СПИСОК ПАТЕНТОВ С УПОМИНАНИЕМ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ
-
- 2017751 Способ получения гиалурона
- 2192150 БАД для профилактики йодной недостаточности
- 2112542 Препарат для лечения патологий соединительных тканей
- 2225206 Препарат для лечения рака молочной железы
- 2299733 Лечение опорно-двигательного аппарата
- 2299732 Способ лечения глаукомы
- 2299726 Противоинфекционная губная помада
- 2299725 Косметическое средство для ухода за кожей
- 2198878 Ароматическое соединение
- 2198702 Способ подготовки трофических язв к аутодермапластике
- 2198653 Вагинальные суппозитории
- 2197946 Композиция для ухода за волосами
- 2197923 Фармацевтическая композиция для лечения отеков роговицы
- 2298410 Биотрансплантант и способ лечения ревматических и аутоиммунных заболеваний
- 2197501 Фотоотверженный гель на основе сшитой гиалуроновой кислоты
- 2197228 Твердые лекарственные формы
- 2197222 Водная компазиция для ухода за волосами, лица и тела
- 2297425 Полипептиды
- 2297240 Композиция с гиалуроновой кислотой
- 2297230 Фармацевтическая компазиция с ксантоновой смолой
- 2196588 Глазные капли
- 2195955 Применение биологически активных веществ
- 2195926 Дерматологические композиции
- 2295954 Микрочастицы для доставки нуклеиновых кислот
- 2295951 Косметика для ухода за кожей лица и век
- 2195262 Фармакологическое средство на основе гиалуроновой кислоты
- 2194512 Способ профилактики и коррекции процесса старения кожи
- 2194478 Лечение экземы
- 2294716 Расширяемый стент
- 2194055 Сшитые сополимеры
- 2099350 Ассоциаты депротонированной гиалуроновой кислоты
- 2293557 Средство для лечения кожи и слизистых
- 2292878 Приготовление микроцастиц, содержащих метопропол
- 2292746 БАД
- 2192256 Защита кишечника
- 2191782 Получение модифицированной гиалуроновой кислоты
- 2292219 Паратиреоидный гормон человека
- 2291686 Микроцастицы
- 2191000 Косметическая маска
- 2290921 Фармацевтические и косметические средства против старения кожи
- 2290900 Модифицированный биоматериал для использования в офтальмологии
- 2290899 Получение биоматерьяла
- 2290397 Новые инданилиденовые соединения
- 2290186 Лечение сирингомиелии
- 2288702 Иррингационный раствор для офтальмологии
- 2288699 Гель для лечения стоматологических заболеваний
- 2188011 Активирующая остеогенез фармацевтическая композиция
- 2187327 Средство с антисептиком
- 2187325 Средство с радиопротекторным действием
- 2287330 Композиции миноксидила
- 2186786 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2186593 Лечение раненого процесса кожи
- 2286801 Очищение воды
- 2286781 Лечение ожогов пищевода у детей
- 2286764 Средство лечения воспалений полости рта
- 2185840 Лечение инфекционных заболеваний
- 2286151 Альфа-2-Дельта-Лиганда
- 2185149 Ранозаживляющий гель
- 2285527 Лечение ИЛ-6 заболеваний
- 2184448 Раствор хранения роговицы, включающий гиалуроновую кислоту
- 2090179 Крем для кожи
- 2183961 Способ лечения кожи
- 2284331 Соли алифотических аминов
- 2284187 Производные амида
- 2089191 Снизить внутрение давление
- 2283320 Получение гликозаминогликанов
- 2283129 Лечение опухолей
- 2283098 Косметические средства с Q
- 2182574 Ароматические соединения
- 2088257 Средство с гипохолестеролемическим действием
- 2088218 Состав для гигиенических салфеток
- 2088206 Способ получения препарата, создающего исскуственный загар
- 2282462 Противомикробные средства
- 2182008 Интровагинальная компазиция
- 2181999 Препарат с отсроченным высвобождением
- 2181998 Новые композиции липидов
- 2181995 Лечение болевого синдрома
- 2181295 Вирионная вакцина
- 2087144 Витамин Е
- 2379336 Способ стирки
- 2379052 Вакцинация
- 2180855Композиция в виде ионного комплекса
- 2379025 Противоинфекционный гель
- 2180825 Лечение травм роговицы
- 2281082 Способ коррекции эстетических и возрастных проблем кожи
- 2180576 Биоактивная добавка для косметических средств
- 2280459 Средство для изменения скорости роста или репродукции клеток
- 2179981 Соли переходного металла
- 2378010 Жидкие вакцины
- 2378008 Комбинированные вакцины
- 2378007 Анаболическое средство
- 2377973 Растительные экстракты
- 2280041 Способ получения водорастворимых комплексов гиалурил
- 2280038 Биополимеры
- 2323733 Йодный обмен
- 2377260 Гель
- 2178693 Противовирусное средство на основе гиалуроновой кислоты
- 2178692 Облегчающие зуд косметическое средство
- 2377022 Гемостатические спреи
- 2376982 Увлажняющая сыворотка для лица
- 2376974 Трансдермальный гель для лица
- 2362784 Гипо-и гиперацетилированные менингокковые капсульные сахариды
- 2177789 Устройство для доставки лекарства к шейке матки
- 2277954 Крем для лица омолаживающий
- 2376378 Способ получения метионина
- 2177332 Биоматериал для предотвращения послеоперационных спаек, с производной гиалуроновой кислотой
- 2177310 Способ получения таблеток
- 2376011 Средство для позвоночника
- 2277410 Косметическое средство
- 2323748 Медицинская повязка
- 2276998 Гидрогелевые композиции
- 2082416 Способ получения препарата с коллагенном из животного сырья
- 2375081 Адсорбирующее изделие
- 2375049 Охлаждающий пластырь
- 2346049 Способ получения гиалурона
- 2275913 Фармацевтические средства
- 2174985 Полисахарид с антиоксидантом
- 2373957 Носитель для лекарственных средств и биологически активных веществ
- 2373941 Способ коррекции возрастных и патологических изменений кожных покров
- 2174845 Композиции и способы доставки генетического материала
- 2174830 Средство для укрепления волос
- 2373769 Синбиотическая композиция
- 2274472 Лечение апорно-двигательного аппарата и болевых синдромов
- 2372929 Профилактическая композиция на основе веществ фенольной природы в липосомной форме
- 2173563 Способ нанесения на поверхность предметов покрытия на основе гиалуроновой кислоты, её производных и полусинтетических полимеров
- 2079304 фармацевтическая композиция, обладающая иммуносупрессорной и антимикробной активностью
- 2273645 Полипептид ожирения
- 2173154 Фракция кератансульфатолигосахаридов и содержащий ее фармацевтический препарат
- 2173136 Грязная мазь
- 2173128 Способ хирургического лечения центральных разрывов сечатки
- 2078561 Косметическое средство предотвращающее старение кожи
- 2172490 Способ прогнозирования воспалительных заболеваний молочной железы при эндопластике
- 2272645 Способ лечения ЦМВ-Инфекции у детей раннего возроста
- 2272636 Фармацевтическая композиция для местного лечения воспаления
- 2272635 Фармацевтически активная субстанция для офтальмологии
- 2272599 Биоматерьял для стабилизации прогрессирующей миопии "Коллаплант"
- 2172168 Средство для заживления ран на основе гиалуроновой кислоты
- 2371172 Фармацевтическая композиция для лечения нервной системы на основе стефаглабрина
- 2171470 Способ прогнозирования послеоперационной трансформации доброкачественных опухолей нервной системы
- 2077317 Состав для ванн
- 2271213 Комбинированные композиции, содержащие экстракты из растений и морских животных
- 2076872 Способ получения окрашенной гиалуроновой кислоты
- 2076671 Раствор для защиты роговицы
- 2370281 Конъюгаты гидроксиалкилкрахмал
- 2370275 Способ лечения (коррекции) косметических и возрастных дефектов кожи
- 2370258 Фармацевтическая композиция для парентальной доставки в форме лиофилизата
- 2270023 Способ экстракции и очистки протеогликана хрящего типа (варианты)
- 2369408 Гемостатическая композиция, включающая гиалуроновую кислоту
- 2369387 Фармацевтическая композиция для лечения нервной системы
- 2369379 Нетаблитированные жевательные формы для индивидуального введения
- 2169136 Производное коричной кислоты
- 70792 Медицинский аппликатор
- 20741717 Способ стабилизации аскорбиновой кислоты
- 2074712 Способ получения препарата, препятствующего преждевременной эякуляции
- 2367954 Способ прогнозирования развития кожной патологии у женщин с синдромом склерополикистозных яичников (СПКЯ)
- 2268075 Устройство для электрокинетической доставки
- 2268052 Средство для лечения воспалительных и дегенеративных заболеваний суставов
- 2167649 Способ получения твердой дисперсии умеренного водорастворимого лекарственного вещества
- 2167647 Гель для бритья
- 2073520 Лечение урологических инфекций
- 2367476 Биопластический материал
- 2367475 Мембрана для использования при направленной регенерации тканей
- 2367469 Фармацевтическая композиция на основе лизоамидазы
- 2367456 Фармацевтическая композиция обладающая антибактериальным и некролитическим действием
- 2367455 Фармацевтическая композиция обладающая некролитическим и антибактериальным действием
- 2267324 Применение антиадгезивных углеводов, препарат для уменьшения и /или блокирования адгезии патогенных веществ
- 2166934 Композиции включающие биологический агент
- 2166510 Псевдодипептиды
- 2366460 Композиции, имеющие высокую противовирусную и антибактериальную активность
- 2360901 Производные феноксиуксусной кислоты
- 2165749 Способ восстановления эндотелия роговицы
- 2265441 Способ укрепления склеры
- 2365382 Композиции и способы для регуляции развития сосудов
- 2070879 Соли гликозаминогликанов
- 2164914 Циклические и гетероциклические N - замещенные - иминогидроксамовые карбоновые кислоты
- 2264627 Хламидийный конъюктивит
- 2364399 Фармацевтический препарат на основе стефаглабрина
- 2264230 Препарат с замедленным высвобождением активного вещества
- 2363497 Фармацевтические композиции
- 2363496 Способ увеличения объема мягких тканей
- 2363473 Способ антифлогистической активации в эксперементе
- 2363461 Фармацевтический препарат на основе сигетина
- 2363459 Средства для введения в роговицу глаз для предотвращения офтальмологических нарушений
- 2363448 Фармацевтические композиции
- 2163123 Глазные капли
- 2162687 Усовершенствованнная лекарственная форма индуктора интерферана
- 2162343 Биосовместимый полимерный материал и способ его получения
- 2162327 Лечение рака
- 2067841 Способ получения ароматизатора
- 2161478 Способ консервированого лечения гонартроза
- 2361617 Вольфрамовые частицы в качестве рентгеноконтрастных веществ
- 2361552 Способы и устройства для дренирования жидкостей и понижения внутриглазного давления
- 2066996 Способ изготовления пленочного материала для офтальмохирургии
- 2361417 Корм с глюкозамином и экстрактом ивы для профилактики артроза у животных
- 2161002 Пищевой общеукрепляющий лечебно-профилактический продукт из хрящевой ткани акул
- 2360928 Комплексная матрица для медико-биологического применения
- 2160574 Способ лечения глаукомы
- 2360688 Способ лечения повреждений переферических нервов
- 2360670 Фармацевтическая композиция при климактерических расстройствах
- 2360646 Эндолюминальный протез
- 2260445 Способ усовершенствования транспортировки через легко прспосабливаемый полупроницаемый барьер
- 2260007 Производные амида
