSepTM дает маркер дифференцировки Lin-отрицательных или слабоположительных клеток.
На фиг.2 показана активность M-CSF по усилению размножения клеток. Здесь столбец "процент донорных клеток" указывает в периферической крови мышей линии Ly5.2 пропорцию клеток, полученных из клеток мыши линии Ly5.1, для которых полученные из клеток мыши линии Ly5.1 Lin-отрицательные или слабоположительные клетки обрабатывают различными типами цитокинов, затем трансплантируют мышам линии Ly5.2, получившим смертельную дозу радиации, вместе с клетками, полученными от мышей линии Ly5.2, и периферическую кровь мышей линии Ly5.2 анализируют через 6 месяцев после трансплантации. "Свежий" означает, что обработка цитокином не проводилась; "SCF+IL-11+FLT" означает клеточную культуру с SCF, IL-11 и лигандом Flt-3 вместе с M-CSF; и "SCF+IL-11+TPO" означает клеточную культуру с SCF, IL-11 и TPO вместе с M-CSF.
На фиг.3 показана экспрессия различных маркеров дифференцировки лейкоцитов периферической крови мыши, для которой Lin-отрицательные или слабоположительные клетки культивировали с SCF, IL-11 и лигандом Flt-3 вместе с 10 нг/мл M-CSF, полученные клетки трансплантировали мышам, и периферическую кровь мыши анализировали через 6 месяцев после трансплантации. Если коротко, то лейкоциты периферической крови окрашивают различными биотинилированными антителами маркера дифференцировки и стрептоавидином, меченным фикоэритрином, затем дважды окрашивают противомышиным антителом линии Ly5.1, меченным флуоресцеинизотиоцианата (FITC), и затем анализируют методом проточной цитометрии. На чертеже по вертикальной оси показана интенсивность экспрессии маркера дифференцировки, Mac-1, Gr-1, B220 или CD3e; а по горизонтальной оси показана интенсивность экспрессии Ly5.1 (полученного из трансплантированных клеток).
Наилучший вариант осуществления изобретения
Изобретение описывается подробно со ссылкой на следующие примеры, которыми, тем не менее, изобретение не ограничивается.
Пример
Отбор клеток костного мозга
Клетки костного мозга отбирают из бедра и большеберцовой кости мыши линии C57BL/6J-Ly5.1 (Jackson Laboratories), суспендируют в сбалансированном солевом растворе Хенкса (Gibco-BRL) (далее обозначен как HBSS), который содержит 5% сыворотки плода коровы (FBS, Immunobiological Laboratory), и превращают в суспензию взвешенных клеток с помощью шприца емкостью 1 мл, снабженного иглой размера 22. Для удаления клеточных агрегатов суспензию фильтруют через нейлоновый фильтр с размером пор 40 мкм. Клетки отмывают центрифугированием в течение 5 мин со скоростью 1100 об/мин и вновь суспендируют в растворе HBSS, получая суспензию отдельных взвешенных клеток костного мозга.
Приготовление Lin-отрицательных или слабоположительных клеток
Используя StemSepTM (StemCell Technologies Inc.) для получения предшественников кроветворных клеток мыши, в соответствии с описанием к набору, получают дифференцировочный антиген-отирицательные или слабоположительные (Lin<слабоположительные) клетки. Сначала к суспензии отдельных клеток добавляют смесь биотинилированных антител против дифференцировочных антигентов и дают им возможность прореагировать при охлаждении льдом в течение 20 мин, затем промывают, используя HBSS, и центрифугируют в течение 5 мин со скоростью 1100 об/мин. Клетки вновь суспендируют в HBSS и для связывания биотинилированных антител добавляют к полученной суспензии смесь тетрамерных комплексов антител и дают им прореагировать при охлаждении льдом в течение 40 мин, затем добавляют магнитный коллоид и реакцию продолжают еще в течение 40 мин. Суспензию клеток пропускают через колонку MACS LS+(Miltenyi Biotec.), чтобы адсорбировать меченые клетки, и отбирают клетки, не содержащие метку. К части собранных клеток добавляют стрептавидин, меченный фикоэритрином (Pharmingen), и анализируют с помощью проточного цитофлуориметра EPICS-XL (Beckman Coulter). Как показано на фиг.1, собранные клетки представляют собой Lin<слабоположительные примитивные клеточные популяции.