- 2359975 Способ получения модифицированных арабиногалактанов
- 2359974 Антигенные Пептиды
- 2159775 Псевдопептидный продукт
- 2259833 Фармацевтическая композиция для лечения роговицы глаза
- 2259816 Ранозаживляющее средство
- 2259815 Способ коррекции возрастных изменений, связанных с процессами старения кожи
- 2359706 Способ сохранения офтальмологических растворов
- 2359704 Антисептическое средство
- 2359662 Микрокапсулы
- 2159253 Катионные полимеры
- 2159111 Средство для ухода за кожей лица
- 2159105 Композиция для защиты кожи от опасных химических веществ Получение
- 2158593 Биосовместимый водный раствор
- 2358728 Способ лечения и предупреждения потери костной ткани
- 2258517 Способ хирургического лечения травмотических повреждений селезенки пленкой на основе гиалуроновой кислоты
- 2357968 Кристалические формы производной имидазола
- 2357957 Ингибиторы P38 и их применение
- 2157647 Пищевая добавка и ее получение
- 2357758 Препараты для чрескожной и чересслизистой добавки
- 2063244 Способ стабилизации растворов
- 2063140 Способ получения препарата для консервирования мяса
- 2157381 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2257198 Композиции микроцастиц
- 2356909 Белковый комплекс
- 2356570 Косметическая композиция
- 2256434 Способ закрытия перфорации барабанной перепонки
- 2356520 Способ лечения постконтузионного повреждения сечатки глаза
- 2156133 Гель
- 2255945 Полимерная композиция
- 2355761 Средства повторной дифференцировки
- 2061043 Способ повышения устойчивости урокиназы к нагреванию
- 2061005 Способ получения красителей для гистологических исследований
- 2355420 Зубная паста
- 2355385 Композиции пролонгированного действия с контролируемым высвобождением
- 2355240 Способ получения пищевого препарата хондропротекторного действия
- 2155057 Пихтово репейный бальзам
- 2354409 Способ производства высвобождающих лекарственные средчтва медицинских устройств
- 2254145 Раневое покрытие на основе коллаген-хитозанового комплекса
- 2254133 Лечение и профилактика ВИЧ-инфекции у человека
- 2253439 Фармацевтическая композиция для защиты и улучшения оптических свойств роговици при проведении эндовитреальных вмешательств
- 2253437 Способ омоложения кожи
- 2153352 Фармацевтическая композиция обладающая ранозаживляющим и противовоспалительным действием
- 2353354 Фармацевтический препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2252787 Способ получения искусственной матрицы кожи
- 2252767 Способ нормализации иммунобиохимического гомеостаза коров в предродовом и послеродовом периодах
- 2352583 Фармацевтическая композиция содержащая Fc-область иммуноглобулина в качестве носителя
- 2152403 Модифицированные полисахариды
- 2352356 Иммуногенная композиция
- 2352342 Исскусственный физиологический солевый раствор Способ его получения
- 2352330 Фармацевтический препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2352323 Фармацевтический препарат с модифицированным высвобождением
- 2152027 Способ подготовки ткани мозга для определения гликозаминогликанов
- 2251842 Интектицидный состав для борьбы с личинками оводов
- 2151580 Способ активации пролиферации эндотелия роговицы
- 2351648 Дифференцировка стромальных клеток, полученных из жировой ткани, в эндокринные клетки поджелудочной железы и их использование
- 2351595 N - гидроксиформамидные соединения в качестве ингибиторов металлопротеина
- 2251411 Косметическое средство в лиофилизированной фармацевтической форме
- 2251405 Косметика...ее композиции для косметических препаратов
- 2251367 Средство со сшитой гиалуроновой кислотой для наращивания тканей
- 2351359 Косметика для профилактики и лечения избыточной массы тела
- 2351322 Препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2351153 Диета при остеортрите собак
- 2350958 Способ определения групповой принадлежности синовальной жидкости
- 2350625 Производные гиалуроновой кислоты с пониженной биодеградируемостью
- 2150266 Крем после бритья
- 2350354 Фармацевтическое средство содержащие антагонист и фактор некроза
- 2350340 Способ коррекции процессов регенерации
- 2350309 Способ лечения избыточной массы тела с помощью рефлексотерапии
- 2250047 Профилактический продукт из хрящевой ткани гидробионтов
- 2249467 Медицинский матерьял и изделия на его основе
- 2055079 Способ получения препарата гиалуроновой кислоты
- 2349599 Биоадгезив мидии
- 2054903 Способ лечения коллагеноза у бычков на откорме
- 2249210 Способ прогнозирования предрасположенности к развитию и тяжести течения деформирующего остеоартроза коленного сустава у взрослых
- 2349339 Средство для соединительной ткани
- 2148988 Человеческий интерферона
- 2148399 Лечение атеросклероза
- 2148396 Способ определения активного вещества в дифильных мазевых основах
- 2148375 Способ диагностики близорукости
- 2348415 Способ противоспаечной терапии после хирургического вмешательства
- 2348400 Препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2348386 Способ непроникающего хирургического лечения первичной открытоугольной глаукомы
- 2248213 Лечение Галактозидальной А недостаточности
- 2347586 Микрофлюидизированные эмульсии типа "масло в воде" и вакцинные средства
- 2147243 Контрастное средство
- 2146526 Лечебный препарат дисбактериоза и урогенитальных инфекций
- 2146148 Терапевтическое применение фактора роста кератиноцитов (ФРК)
- 2146139 Способ повышения активности макрофагов и комбинации для его осуществления
- 2346277 Способ диагностики специфического синовита
- 2345793 Ультразвуковые контрастные вещества и их получение
- 2345782 Терапевтические комбинации на основе PORIFERA для лечения и предотвращения кожных заболеваний
- 2245131 Способ коррекции косметических недостатков кожи
- 2245130 Способ активации восстановительных процессов в коже
- 2144833 Хондроитиназа
- 2344809 Получение твердых дозированных форм с использованием сшитого нетермопластичного носителя
- 2244540 Косметический гель для ухода за кожей лица
- 2244536 Способ лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний тазобедренного сустава
- 2344167 Хмелевый экстракт
- 2143884 Агент регулирования дифференциации клеток кожи, культурная среда для клеток или тканей и способ регулирования дифференциации клеток кожи
- 2343932 Способ получения обладающих пониженной растворимостью в воде пленночных материалов
- 2343903 Устройство доставки лекарств для контролируемого введения препаратов
- 2048817 Способ получения материала для лечения ожогов и гнойно - некронических ран
- 2048803 Гидратантный крем
- 2242974 Средства и способы лечения воспалительных заболнваний
- 2142816 Способ получения антигерпетической вакцины
- 2342923 Средство для обработки рук с увлажняющим эффектом
- 2142781 Косметика для макияжа ресниц и бровей и агент ингирирующий рост микроорганизмов в косметических средствах
- 2242251 Трансплантируемые стенты с биоактивными покрытиями
- 2142257 Способ обработки глазных имплантантов и контакных линз
- 2342389 Мононатриевая соль
- 2342107 Способ устранения западения верхнего века при анофтальме
- 2141828 Средство, пролонгирующее эффективность чесночного порошка
- 2241489 Косметическое средство матриксных протеинов для залечивания ран
- 2241443 Средство для лечения герпеса
- 2241414 Способ получения протезов кровеносных сосудов
- 2341539 Гидрогель
- 2141324 Регулятор скорости воздействия препарата для инъекций
- 2141312 Косметическое средство для ухода за кожей лица
- 2341296 Средства и способы покрытия медицинских имплантантов
- 2341272 Средство для неспецифической иммунотерапии
- 2341266 Стенты с нанесенным покрытием содержащим N - (5-(4-(4-
- 2341257 Иммуномодулирующее средство
- 2341255 Средство для лечения климактерических расстройств
- 2240821 Способ лечения урологических инфекций
- 2140786 Способ лечения лишая
- 2140243 Способ хирургического лечения диабетической ретинопатии и отслоек сечатной оболочки
- 2240140 Медицинская многослойная повязка и изделия на ее основе
- 2240135 Культура клеток, содержащая клетки - предшественники остеонегеза, имплантант на ее основе и его использование для восстановления целостности кости
- 2240123 Экзогенные биологически активные коньюгирующие вещества
- 2139886 Фотоотвержаемое производное гликозаминогликата, сшитое производное гликозаминогликата и способы их получения, способ предотвращения клеточной и тканевой адгезии
- 2139729 Вакцина. Способ стимулирования иммунной системы
- 2339386 Средство обладающее радио - и химиозащитным действием
- 2339369 Лечение офтальмологических нарушений с использованием мочевины и ее производных
- 2139041 Гидратантный регенерирующий крем и способ его получения
- 2139039 Косметический суперкрем для ухода за кожей
- 2139017 Способ получения боисовместимого материала
- 2138503 Производные камптотецина, способы их получения, уникальное средство
- 2338556 Средство содержащие антагонист Р2Х - рецептора и нестероидное противоспалительное лекарственное средство
- 2338514 Косметическое средство для профилактики старения кожи
- 2138297 Медицинские устройства, подверженные вызываемому разложению
- 2138295 Покрытие для ран
- 2337906 Ингибиторы цитозольной фосфолипазы А2 Применение физиологически допустимого корпускулярного ферримагнитного или ферромагнитного материала. Способ формирования магнитометрического изображения
- 2137501 Устройство формирования изображения
- 2137477 Способ лечения заболеваний характеризующихся аутоиммунной агрессией
- 2137467 Крем для кожи лица и тела
- 2137449 Способ коррекции дефектов преломления в глазу млекопитающего
- 2137402 Пищевая Добавка БАД
- 2336899 Способ стимуляции миелопоэза
- 2336862 Способ получения раствора для лечения роговицы
- 2336830 Способ восстановления костных структур челюсти
- 2136696 Новый полипептид и средство против ВИЧ - Инфекции
- 2336092 Биоадгезивное средство, по существу свободное от воды
- 2336089 Средство и способ лечения заболеваний периодонтальных и пульпы
- 2336074 Средства и способы лечения заднего сегмента глаза
- 2235548 Ранозаживляющее средство
- 2135186 Способ лечения рефлекторных синдромов при остеохондрозе
- 2234945 Стабилизатор водного раствора и водосодержащего сырья
- 2334762 Растворимая ассоциативная карбоксиметилцеллюлоза
- 2234514 Макропористые хитозановые гранулы и способ их получения. Способ культивирования клеток
- 2133615 Средство для лечения неврологических заболеваний
- 2233164 Способ профилактики развития послеоперационных спаек брюшной полости
- 2133127 Неткатный материал, способ его получения и способ лечения
- 2333223 Альдегидные производные сиаловой кислоты и средства на их основе
- 2333007 Полипептидные вакцины для широкой защиты против рядов поколений менингококов с повышенной вирулентностью
- 2332985 Дозированные формы анестезирующих средств с длительным высвобождением для обезболивания
- 2132677 Косметическая маска
- 38603 Пленочный аппликатор
- 2232594 Средство содержащие ингибирующие остеокластогенез фактор и полисахарид
- 2332238 Средство для прокладок, раневых повязок и других изделий, контактирующих с кожей
- 2331668 Стромальные клетки, получение из жировой ткани, для заживления дефектов роговицы и внутриглазных дефектов и их использование
- 2331438 Альфа - 2 - Дельта Лигант для лечения симптомов нижних мочевыводящих путей
- 2331411Электропряденые аморфные фармоцевтические средства
- 2331367 Способ профилактики образования спаек и их рецидива
- 2130767 Масло в воде для получения косметических и дерматологических средств, способ косметической обработки
- 2230752 Поперечносшитые гиалуроновые кислоты и их применение в медицине
- 2230558 Способ восстановления и сохранения здоровья скмьи
- 2230550 Средства длительного высвобождения, способ их получения и применения
- 2230458 Поддержания здоровья суставов
- 2330290 Способ определения состояния метаболических процессов в ткани суставного хряща
- 2230073 Способ поперечного сшивания карбоксилированных полисахаридов
- 2329059 Способ лечения полипозного риносинусита
- 2329037 Комбинированная терапия для лечения иммуновоспалительных заболеваний
- 2128666 Гиалуроновая кислота и ее соли, способ очистки гиалуроновой кислоты, способ получения гиалуроновой кислоты. Фармацевтический препарат с гиалуроновой кислотой и средства с гиалуроновой кислотой используемые в офтальмологии
- 2328740 Способ экспресс - оценки действия зубных паст
- 2128502 Косметический гель
- 2328272 Суппозитории индуктора интерферона
- 2328268 Косметика содержащая амфолитный сополимер
- 2128057 Композиционная мембрана, способ ее получения и способ направленной регенерации тканей с ее применением
- 2128055 Средство замедленного освобождения и способ его получения
- 2128049 Свечи
- 2227743 Полипептидные варианты с повышенной гепаринсвязывающей способностью
- 2326893 Ковалентное и нековалентное сшивание гидрофильных полимеров
- 2326697 Новый перевязочный материал для быстрого заживления раневой поверхности кожи
- 2126264 Фармацевтическое средство с гиалуроновой кислотой
- 2326137 Способ получения содержащих альгинат пористых формованных изделий
- 2325902 Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани
- 2225195 Репелленты против насекомых
- 2325193 Сосудистый стент
- 2325184 Улучшенные везикулы наружной мембраны бактерий
- 2325153 Многокомпонентная фармацевтическая дозированная форма
- 2325152 Удерживаемая в желудке система регулируемой доставки лекарственного средства
- 2029955 Способ предоперационного определения помутнения задней капсулы хрусталика при экстракции катаракты
- 2324688 Производные бисбензизоселеназолонила с противоопухолевым, противовоспалительным и антитромбоническим действием
- 2323017 Устройство и способ контролируемый доставки активных веществ в кожу
- 2323011 Содержащий Коллаген I и Коллаген II способный к рассасыванию внеклеточный матрикс, предназначенный для реконструирования хряща
- 2322955 Способ изготовления имплантанта для пластики дефектов хрящевой ткани
- 2322454 Антитело против CCR5
- 2322263 Система продолжительного высвобождения растворимого лекарственного средства
- 2221561 Витамин Е и его сложные эфиры
- 2321634 Гены участвующие в метаболизме углерода и продуцировании энергии
- 2321597 Биоматерьял, способ его приготовления и его применение, медицинское средство, имплантант и вкладыш
- 2121340 Средство для похудения
- 2220737 Средство для улучшения состояния опорно-двигательного аппарата
- 2220729 Гель используемый в стоматологии
- 2320720 Способ культивирования фибропластов для заместительной терапии
- 2320378 Накожный аппликатор
- 2320369 Средства, содержащие Альфа - 2 - Дельта Лиганды и ингибиторы обратного захвата серотонина/норадреналина
- 2320362 Местные фармацевтические средства, содержащие проантоцианидины, для лечения дерматитов
- 2320322 Биоадгезивная доставка лекарств
- 2320318 Чувствительное к температуре изменяющие состояние средство гидрогеля
- 2025120 Способ получения препарата, содержащего Фактор /G-CSF/, стимулирующий рост колоний гранулоцитов
- 2319490 Средство для введения железа при лечении синдрома беспокойных ног
- 25995 Содержащее адгезив приспособление для фиксации зубных протезов в полости рта
- 2218907 Средство для ухода за кожей лица и веками
- 2318830 Способ получения модифицированного дерматансульфата
- 2118153 Косметика - туш для ресниц
- 2217441 Способ получения полимера
- 2317296 Изетионатная соль селективного ингибитора CDK4
- 2217171 Мембрана для использования при направленной регенерации тканей
- 2317095 Экстракты ECHINACEA ANGUSTIFOLIA
- 2216332 Препарат для лечения астроза
- 2216314 Крем - маска для обезвоженной кожи
- 2316333 Средство оздоровительно-восстановительных косметических панто-магниевых ванн
- 2021304 Способ получения биологически активного средства
- 2115662 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2315627 Впрыскиваемые имплантанты на керамической основе для заполнения морщин, кожных впадин, шрамов
- 2315623 Средство получаемое путем лиофилизации препарата
- 2114862 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2314791 Лечебно-Косметическое средство
- 2314791 Косметический крем-бальзам для ухода за кожей лица и шеи
- 2214600 Способ оценки эффективности лечения неврологических проявлений
- 2114602 Способ косметической обработки
- 2114587 Раствор для защиты роговицы
- 2214283 Имплантант для подкожного или внутрикожного введения
- 2313370 Медицинские протезы, имеющие улучшенную биологическую совместимость
- 2313356 Препарат для лечения демодекоза
- 2313338 Средство на основе этиллинолеата и триэтилцитрата для лечения себореи и угрей
- 2313328 Косметика содержащая тонкодисперный и пористый порошок
- 2212880 Способ получения препарата содержащего антибиотик, с замедленным высвобождением активного вещества
- 2312640 Способ лечения Блефароконьюнктивальной формы синдрома сухого глаза
- 2017751 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2312145 Гены CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM, кодирующие белки, участвующие в синтезе мембран и мембранном транспорте
- 2311458 Белки вызывающие измененную иммуногенную реакцию. Способ их получения и использования
- 2311183 Улучшенное разделение с использованием гталуроновой кислоты
- 2311177 Ингибиторы интегрина для лечения заболевания глаз
- 2300069 Косметическая маска
- 2211024 Уход за сухой кожей
- 2310440 Раствор для защиты роговицы от повреждений
- 2309684 Лечение межфалангового остеоатроза узелковой формы
- 2309406 Способ мониторинга фиброза печени у больных хроническим гепатитом с (ХГС)
- 2209088 Опосредованная рецепторами доставка генов с использованием векторов на основе бактериофагов
- 2308967 Уменьшение объема ткани
- 2308962 Средство для опорно-дигательного аппарата
- 2308957 Способ получения препарата для мезотерапии
- 2308954 Средство для лечения ран, содержащее плазму или сыворотку крови
- 2308951 Комплексный способ профилактики вагинальных дисбактериозов
- 2308937 Косметическая биологически активная добавка и косметический литофитокомплекс на ее основе
- 2208638 ДНК (варианты), способ получения белка
- 2207885 Способ подачи небольшого объема лечебного раствора к целевому месту
- 2207858 Лишенные побочных эффектов производные простагландинов для лечения глаукомы
- 2207845 Твердая лекарственная форма пролонгированного действия
- 2207844 Препарат для местного неинвазивного применения
- 2207841 Средства с антиферментативным действием
- 2306335 Стволовые клетки и решетки полученные из жировой ткани
- 2306140 Новые рецепторы для Helicobacter pylori и их применение
- 2205612 Способ эндотелизации IN VITRO протезов кровеносных сосудов
- 2105540 Депигментирующее средство
- 2304960 Косметическое средство для кожи
- 2304616 Гены участвующие в гомеостазе и адаптации
- 2204550Способ получения длинноцепочечной N-Ацилированной кислотой Аминокислот
- 2204415 Способ получения изображения
- 2204394 Средство для лечения грибковых инфекций, желудочных язв
- 2204366 Способ хирургического лечения глаукомы
- 2104034 Вагинальное увлажняющие средство, способ его получения
- 2303991 Биологически активная добавка
- 2303990 БАД
- 2303973 Адсорбирующее изделие
- 2203676 Средство обладающее иммунокорригирующим действием
- 2203672 Способ предупреждения беременности
- 2303635 Гены кодирующие белки резистентности и толерантности к стрессам
- 2303529 Способ фиксации альгинатного геля на твердой фазе, способ получения клеточного чипа на его основе
- 2203078 Способ лечения гнойных ран
- 2302412 Гидразоно-малонитрилы
- 2102400 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2202356 Способ стимуляции репаративных процессов длительно незаживающих ран и трофических язв
- 2202336 Средство для ухода за кожей
- 2302231 Глазные капли
- 2102082 Способ магнитометрического исследования тела человека или животного
- 2301814 Полиакриламидный гидрогель
- 2201765 Гибридные матричные имплантанты и эксплантанты
- 2301677 Биотрансплантант для лечения дегенеративных и трвматических заболеваний хрящевой ткани и способ его получения
- 2301676 Способ лечения ревматизма
- 2301674 Способ лечения больных с переломами нижней челюсти
- 2301661 Средство с регулируемым освобождением и способ его получения
- 2005488 Средство для лечения болезней соединительной ткани
- 2200001 Крем для кожи
|
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
|
Патент №2128666 |
(54) ФРАКЦИЯ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЛИ ЕЕ СОЛИ, СПОСОБ ОЧИСТКИ ЭТОЙ ФРАКЦИИ, СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ЭТОЙ ФРАКЦИИ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ И СРЕДСТВА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ОФТАЛЬМОЛОГИИ
(57) Реферат:
Высокочистая фракция гиалуроновой кислоты или ее соли со средним м.в. 750000-123000 Дальтон, содержанием белка не более 0,2% в расчете на альбумин и ультрафиолетовым поглощением при 257 нм и при 280 нм, не превышающим 1,0 A. U. , при измерении в 1% (вес./об.) водном растворе (другие характеристики фракции см. в п. 1 ф-лы изобретения) проявляет высокую эффективность при удалении катаракты и имплантации внутриглазных хрусталиков. 9 с. и 17 з.п. ф-лы, 11 табл. Настоящее изобретение касается нового способа получения высокочистых фракций гиалуроновой кислоты и ее солей. Кроме того, данное изобретение охватывает специфическую фракцию гиалуроновой кислоты и ее соли, в частности ее натриевую соль, получаемую указанным способом и имеющую средний молекулярный вес в определенном специфическом пределе. Гиалуроновая кислота (ГК) является типичным и очень важным представителем класса макромолекул, известных как гликозаминогликаны (мукополисахариды). ГК является биологическим полимером, который присутствует с идентичной молекулярной структурой во всех соединительных тканях организма позвоночных животных, где она играет структурную и биологическую роль в том отношении, что ее локальные концентрации строго коррелируются мышечным тонусом, трофическими явлениями и восстановлением ткани в случае ее повреждения. Обзорная работа по физиологической роли этих биологических веществ была опубликована в Phys. RW. (Comper W.D., Laurent T.C.) Физиологическая функция полисахаридов соединительной ткани. Phys. RW. 58 (I), 255 - 315, 1978 г). Физическая - химическая природа ГК является характерной для сахаридного биополимера (D-глюкороновая кислота и N-ацетилгликозамин), с поочередной полимеризацией, с образованием длинных неразветвленных молекулярных цепей, различающихся по молекулярному весу, достигающему максимального значения 8000000 Дальтон (Mayer K.,) Химическая структура гиалуроновой кислоты, Fed. Procud., 17, 1075, 1958; Laurent T.C. Химия и молекулярная биология межмолекулярной матрицы, 703 - 732, Academic Press., N.Y., 1970). Поведение данного биополимера в водном растворе таково, что гарантирует специфическое значение вязкости, называемое вязкоупругостью, которое является типичным для некоторых биологических жидкостей, таких как синовиальная жидкость, в которых ГК присутствует с концентрацией 0,12 - 0,24% Balazs E.A. и др. Гиалуроновая кислота и замена стекловидной и водой тканевой жидкости, Mod. Probl. Ophtal., 10, 3 - 21, 1972). Кроме того, обнаружено, что водная тканевая жидкость человеческого происхождения содержит ГК средней концентрации 1,14 мкг/г Laurent U.B.G.: Гиалуронат в водной тканевой жидкости человека. Arch Ophthalmol., 101, 129 - 130, 1983 ). Собрано достаточное количество опубликованного материала, который показывает, что локальное введение экзогенной ГК имеет явные терапевтические и защитные преимущества при различных паталогических состояния соединительных и эпителиальных тканей, такие как:
- регенерация поврежденной ткани при незаживающих кожных язвах;
- артрозная дегенерация соединительных тканей суставов;
- главная хирургия. Особенно ценным является способность ГК за счет ее вязкоупругих свойств покрывать ткани, подвергаемые риску повреждения при хирургических операциях. Как утверждают все хирурги, которые использовали ГК, присутствие вязкого слоя экзогенной ГК на тканях, наиболее сильноподвергаемых травматическим воздействиям, таких как роговица, оказывает защитное действие, которое в значительной мере способствует успешному осуществлению операции. Как защитное, так и облегчающее состояние влияние на заживление ткани при воздействии эндогенной HA на роговицу было показано как на экспериментальных животных /Miller D. и др.: Использование гиалуроната натрия при имплантации внутриглазных хрусталиков у кроликов Ophthalmic. Surgery, 8,(6), 58 - 61, 1977; Miller D. и др. Использование гиалуроната натрия при аутороговичной трансплантации у кроликов. Ophthalmic. Surgery, 11, (1), 19 - 21, 1980; Graue E.L. и др. Защитное действие гиалуроната натрия на эндотелий роговицы. Exp. Eye. Ris, 31, 119 - 127, 1980; Ozaki L, и др. Защитное действие покрытых Геалоном внутриглазных хрусталиков на эндотелий роговицы. Folia Ophthalmologica Japonica, 32, 1301 - 1305; 1981), так и на человеке / Norm M. Предоперационная защита роговицы и соединительной оболочки глаза, Acta Ophthalmologica 59, 587 - 594, 1981; Polaсk F.M. и др. Гиалуронат натрия (Геалон) в кератопластике и имплантации 10 L внутриглазных хрусталиков, Ophthalmologyа, 88, 425 - 431, 1981). Уже известны некоторые способы получения очищенной гиалуроновой кислоты и определенных фракций высокой степени чистоты, которые используются в терапии, например для указанных выше показаний. Молекулярные фракции цельных гиалуроновых кислот, полученных непосредственно путем экстракции органических веществ, например из куриных гребешков, имеют молекулярные веса, изменяющиеся в широких пределах, например примерно от 90 - 80% до 0,2% от молекулярного веса цельной гиалуроновой кислоты, предпочтительно в пределах примерно от 5 до 0,2%. Эти фракции могут быть получены из цельных кислот с использованием гидролизующих, или окисляющих, или ферментных химических реагентов или посредством физических процессов, например механического воздействия или обучения, и в связи с этим в одинаковых процедурах очистки образуются первичные экстракты СМ., например, статью Balazs и др. в " Cosmitics and Toilitries." Italien edition N 5/84, стр.8 - 17). Отделение и очистка полученных молекулярных фракций осуществляется известными способами. Так например, в патенте США N 4141973 описывается способ получения гиалуроновых кислот с молекулярным весом не менее 750000 Дальтон, которые могут использоваться в операциях на глаз ввиду их особой высокой степени чистоты и отсутствия воспалительных эффектов. Данный способ заключается в экстракции натриевой соли гиалуроновой кислоты из исходного материала, удалении кровяных остатков из используемых органов животных, извлечения белков из полученного экстракта, удалении вызывающих воспаление примесей, обработке продукта в водном растворе стерилизующим агентом и осаждении соли гиалуроновой кислоты из водного раствора органическим растворителем. Кровяные остатки удаляются этанолом, НА в форме ее натриевой соли (имеет форму, в которой она находится в исходных материалах) экстрагируется водой, удаление белков осуществляется путем обработки разбавленными кислотами и одновременно экстракцией гидролизованных частей хлороформом или посредством протеолитических ферментов, вредные вызывающие воспаление вещества удаляются путем экстракции хлороформом с величиной pH 6 - 7, и стерилизация осуществляется путем обработки цетилпиридинхлоридом. При таком способе единственно получаемая фракция гиалуроновой кислоты является фракцией, которая подробно описывается в данном патенте как фракция с молекулярным весом 1586000 Дальтон. В отношении химических, физических и биологических свойств данная молекулярная фракция гиалуроновой кислоты соответствует коммерческому продукту, известному под торговым названием "ГЕАЛОН". Были разработаны новые способы, такие как молекулярная ультрафильтрация. Этим способом очистки можно удалять те фракции ГК, которые имеют молекулярный вес выше или ниже пределов диапазона молекулярных размеров. Так например, в патенте EPO N 01238752, выданном 27.7.1990, описывается способ получения фракций гиалуроната натрия со средними значениями молекулярного веса от 250000 до 350000 Дальтон путем прямой экстракции из данного продукта органических веществ и последующего удаления белков посредством папаина, с двумя молекулярными ультрафильтрациями через мембраны с отсечкой молекулярной фракции 30000 Дальтон, то есть через мембраны, которые улавливают лишь те фракции, которые имеют молекулярные веса более 30000 Дальтон. Этот этап фракционирования очень важен для получения продукта свободного от вторичных воздействий воспалительного характера, поскольку фракции, ответственные за эти эффекты, это фракции с низкими молекулярными весами, например примерно 30000 Дальтон. После последующей молекулярной фильтрации с использованием мембран с пределом исключения 200000 (то есть мембран, улавливающих фракции с молекулярными весами более 200000 Дальтон) полученный отфильтрованный продукт представляет собой фракцию (называемую в данном патенте ГИАЛАСТИНОМ) со средним молекулярным весом в пределах от 50000 до 100000 Дальтон, в то время как часть, оставшаяся на мембране, представляет собой фракцию гиалуроната натрия, которая имеет средний молекулярный вес в пределах от 500000 до 730000 (фракция, называемая ГИАЛЕКТИНОМ). Настоящее изобретение охватывает другой способ получения фракции гиалуроновой кислоты, которая является высокочистой и имеет определенный диапазон значений молекулярного веса. Эта фракция находит интересное применение в глазной хирургии: данный продукт, безусловно, очень хорошо переносим, не вызывает воспалительных процессов и не вызывает послеоперационных осложнений. Кроме того, данный продукт имеет значительное преимущество в том, что может оставаться на месте после операции, не вызывая при этом послеоперационных осложнений, таких как слишком высокое глазное давление, снижая, таким образом, риск, связанный с его удалением, что практиковалось до сих пор. Эта новая фракция чистой гиалуроновой кислоты в форме ее натриевой соли, в последующем описании будет называться "ГК-1". Согласно настоящему изобретению можно усовершенствовать процедуры очистки цельных гиалуроновых кислот или их солей, особенно щелочных солей, таких как прежде всего натриевая соль, путем конверсии этих кислот или солей в четвертичные аммониевые соли данного типа. Такое солеобразование может осуществляться в любой из стадий процедуры очистки. Поскольку эти четвертичные аммониевые соли легко растворимы в некоторых органических растворителях, таких как апротонные растворители, особенно, например, N-метилпарролидон, они могут быть экстрагированы такими растворителями из водной фазы, обеспечивая таким путем специальную и дополнительную очистку наряду с примерами, описанными ранее, операция, которая ответственна за степень чистоты продуктов, получаемых в конце данной процедуры. Конверсия гиалуронового компонента в четвертичные аммониевые соли может осуществляться, например, путем обработки водного раствора натриевой соли, содержащего другие соли, такие как, особенно, NaCl, с использованием реактора или колонны, заключающей в себе макромолекулярный сульфоновый ионообменный агент в форме соли, образуемой с четвертичным аммониевым основанием, например, смолу DOWEX M-15, приготовленную в форме тетрабутиламмониевой соли, получаемой путем обработки сульфоновой смолы гидроокисями четвертичного аммония, например гидроокисью тетрабутиламмония. Аммониевая соль проходит в элюат и полностью элюируется ионообменным агентом с водой. Этот водный экстракт выпаривается досуха, и остаточный продукт, состоящий из аммониевой соли полисахарида, растворяется в одном из указанных выше растворителей, после чего нерастворимые твердые фракции фильтруются. Таким образом, способ, отвечающий данному изобретению, в его более общем аспекте, отличается очисткой гиалуроновой кислоты или одной из ее молекулярных фракций или одной из ее солей путем их конверсии в соответствующую четвертичную аммониевую соль с заместителями низшими (C1-6) алифатическими гидрокарбидами. Кроме того, способ, отвечающий данному изобретению, отличается вводом четвертичной аммониевой соли гиалуроновой кислоты или ее молекулярных фракций в органический растворитель, который способен растворять такие соли, и извлечением из фильтрованного раствора гиалуроновой кислоты или ее молекулярной фракции в форме металлической соли, и, при желании, дальнейшей очисткой полученной соли, уже известным способом. Таким образом, настоящее изобретение касается использования четвертичных аммониевых солей гиалуроновых кислот как в процедурах экстракции полисахарида из органов животного и из общих экстрактов, в которых очистка согласно данному изобретению может осуществляться в любой подходящей стадии данной процедуры, включая операции, в которых осуществляются фрагментация и разделение молекулярных фракций, так и в дальнейших процедурах обработки этих фракций и в последующих операциях очистки уже выделенных фракций, чистых или нечистых, новых или уже известных. Как говорилось выше, конверсия полисахарида гиалуроновой кислоты может осуществляться в любой нужной стадии очистки, и специалисты в данной области в состоянии сами выбрать, когда это нужно сделать в каждом конкретном случае в соответствии с критериями, диктуемыми определенной комбинацией различных известных этапов, которые были выбраны. Эти обычные известные этапы включают в основном и в общих аспектах следующие:
1) Экстракцию полисахарида (в основном и предпочтительно в форме натриевой соли) из органов животного, предварительно измельченных и гомогенизированных. Обычно это осуществляется с использованием органического растворителя, который может смешиваться с водой, например алифатического спирта или низшего алифатического кетона (C1-6), таких как этанол или ацетон. 2) Удаление беловых веществ путем экстракции подходящими растворителями или путем выпаривания водного раствора экстракта, полученного в 1) c протеалитическим ферментом, таким как папаин, пепсин, тригсин или преназа, в присутствии буферного раствора, например хлоргидрата цистеина - фосфата. 3) Диализ полученного согласно (1) или (2) экстракта. 4) Стерилизацию раствора, полученного в любой из предыдущих стадий, известными бактерицидами, например цетилпиридинхлоридом в растворе хлорида натрия. Эта операция обычно повторяется несколько раз. 5) Разделение фракций полисахарида гиалуроновой кислоты или их соответствующих солей с различными молекулярными весами, или, соответственно, удаление нежелаемых фракций, например с предельными значениями молекулярного веса, то есть значениями молекулярного веса, далекими от нужного диапазона молекулярного размера. Эта операция осуществляется предпочтительно путем молекулярной ультрафильтрации, например, уже известным приемом. б) Извлечение очищенной фракции или соответствующей соли (например, натриевой соли) из водного раствора путем осаждения подходящим органическим растворителем, например спиртом. Последовательность осуществления этих этапов, и, возможно, других, которые уже ранее были использованы или разработаны специалистами в данной области, может в значительной мере изменяться. Таким специфическим этапом согласно данному изобретению является этап солеобразования ионов четвертичного аммония, который может быть введен и успешно осуществлен с ожидаемым огромным техническим эффектом. Аммониевая соль полисахарида может быть непосредственно выделена из ионообменной смолы с помощью вышеупомянутых растворителей, которые способны растворять такие соли, как те, что указаны далее, но предпочтительнее соль аммония сначала экстрагируется водой и выпаривается досуха. Выделенная таким образом соль аммония вводится в вышеупомянутые растворители, и затем раствор фильтруется. Один из путей осуществления способа данного изобретения заключается в комбинации операций в указанном выше порядке между этапами 2) и 3). Не считая известных приемов очистки и специфического этапа, отвечающего данному изобретению, то есть конверсии металлической соли гиалуроновой кислоты в четвертичные аммониевые соли, согласно следующему аспекту данного изобретения можно использовать хелатообразующие агенты для ионов железа, предпочтительно в указанном выше этапе экстракции 1). Фактически известно, что ионы железа, всегда присутствующие в экстрактах исходной гиалуроновой кислоты, полученных из кровяных остатков используемых органов животных, ответственны за процессы дополимеризации полисахаридной молекулярной цепи. Удаление металлических ионов, как доказано, очень важно для получения фракции гиалуроновой кислоты с относительно высоким молекулярными весами, и это может быть достигнуто путем хелатеобразования. Осуществляя такой прием, можно не только получать гиалуроновые кислоты или их соли с возможно высокими молекулярными весами, но и получить особо чистые продукты, стойкие в водных растворах благодаря полному отсутствию указанных ионов железа. Таким образом, предпочтительным объектом настоящего изобретения является способ, отличающийся экстракцией органов животных, содержащих гиалуроновую кислоту и/или одну из ее солей, органическим растворителем, который может быть смешан с водой в присутствии хелатообразующих агентов для ионов железа, вводом предварительно высушенного осадка этих промывок в водном растворителе в присутствии протеолетического агента и соответствующего буфера и пропусканием этого раствора, предварительно освобожденного от твердых остатков, через ионообменный препарат, состоящий из макромолекулярной ионообменной смолы в форме одной из ее четвертичных аммониевых солей с радикалами низшего (С1-6) алифатического углеводорода. Элюат, экстрагированный из этой ионообменной смолы, затем высушивается и растворяется в органическом растворителе, способном растворять четвертичные аммониевые соли гиалуроновой кислоты и ее фракции. Аммониевая соль затем превращается в натриевую соль путем добавления водного раствора галогенида натрия, например хлорида или бромида натрия, в органический раствор. Полученный таким путем водный раствор натриевой соли затем экстрагируется органическими растворителями, которые не могут быть смешаны с водой, и при желании подвергается повторному диализу. Полученный раствор затем обрабатывается стерилизующим агентом, и при желании полученный раствор после стерилизации может подвергаться ультрамолекулярной фильтрации. Затем любые нежелаемые фракции полисахарида гиалуроновой кислоты удаляются, и желаемые фракции гиалуроната натрия извлекается уже известными приемами. Растворители, используемые согласно данному изобретению для растворения четвертичных аммониевых солей, представляют собой апротонные растворители, такие как N-алкилпирролидоны, в частности N-метилпирролидон, диалкилсульфоксиды, диалкилкарбоксиламиды, такие как низшие (C1-6) диалкилсульфоксиды, особенно диметилсульфоксиды, и низшие (C1-6) диалкиламиды низших (C1-6) алифатических кислот, такие как диметил- или диметилформадид- или диметил- или диацетилацетамид. Тетраалкиламмониевые основания, используемые для получения ионообменной смолы, и, следовательно, характерные аммониевые соли гиалуроновой кислоты согласно данному изобретению представляют собой основания, образуемые с низшими алифатическими радикалами, предпочтительно алкилами, содержащими 1 - 6 атомов углерода. Предпочтение отдается использованию смолы, образующей соль с тетрабутиламмонием. В указанных выше комбинациях, используемых для процедур экстракции, очистки и выделения гиалуроновых кислот или их молекулярных фракций и их солей, и в частности в указанной выше комбинации, которая является предпочтительной процедурой согласно данному изобретению, желательно использование указанных ниже агентов:
(a) для экстракции исходного материала из органов животного: этанол или ацетон. (b) в качестве хелатообразующего агента для ионов железа: 1,10 - фенантродин или диметиловое производство. (c) в качестве протеолитических агентов: те, что указаны выше. (d) в качестве растворителей для четвертичных аммониевых солей: N - метилпирролиден или диметилсульфоксид. (e) в качестве растворителя для очистки водного экстракта натриевой соли, полученной из органического раствора аммониевой соли: хлористой метилен, этилацетат. (f) в качестве стерилизующего агента: цетилпиридинхлорид в присутствии фосфатного буферного раствора. (g) в качестве органического растворителя для осаждения натриевой соли из очищенного водного раствора, возможно после ультрафильтрации этанол. В указанные выше процедуры возможно вносить изменения, которые могут способствовать успешному получению еще более чистого конечного продукта. Так например, использование стерилизующих агентов указанного выше типа, то есть четвертичных аммониевых солей с гетероциклическим кольцом, и содержащих длинноцепные алкилы (например цитил), например, цетилпиридинхлорида, может одновременно служить этапом очистки, поскольку ввод их в раствор гиалуроната натрия приводит к образованию соответствующей аммониевой соли с ионом гиалуроновой кислоты. Эти соли осаждаются в водном растворе, и такая обработка дает возможность получать, путем последовательных повторных осаждений промывок осадков и последующего растворения в растворе NaCl, раствор гиалуроната натрия, из которого должны выделяться ультрачистые продукты. Эти продукты особенно полезны в глазной хирургии. Молекулярная ультрафильтрация осуществляется уже известным приемом. Используются мембраны, например, улавливают фракции с более высокими молекулярными весами, например более 200000 Дальтон, и если желательно, отдельные фракции могут быть извлечены как из отфильтрованного продукта, так и из мембраны. Особенно интересный прием осуществления способа данного изобретения заключается в комбинации указанных выше операций очистки с молекулярной ультрафильтрацией, которая удаляет гиалуроновые фракции с низкими молекулярными весами. Такие фракции, как установлено, ответственны за инициирование воспалительных эффектов при их присутствии в продуктах терапевтического назначения, как это сообщается о фракциях, описанных в указанном выше патенте EPO N 0138572, выданном 25.7.1990. Следующим предпочтительным объектом данного изобретения является описанный выше способ, заключающий в себе специфическую комбинацию операций очистки, в котором как обязательный этап осуществляется молекулярная ультрафильтрация для удаления молекулярных фракций с низким молекулярным весом, особенно фракций с молекулярным весом менее, чем 30000. При осуществлении данной процедуры, или если говорить еще более точно, при осуществлении процесса, иллюстрированного на примерах 1 и 2, получается фракция гиалуроната натрия, которая является очень ценной с терапевтической точки зрения и которая, как уже говорилось вначале, носит название ГК-1. Она особенно интересна для использования в хирургии глаза. Гиалуроновые кислоты, описание в имеющейся литературе и рекомендованные для использования в операциях на