Культура
Полученные указанным образом Lin<слабоположительные клетки высевают в 6-луночный микропланшет для выращивания клеточных культур (Iwaki) в количестве 4×104 клеток на лунку и культивируют в среде RPMI 1640 (Gibco-BRL), содержащей 5% FBS и 10 мкг/мл гентамицина (Sigma) в присутствии 5% CO2 при температуре 37°С. В качестве цитокина, который будет добавлен в культуру, используют SCF, IL-11, FLT и TPO, и их концентрация составляет 100 нг/мл. К полученной смеси добавляют M-CSF, с целью подтвердить производимый им эффект, и его конечная концентрация составляет 1, 10 или 100 нг/мл. Все использованные цитокины были получены от компании Pepro Tech. Inc.
Трансплантация выращенных клеток в мышь
После культивирования в течение 6 дней в присутствии цитокинов клетки отбирают из планшета с помощью пипетки. Клетки суспендируют в HBSS, к ним добавляют 106 свежих клеток костного мозга, полученных от мышей линии C57BL/6J-Ly5.2 (Nippon Clea), и центрифугируют в течение 5 мин со скоростью 1100 об/мин. Наконец, клетки суспендируют в 400 мкл 1 мМ раствора HBSS, содержащего HEPES, и трансплантируют через хвостовую вену мышам линии C57BL/6J-Ly5.2, получившим смертельную дозу радиации (800 рентген).
Определение лейкоцитов, продуцированных трансплантированными клетками
Через шесть месяцев после трансплантации из кончика хвоста каждой мыши отбирают около 25 мкл периферической крови через покрытый гепарином капилляр и немедленно суспендируют в 500 мкл фосфатного буфера (PBS(-); Gibco-BRL), содержащего 10 ед./мл гепарина. Супернатант удаляют центрифугированием в течение 5 мин со скоростью 1100 об/мин и клетки суспендируют в 500 мкл HBSS. Затем добавляют 10 мкл FITC-меченного антимышиного Ly5.1 (Pharmingen), который предварительно разбавляют в 10 раз с помощью PBS(-), и дают прореагировать в темноте при охлаждении льдом в течение 30 мин. Клетки отделяют центрифугированием в течение 5 мин со скоростью 1100 об/мин и затем суспендируют при комнатной температуре в 500 мкл раствора для гемолиза, содержащего 155 мМ хлорида аммония (NH4Cl), 10 мМ бикарбоната калия (KHCO3) и 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Обработку гемолизом повторяют дважды. Клетки промывают, используя HBSS, и отделяют центрифугированием в течение 5 мин со скоростью 1100 об/мин, суспендируют в HBSS, содержащем 2 мкг/мл 7-аминоактиномицина D, 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% азида натрия и 0,02% этилендиаминтетрауксусной кислоты, а затем анализируют с помощью проточного цитофлуориметра EPICS-XL.
Как показано на фиг.2, пропорция лейкоцитов, полученных из трансплантированных клеток, увеличилась в зависимости от концентрации M-CSF. Это может отражать возросшую в течение периода инкубации способность кроветворных стволовых клеток к самообновлению. Однако при бульших концентрациях M-CSF наблюдается супрессивное воздействие на способность к самообновлению, и становится понятным, что действие M-CSF на самообновление кроветворных стволовых клеток строго контролируется его концентрацией (фиг.2).
Полученные результаты оценивают количественно, как указано в таблице. Активность реконструкции костного мозга (единица репопуляции, RU), равная 106 клеток костного мозга, принята за единицу. На основе расчетной формулы, приведенной в таблице, сравнивают активности кроветворных стволовых клеток до и после культивирования с цитокинами по отношению к единице репопуляции (RU). Поскольку при прибавлении 10 нг/мл M-CSF единица репопуляции возрастает более чем в два раза, это экспериментально подтверждает, что M-CSF применим для размножения кроветворных стволовых клеток.
Если кроветворные стволовые клетки могут быть размножены в большей степени, как это показано выше, то может оказаться возможным сократить количество стволовых клеток, которое необходимо собрать для трансплантации кроветворных стволовых клеток. Благодаря наблюдаемому эффекту настоящее изобретение полезно с точки зрения обеспечения безопасности доноров.