глаза, не отвечают критериям абсолютного совершенства, особенно ввиду того, что они не могут оставаться на месте после хирургической операции, например после операции катаракты, ввиду присутствия как остатков или следов, вызывающих воспаление веществ, так и компонентов со слишком высоким молекулярным весом, а следовательно с чрезвычайно большой вязкостью. Кроме того, они могут вызвать, как указывалось ранее, нежелательное и опасное увеличение глазного давления. Экзогенная ГК, введенная в переднюю полость в процессе операции, не должна вызывать отрицательных эффектов на послеоперационное внутриглазное давление и не должна вызвать воспалительных явлений во внутриглазном окружении. Первый отрицательный эффект неоднократно описывался в литературе после использования очень высокомолекулярной ГК, имеющей чрезвычайно высокую вязкость Binkhorst C.D. Воспаление и внутриглазное давление после использования Геалона в хирургии, связанной с внутриглазными хрусталиками. Am Intra - Owlar implant. Soc. J. 6,(4), 342 - 343, 1980; Pape L. G. Внутрикапсуларный и внекапсуларный способ имплантации хрусталиков с Геаленом. Am. Intra - Owlar implant. Soc.J. 6,(4), 342 - 343, 1980; Passo M. S. и др. Внутриглазное давление после хирургии катаракты с использованием Геалона ARVO Abstracts 10, 10:45, 1981; Pereival P. и др. Практическое использование хрусталиков Boberg Ans и гиалуроната натрия (Гиалонида) Trans. Ophthal . Soc. UK, 102, (2): 294 - 297 , 1982; Mc Rac S. M. и др.: Влияние гиалуроната натрия, сульфата хондрантина и метилцеллюлозы и эндотелий роговицы и внутриглазное давление (Ann. J. Ophthalmol. 95, 332 - 341, 1983). Приведение практические работы позволили дать рекомендацию удалять данное вещество путем промывки физиологическим солевым раствором после операции. Berson и др. (Berson F.G. и др. Непроходимость водного оттока за счет гиалуроната натрия в энуклеированном человеческом глазе. Am. J. Ophthalmol 95, 668 - 672, 1983) изучали механизм данного нежелательного явления в энуклеированном человеческом глазе после операции, и они считают, что основной причиной этого явления является механическая закупорка дренажной системы в передней полости за счет чрезвычайно высокой вязкости вводимого вещества. Фракция гиалуроната натрия, которая описывается в патенте США N 4141973, Balazs и имеющая молекулярный вес 1586000 (см. колонку 13 этого патента) является веществом, которое в отношении его физико-химических и биологических свойств является наилучшим для глазных операций продуктом на современном рынке. Он известен под названием "Геалон" и не лишен указанных выше недостатков. В частности, его молекулярный вес чрезвычайно высок и, следовательно, он имеет нежелательно высокую вязкость для некоторых глазных операций. В самом деле, хотя осуществляемые в данном патенте испытания (для измерения противовоспалительного эффекта) дали хорошие результаты, геалон не может быть оставлен на поверхности послехирургического вмешательства, например после операции катаракты, так как он может вызвать послеоперационные осложнения, такие как повышение глазного давления. В патенте США 4920104 Dale P. De Vore (принадлежащем Mid. Chem. Products, Mc. Acton Mass) описан и заявлен вязкоупругий раствор гиалуроната натрия в физиологическом солевом растворе, который имеет кинематическую вязкость от 45000 до 64000 сСт и содержит гиалуронат натрия со среднемолекулярным весом в пределах от 1000000 до 2000000 Дальтон. Этот продукт также заявлен для использования в хирургических операциях на глазах, где он может быть использован более успешно, чем другие препараты, благодаря его мизерным послеоперационным побочным эффектам, особенно таким, как повышение послеоперационного глазного давления. Однако этот продукт также должен быть удален после хирургического вмешательства, как можно заметить из таблиц 2 и 3 в колонке 4 настоящего патента, тогда как таблица 1 показывает, что глазное давление поднимается после хирургического вмешательства, если продукт не удален с поверхности. В Европейском патенте N 0138572 описывается другая фракция гиалуроната натрия, предназначенная для использования в офтальмологии, которая имеет средний молекулярный вес, изменяющийся в пределах от 500000 до 730000 Дальтон (Гиалектин). Обычно она может использоваться для замены эндобулярных жидкостей, а также в операциях на глаза, таких как катаракта и введение глазных имплантантов. Однако имеется потребность в продуктах с более высокими вязкоупругими свойствами, которые в состоянии сохранять правильные интервалы в передней полости в ходе операции для противобаланса стекловидной реакции с тем, чтобы оказывалось эффективное защитное действие на эндоокулярную структуру без их удаления после операции. Как уже было сказано ранее, данные продукты с высокими молекулярными весами, описанные в имеющейся литературе и используемые в указанных операциях на глаза, должны всегда удаляться после операции. Достоинство настоящего изобретения заключается в том, что разработан оригинальный способ получения фракций гиалуроната натрия с относительно высоким молекулярным весом путем ввода хелатообразующих агентов для ионов железа в экстракционный раствор, что предотвращает, таким образом, дополимеризацию в фракции с низким молекулярным весом, свободные от тех примесей или фракций, которые не позволяют удалить данный продукт в организме. Эта новая фракция согласно данному изобретению, называемая фракцией ГК-1, обладает признаком новизны и является этапом к прогрессу в данной области науки. Фракция "ГК-1", согласно данному изобретению, получаемая по способу, описанному в примерах 1 и 2, имеет следующие свойства:
- Вязкость: Показатель статической вязкости в пределах от 14,5 до 21 дл/г, измеренный в вискозиметре Убеллоде при 25oC в 0,15 М NaCl с величиной pH 7,0. Эта вязкость соответствует молекулярному весу в пределах от 750000 до 1230000 Дальтон (предпочтительно в пределах от 925000 до 1230000 Дальтон). - Содержание белка: Содержание белка в расчете на альбумин не превышает 0,2% при измерении согласно испытанию Lowry/Lowry J. и др. Определение белка с использованием реагента фолинфенола. J.Biol. Chem. 193, 265 - 275, 1951). - Ультрафиолетовый спектр: Спектр ультрафиолетового поглощения, определяемый при 257 нм и 280 нм, не превышает 1,0 A.U. при измерении в водной растворе концентрацией 1% (вес./об.). - Динамическая вязкость: Динамическая вязкость 1%-ного вес./об. раствора в 0,15 М NaCl при величине pH 7,0, не превышает указанные ниже пределы при определенных скоростях сдвига. Используется ротационный вискозиметр, описанный, например, в публикации U.S. Pharmacopia XXXII ed., (911) стр.1619. Температура измерения составляет 20oC. Скорость сдвига - Динамическая вязкость (мПа  с при 20oC)
1 сек-1 - Не более чем 20000 мПа сек
10 сек-1 - Не более чем 2000 мПа с
100 сек-1 - Не более чем 1000 мПа с
350 сек-1 - Не более чем 500 мПа с
Сульфатированный мукополисахарид: Содержание его не превышает 0,07% в расчете на серу, при определении на приборе с индукционно связанной плазмой (I.C.P.) с использованием подходящего вещества в качестве стандарта. - Железо: Содержание железа не превышает 10 ч./млн. при определении методом спектрального атомного поглощения или методом I.C.P. - Стабильность: Стабильность буферных изотонических растворов (со значением pH физиологического раствора) фракции НА-1, подвергнутых естественному старению и тепловой стерилизации, измеренная путем определения показателя статической вязкости и выраженная как соответствующее понижение среднего молекулярного веса, не превышает указанных ниже предельных значений
- 97% от исходного значения (хранение при 25oC в течение 6 месяцев)
- 75% от исходного значения стерилизации при 118oC в течение 32 минут)
- 80% от исходного значения стерилизации при 121oC в течение 16 минут)
- 90% от исходного значения стерилизации при 124oC в течение 8 минут). Гиалуроновая фракции ГК-1 наилучшего качества согласно данному изобретению может быть получена при осуществлении указанных выше экспериментов. Внутриглазная переносимость фракции ГК-1 у обезьян
Данное испытание проводилось с целью оценки офтальмологической переносимости обезьян после инъекции ГК-1 в стекловидное тело глаза. 1. Испытуемый вид
Шесть молодых зрелых женских особей обезьян циномолгус (Макака фаспикулярис) использовались в этом испытании. Они обладали хорошим здоровьем и не имели выявленных повреждений глаз. Приматы были выбраны для данного испытания, потому что они считаются лучшим видом для изучения офтальмической переносимости вязкоупругого продукта, используемого в офтальмической хирургии. Были выбраны обезьяны циномолгус, потому что обезьяны Доурокоу лис, которые ранее использовались для изучения офтальмической переносимости, являются сейчас исчезающим видом и взяты под официальную защиту. 2. Экспериментальные группы и их обработка. Обозначение группы и уровни доз. Обезьяны обрабатывались единожды согласно таблице 1. 3. Приготовление и применение смеси. В день операции обезьяны были анестезированы гидрохлоридом кетамина, разбавленным пентабарбиталом натрия. Затем зрачки были расширены локальным вводом 1,0% тропикамида /Mydriacyl, alcon laboratories/. Роговица, коньюктива, придатки и передний сегмент исследовались с помощью лампощелевого биомикроскопа, а задний сегмент с помощью непрямого офтальмоскопа. Перипалцебральная оболочка была приготовлена для хирургического вмешательства путем использования двух промываний и промыванием напором струи 0,5% повидонйода и стерильного солевого раствора. Стерильная хирургическая простыня и векорасширитель были зафиксированы, а сфера стабилизирована с помощью небольших зубных щипцов. Острое и прямое рассечение использовалось для формирования коньюктивного лоскута, базирующегося на конечности, на расстоянии примерно 10 мм от верхней конечности и параллельно ей, и примерно 10 - 15 мм длиной. Рассечение было проведено через коньюктивную и тенонову капсулу к эписклере. Этот лоскут был приготовлен передним рассечением до конечности, экспонирующей нижележащую склеру, перекрывающую парс плана. На расстоянии примерно 5 - 6 мм от конечности был наложен интрасклеральный матрацный шов 7 - 0 Vicyrl /Ethicon/ со следом примерно 3 мм в сторону. Использовалась игла 25-го размера для аспирации 0,5 мл стекловидного тела (для двух животных оказалось возможным аспирация только 0,4 мл); это стекловидное тело было замещено равным объемом НА-12 (12 кг/мл) или стерильным солевым раствором. Матрацный шов был обезопасен от возможного просачивания и коньюктивный лоскут заменялся. Было произведено локальное применение антибиотической мази. Осуществляли определение стекловидных клеток в аспирированном стекловидном теле, используя гомоцитометр перед введением и примерно через 48 часов после него. 4. Наблюдение и регистрация. Примерно через 48 часов после хирургической операции животных анестезировали и осуществляли офтальмоскопическое исследование. Анестезию, делатацию и исследование осуществляли как описано выше. Исследование осуществляли слепым методом, независимо от того, осуществляли ли инъекцию в исследуемый глаз ГК-1 или контрольного материала. Глазные параметры оценивались как показано в стандартной ключевой классификации для глазной оценочной шкалы, приведенной ниже. Отек конъюктивы, инъекция и выделение; отек роговицы, гем и воспалительная гипермия:
0 = нормальные
+1 = слабые
+2 = умеренные
+3 = сильные или чрезвычайно сильные
Прозрачность стекловидного тела:
0 = прозрачное
1 = слабое помутнение - видимое глазное дно
2 = умеренное помутнение - едва видимое глазное дно
3 = помутнение - красный рефлекс глазного дна
4 = помутнение - серый рефлекс глазного дна
5 = глазное дно невидимо
Глаза препарировали для аспирации с использованием раствора повидонйода, как описано выше. Устанавливали глазное зеркало, и глазное яблоко стабилизировали небольшим зубным иглодержателем. Стекловидное тело (0,1 - 0,2 мл) аспирировалось непосредственно через конъюнктиву и склеру на расстоянии 6 мм от конечности в верхнем височном квадранте. Следили за тем, чтобы был исключен исходный участок хирургического воздействия. Вызывающие воспаление клетки рассчитывали с использованием гемацитометра. Снова наносилась локальная антибиотическая мазь. РЕЗУЛЬТАТЫ
Данные, представленные в таблице 2, показывают, что НА-1 очень хорошо переносима и не дает никакого глазного раздражения по сравнению с контрольным препаратом (физиологическим солевым раствором). Двое животных из группы, подвергнутой обработке солевым раствором, показали слабую водную инфильтрацию клеток и воспалительную гипермию. Контрольные значения лейкоцитов стекловидного тела составляли от 10 до 60 на мм3. Один глаз, подвергнутый инъекции НА-1, показан слабую водную инфильтрацию клеток и воспалительную гипермию. Число лейкоцитов стекловидного тела в подвергнутых испытанию глазах составляло от 0 до 30 на мм3. Таким образом, проведя сопоставления с контрольными экспериментами с физиологическим солевым раствором, можно сделать вывод, что ГК-1 очень хорошо переносима глазными тканями после внутривитреального вытеснения. Клиническое исследование с целью определения эффективности ГК-1 в сравнении с ГЕАЛОНОМ в хирургии для внекапсулярной катаракты с имплантацией внутриглазных хрусталиков задней полости. Описанные ниже эксперименты проводились с целью оценки эффективности и безопасности ГК-1 по сравнению с основными пользующимися спросом на рынке вязкоупругими материалами (ГЕАЛОНОМ) при удалении катаракты и имплантации внутриглазных хрусталиков на двух клинических исследованиях. В первом клиническом исследовании проводили испытание ГК-1 и ГЕАЛОНА в одинаковых экспериментальных условиях (в обоих случаях осуществлялась аспирация после хирургической операции). Во втором исследовании основное внимание уделялось безопасности ГК-1 в отношении повышения послеоперационного внутриглазного давления и расчету числа эндотелиальных клеток: во втором исследовании (в котором в отличие от первого оба вязкоупругих материала аспирировались после хирургического воздействия) ГК-1 не удалялась при завершении хирургической операции, в отличие от ГЕАЛОНА, который аспирировался из глаза. Моделью для проведения обоих исследований являлась оценка ГК-1 в сопоставлении с Геалоном при удалении внекапсулярной катаракты с имплантацией внутриглазных хрусталиков задней полости, осуществляемая из произвольно выбранной параллельной группы невидимым наблюдателем (наблюдения осуществлялись отдельными исследователями). В каждом исследовании могли быть выбраны пациенты с первичным диагнозом старческой катаракты в возрасте старше 18 лет. В частности:
в первом исследовании было отобрано 217 пациентов, и рандомизация осуществлялась с обработкой препаратами в соотношении примерно 3 : 1 (161 пациент с обработкой ГК-1 и 56 пациентов с обработкой Геалоном). Оба вязкоупругих материала аспирировались после хирургического воздействия. Период исследования охватывал предхирургическую оценку, процедуру операции и период, следующий непосредственно после операции. В данном исследовании измеряли глазное давление через 3 часа после операции и в последующих экспериментах через 1, 7 и 30 дней после операции. Во втором клиническом исследовании были отобраны и рандомизированы пациенты с обработкой препаратами ГК-1 и Геалоном в соотношении примерно 1 : 1, то есть 45 пациентов с обработкой ГК-1 и 46 пациентов с обработкой Геалоном. В данном исследовании НА-1 не аспирировались после хирургического воздействия, в отличие от Геалона, который аспирировался, как описано в первом исследовании. Период исследования (и соответственно материал исследования на ГК-1) был таким же, как описан выше в первом исследовании. В данном исследовании послеоперационное внутриглазное давление измеряли через 1, 3, 6 и 9 часов после операции (чаще, чем в первом исследовании) и последующие измерения осуществлялись через 1, 7, 30 и 90 дней после операции. В данном исследовании использовалась также зеркальная микроскопия начиная с отсчетного момента и в период по прошествии 90 дней после операции. Осуществлялись статистические анализы для оценки сопоставимости основной и обрабатываемой группы (альфа = 0,10) и безопасности и эффективности (альфа = 0,05). Для оценки данных осуществлялись точные испытания Фишера, t - испытания, описательные статистические анализы. Всего исследовалось 308 пациентов (см. табл. 3). Никаких существенных различий в отношении демографических, медицинских или катарактных характеристик между двумя обрабатываемыми группами в обоих исследованиях не обнаруживалось. Предоперационная подготовка и методы. Хирургическая операция осуществлялась исследователем стандартным хирургическим приемом удаления неосложненной старческой внекапсулярной катаракты с трансплантацией внутриглазных хрусталиков задней полости. Предоперационные (профилактические) лекарственные лечения, анестезия и другие способы лекарственного лечения осуществлялись стандартными приемами, но без использования глазных гипотензивных средств. Прединцизионное внутриглазное давление, насколько возможно, снижали посредством понизителя внутриглазного давления Хонана "Супер Пиики" или мануального ручного способа. Использовались вязкоупругие материалы (ГК-1 и Геалон), как будет описано ниже. Продукты удалялись после хирургической операции за исключением ГК-1, используемой во втором клиническом испытании; ГК-1 оставалась на месте. Как ГК-1, так и Геалон вводились в переднюю полость таким образом, чтобы облегчить хирургическую операцию и защитить глазные ткани, в частности:
1-е исследование:
- среднее количество используемой ГК-1 (0,56% при концентрации 12 мг/мл) было значительно больше количества используемого Геалона (0,439 мл при концентрации 10 мг/мл) даже если это различие составляло лишь 0,129 мл. 2-е исследование:
- не было никакого значительного различия между средними количествами используемых вязкоупругих материалов: в этом случае средние количества составляли 0,957 (для ГК-1) и 0,833 (для Геалона). Проводились нижеследующие испытания до, в процессе и после хирургической операции:
(a) Предшествующая хирургической операции оценка осуществлялась, например, с использованием следующих методов:
- определение остроты зрения (наилучшее проявление), применение тонометрии, метода пахиметрии (для определения толщины роговицы) и щелевого лампового микроскопа и проведение офтальмоскопического исследования,
- метод зеркальной микроскопии (лишь второе исследование): осуществляли расчет числа эндотелиальных клеток с использованием зеркального микроскопа в 10 выбранных точках роговицы. Каждое значение корректировали с использованием соответствующего коэффициента и в результате получали число клеток на квадратный миллиметр, и это значение усредняли, получая типичное значение числа клеток на квадратный миллиметр. (b) Послеоперационные оценки, такие как:
- определение внутриглазного давления (методом тонометрии) осуществлялись:
- через 3 часа после операции (1-е исследование);
- через 1 - 3 - 6 - 9 часов после операции (2-е исследование). Офтальмоскопические исследования и исследования с помощью щелевого лампового микроскопа, исследования методами пахиметрии, тонометрии, зеркальной микроскопии (лишь во втором исследовании на определение числа эндотелиальных клеток) и определение остроты зрения (при последующих исследованиях, осуществлялись:
- через 1 - 7 - 30 дней в первом исследовании;
- через 1 - 7 - 30 - 90 дней во втором исследовании. 1. Оперативная оценка - определение характеристик используемых вязкоупругих материалов. Вязкоупругие характеристики материалов оценивались по облегчению имплантации хрусталиков при использовании подвергаемых обработке групп в обоих клинических исследованиях в сопоставимых пропорциях. 2. Послеоперационные осложнения. 2a) Первое клиническое исследование. Как можно видеть из таблицы 4:
- Наибольший процент осложнений (у 7,9% всех пациентов) наблюдается в период между хирургической операцией и первым днем, а наименьший процент наблюдается через 7 и 30 дней. - В первый послеоперационный день число обработанных Геалоном пациентов, имеющих осложнения (14,3%), превышала в 2,5 раза число имеющих осложнения пациентов, обработанных ГК-1 (5,7%). Это различие статистически значительно (p = 0,079y при точном 2-хвостовом определении). Различие на 7 и 30 дни статистически незначительно (p > 0,6 при точном 2-хвостовом определении Фишера). Осложнения включают повышение внутриглазного давления до 30 мм рт.ст. и более 7/158 = 4,4% пациентов, обработанных ГК-1, 5/56 = 8,9% пациентов, обработанных Геалоном) и отек роговицы, воспаление радужки, конъюнктивит, гифему, отекшее пятно роговицы, истечение из ранки, циклитную оболочку и подконъюнктивальное кровотечение. Как видно из таблицы 5, в которой представлены данные тонометрии, полученные в предхирургический и послеоперационный периоды (через 3 часа и через 1 - 7 - 30 дней):