Определение дифференцировочного антигена на лейкоцитах, полученных из трансплантированных клеток
Через шесть месяцев после трансплантации из кончика хвоста каждой мыши отбирают около 100 мкл периферической крови через покрытый гепарином капилляр и немедленно суспендируют в 2 мл фосфатного буфера (PBS(-); Gibco-BRL), содержащего 10 ед./мл гепарина, а затем разделяют на 4 части для окрашивания антигеном. Клетки промывают и суспендируют в 500 мкл HBSS, добавляют к ним биотинилированные антимышиные Mac-1, антимышиные Gr-1, антимышиные B220 или антимышиные CD3e (перечень линий мышей от компании Pharmingen), по 2 мкл на пробирку, в качестве антител против дифференцировочного антигена и реакцию антител проводят в течение 20 мин при охлаждении льдом. По окончании реакции клетки дважды промывают, используя HBSS, и вновь суспендируют в 500 мкл HBSS. Затем добавляют 0,5 мкл стрептавидина, меченного фикоэритрином (Pharmingen), и 1 мкл FITC-меченного антимышиного Ly5.1 (Pharmingen) и дают прореагировать в темноте при охлаждении льдом в течение 20 мин. Клетки отделяют центрифугированием в течение 5 мин со скоростью 1100 об/мин и затем суспендируют при комнатной температуре в 500 мкл раствора для гемолиза, содержащего 155 мМ хлорида аммония (NH4Cl), 10 мМ бикарбоната калия (KHCO3) и 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты. Обработку гемолизом повторяют дважды. Клетки промывают, используя HBSS, отделяют центрифугированием в течение 5 мин со скоростью 1100 об/мин, суспендируют в HBSS, содержащем 2 мкг/мл 7-аминоактиномицина D, 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% азида натрия и 0,02% этилендиаминтетрауксусной кислоты, и затем анализируют с помощью проточного цитофлуориметра EPICS-XL.
Как уже указывалось выше, кроветворные стволовые клетки обладают как способностью к самообновлению, так и способностью к дифференцировке в гемоциты всех типов. Если бы кроветворных стволовых клеток не было, гемоциты, полученные из трансплантированных клеток, исчезли бы приблизительно через 3 месяца после трансплантации клеток. Как показано на фиг.3, клетки, полученные из трансплантированных клеток (клеток, полученных из костного мозга мышей линии Ly5.1), которые экспрессируют дифференцировочный антиген миелоцитов и лимфоцитов, были обнаружены у подвергнутых трансплантации мышей через 6 месяцев после трансплантации. Это подтверждает тот факт, что трансплантированные популяции клеток содержали кроветворные стволовые клетки (фиг.3).
Хотя изобретение было детально описано со ссылкой на конкретный пример его осуществления, специалисту в данной области должно быть понятно, что в изобретение могут быть внесены различные изменения и модификации, которые не приводят к отступлению от сути или выходу за рамки настоящего изобретения.
Настоящая патентная заявка основана на заявке на патент Японии, поданной 30 октября 2001 года (номер заявки 2001-331940), содержание которой включено в данное описание в качестве ссылки.
Промышленное использование
Способ культивирования, способ размножения популяции кроветворных стволовых клеток, полученных указанными способами, набор для культивирования и агент для усиления размножения согласно изобретению позволяют осуществить размножение кроветворных стволовых клеток в условиях ex vivo и применимы для трансплантации кроветворных стволовых клеток. Далее, прямое введение агента для размножения позволяет провести трансплантацию клеток с уменьшенным количеством кроветворных стволовых клеток.

Формула изобретения
1. Способ размножения кроветворных стволовых клеток путем культивирования полученных из костного мозга Lin-отрицательных или слабоположительных клеток в присутствии макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF) в концентрации приблизительно от 5 до 20 нг/мл, вместе с композицией цитокинов, состоящей из SCF (фактор стволовых клеток), IL-11 (интерлейкин-11) и FLT (лиганд fms-подобная тирозинкиназа) или ТРО (тромбоцитопоэтин), при этом указанные цитокины используют в весовом соотношении 1-4 (M-CSF):20 (SCF):20 (IL-11):20 (FLT или ТРО).
2. Популяция кроветворных стволовых клеток из костного мозга, полученная способом по п.1, в качестве источника для трансплантации кроветворных стволовых клеток.
3. Композиция для усиления размножения кроветворных стволовых клеток в полученных из костного мозга Lin-отрицательных или слабоположительных клеток, содержащая цитокины M-CSF:SCF:IL-11:(FLT или ТРО) в весовом соотношении 1-4:20:20:20.
4. Набор для размножения кроветворных стволовых клеток в полученных из костного мозга Lin-отрицательных или слабоположительных клеток, содержащий цитокины M-CSF:SCF:IL-11:(FLT или ТРО) в весовом соотношении 1-4:20:20:20.