- Никакого значительного различия среднего внутриглазного давления между обрабатываемыми группами не было; однако у пациентов, обработанных Геалоном, повышение среднего внутриглазного давления как через 3 часа, так и через 1 день было больше, и стандартное отклонение внутриглазного давления у этих пациентов было значительно больше, чем у пациентов, обработанных ГК-1, через 1 день. Исследование методом щелевого лампового микроскопа пахиметрии /для определения толщины роговицы/ и офтальмоскопии не обнаружили различия между двумя группами. 2b) Второе клиническое исследование. - Послеоперационные осложнения у обработанных Геалоном пациентов (37,0%) несколько превышало послеоперационные осложнения у пациентов, обработанных ГК-1 (26,6%) (таблица 6). Осложнения включали повышение внутриглазного давления 5/42 = 11,9% пациентов, обработанных ГК-1, 11/46 = 23,9% пациентов, обработанных Геалоном), в случае гифемы, истечения из раны, кровотечение из стекловидного тела, помутнение задней капсулы, расщепление сосудистой оболочки глаза, атрофию радужной оболочки глаза и отекшее пятно роговицы. - Две обрабатываемые группы не отличались статистически ни в отношении средних значений внутриглазного давления, ни в отношении изменчивости внутриглазного давления как в начальный момент, так и в любой момент времени, начиная с 1 дня по 90-й день (таблица 7). Как обнаружено, в течение первых девяти часов после операции Геалон (удаленный из глаза) и ГК-1 (оставалась на месте) приводили к послеоперационному распределению внутриглазного давления, которое отличалось прежде всего в отношении стандартных отклонений. Обработанные Геалоном пациенты имели значительно более высокие стандартные отклонения и значительно более высокую среднюю величину через 1 час после операции, и обработанные ГК-1 пациенты имели более высокие, но лишь в ограниченной степени значительные стандартные отклонения через 6 и 9 часов после операции. Через 1 час после операции, 22,7% обработанных Геалоном пациентов и 10% обработанных ГК-1 пациентов имели внутриглазные давления 21 мм рт. ст. и более. Через 6 часов и через 9 часов после операции сравнимые количественные соотношения пациентов, обработанных ГК-1 (73,2% через 6 часов и через 9 часов после операции сравнимые количественные соотношения пациентов, обработанных ГК-1 (73,2% через 6 часов и 65,0% через 9 часов) и пациентов, обработанных Геалоном (68,2% через 6 часов и 71,4% через 9 часов) имели внутриглазное давление 21 мм рт.ст. и более. - Никакого различия между двумя исследуемыми группами в отношении наблюдений, изложенных в первом исследовании, не наблюдалось. Аналогичным образом зеркальная микроскопия (число эндотелиальных клеток) не показала значительных различий (таблица 8). Определение остроты зрения показало, что эффективность двух вязкоупругих материалов сопоставима, в частности:
В первом клиническом исследовании:
Не наблюдалось никакого значительного различия между количественным соотношением обработанных Геалоном (77,8% и обработанных ГК-1 (84,7) пациентов, у которых была достигнута острота зрения 20/40 на 30-й день. Во втором клиническом исследовании:
Не наблюдалось никакого значительного различия между количественным соотношением обработанных Геалоном пациентов (73,9%) и обработанных ГК-1 пациентов (71,4%), которые достигли остроты зрения 20/40 или более на 30-й день. На 90-й день эти соотношения были почти одинаковы. Результаты двух описанных здесь клинических исследований показывают значительную эффективность использования ГК-1 при удалении катаракты и имплантации внутриглазных хрусталиков. В частности, показано, что ГК-1 хорошо переносима. Фактически данный продукт вызывает меньше послеоперационных осложнений /примерно в 2,5 раза меньше), чем Геалон, испытываемый в тех же условиях, то есть с удалением данного препарата после операции/ как описано для первого клинического исследования). Из числа послеоперационных осложнений особое внимание следует обратить на повышение внутриглазного давления. Следует также отметить, что в обоих исследованиях послеоперационное течение болезни у пациентов, обработанных ГК-1 и Геалоном, отличалось в отношении внутриглазного давления. В первом исследовании, в котором ГК-1 и Геалон удалялись после операции, более высокая доля пациентов, обработанных Геалоном, обнаружила увеличение внутриглазного давления за пределы 21 мм рт.ст на первый день, по сравнению с долей пациентов, обработанных ГК-1. Во втором исследовании, когда ГК-1 не удаляли после операции, в отличие от Геалона, профили изменения послеоперационного внутриглазного давления для ГК-1 были сопоставимы. Таким образом, можно сделать вывод, что в некоторых отношениях эти два вязкоупругих продукта сопоставимы, хотя они отличаются в отношении послеоперационных осложнений: Геалон, удаляемый с глаза, приводит к более сильному повышению внутриглазного давления, чем ГК-1, удаляемый с глаза, и в случае, когда ГК-1 остается на месте после операции, профиль изменения внутриглазного давления сопоставим с профилем изменения давления в случае удаления Геалона после операции. Исходя из этих результатов следует, что наиболее важной особенностью является возможность сохранения на месте ввода ГК-1, и это не вызывает послеоперационных осложнений. Такая возможность сохранения на месте ГК-1 позволяет достигнуть следующие преимущества:
1. Упрощает хирургическую операцию, поскольку исключается этап удаления данного препарата после операции. 2. Уменьшает риск осложнений за счет подготовительных процедур/то есть в процессе аспирации/. Примерами такого риска является травма в результате хирургических операций и связанные с ней последствия. Настоящее изобретение касается также фармацевтических препаратов, содержащих в качестве активного ингредиента новую молекулярную фракцию гиалуроновой кислоты в форме натриевой соли, НА-1, особенно в форме солевых растворов с нейтральной величиной pH. Выбранная концентрация НА-1 такова, что достигается желаемая степень вязкости, например, достигается вязкость примерно 300 МПа сек / при 350 сек-1) и примерно 10000 сек (при 1 сек-1). Кроме того, настоящее изобретение касается использования новой фракции (ГК-1) гиалуроната натрия для глазной хирургии, особенно в операциях катаракты или имплантации хрусталиков. Настоящее изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами. Пример 1
Процедура получения фракции ГК-1 и определение ее характеристик
Куриные гребешки, либо свежие, либо замороженные (3000 г) тонко измельчаются в мясорубке и тщательно гомогенизируются в механическом гомогенизаторе. Полученная паста помещается в стеклянную емкость вместе с 10 объемами безводного ацетона или этанола, содержащего 0,1% (вес./об.) специфического хелатообразующего агента), образующего комплекс с железом). Примерами используемых хелатообразующих агентов являются 1,10-фенантролин или его диметиловые производные. Стеклянные емкости и специфические хелатообразующие агенты используются для того, чтобы исключить процесс деполимеризации натриевой соли гиалуроновой кислоты, который в противном случае может быть вызван ионами железа от стальных емкостей или кровяных остатков. Куриные гребешки обрабатываются до тех пор, пока не происходит полное извлечение ионов железа (контроль с помощью приборов: Спектр поглощения комплекса железо - хелатообразующий агент в фазе ацетона или этанола в 1-ом ячейках при длине волны, соответствующей максимальному поглощению 510 нм, в случае 1,10-фенантролина не более, чем 0,005 A.U.). Последующий процесс промывки осуществляется с использованием тех же объемов безводного ацетона (или этанола) с целью удаления каких-либо остаточных хелатообразующих агентов. Данные обработки осуществляются до тех пор, пока результаты последующего испытания "A" не станут отрицательными. - Испытание "A": Пять миллилитров ацетона (или этанола) выпаривается путем пропускания умеренного потока азота. Остаточный продукт выпаривания растворяется в 5 мл воды и измеряется спектр поглощения при длине волны, соответствующей максимальному поглощению хелатообразующего агента. Испытание считается отрицательным, когда спектр поглощения менее, чем 0,1 A.U. Конечный продукт реакции перемешивается в течение 6 часов со скоростью 50 об. /мин и отстаивается с целью отделения в течение 12 часов, после чего растворитель отсасывается и удаляется. Процесс этой экстракции повторяется до тех пор, пока влажность удаленного растворителя не достигнет правильного нужного значения (при определении методом Карла - Фишера). Полученный продукт затем центрифугируется и подвергается сушке в вакууме при подходящей температуре в течение 5 - 8 часов. Выход продукта в данном процессе в форме сухого порошка составляет 500 - 600 г. Затем 300 граммов сухого порошка подвергается процессу ферментного вываривания вместе с 0,2 граммами подходящего протеолитического агента (папаина, пепсина, трипсина или проназы) в буферной водной среде с фосфатным буфером с использованием такого количества хлоргидрата цистеина, чтобы отношение его к сухому порошку составляло от 20 : 0,01 до 20 : 1. Эта смесь затем перемешивается в течение 24 часов со скоростью 60 об./мин при постоянной температуре 60 - 65oC. Вся масса охлаждается до 25oC с добавлением 60 граммов Целита, и перемешивание продолжается дополнительно в течение часа. Полученная смесь фильтруется до тех пор, пока не получается прозрачная жидкость. Этот водный раствор, разбавленный до 2 мг/мл дистиллированной водой, вводится в колонку, наполненную макромолекулярной ионообменной смолой DOWEX M-15, полученной в форме тетрабутиламмония (TBA+) путем обработки гидратом окиси тетрабутиламмония. Раствор, алюированный из колонки, выпаривается и высушенный остаточный продукт выпаривания растворяется в подходящем объеме N-метилпирролидона (или диметилсульфоксида) до достижения концентрации 2 мг/мл. Полученный раствор фильтруется, охлаждается при 4oC и к нему добавляется равный объем воды. Осуществляются три последовательные промывки с использованием хлористого метилена, и каждый раз удаляется самая нижняя фаза. Затем верхняя фаза обрабатывается бромидом натрия (NaBr используется вместе с гиалуроновой кислотой в отношении 3 : 1) при температуре 4oC, водный раствор осаждается путем добавления трех объемов этанола, и осадок промывается несколько раз этанолом. Этот осадок солюбилизируется в воде, и полученный раствор подвергается диализу. Этот раствор доводится до 0,1 М путем добавления хлорида натрия, и температура доводится до 50oC. Вводится 45 граммов цетилпиридинхлорида, и одновременно этот продукт перемешивается со скоростью 60 г/мин. Эта смесь перемешивается в течение 60 мин, после чего вводится 50 г Целита. В процессе перемешивания температура продукта снижается до 25oC, и образующийся осадок извлекается путем центрифугирования. Полученный таким путем осадок суспензируется в 0,01 М растворе хлорида натрия (5 литров), содержащего 0,05 цетилпиридинхлорида. Он перемешивается еще в течение 60 минут при 50oC. Температура снижается до 25oC, и осадок центрифугируется. Затем процесс промывки повторяется три раза, и конечный осадок собирается в трехлитровых емкостях с 0,05 М раствором хлорида натрия, содержащим 0,05% цетилпиридинхлорид. Этот продукт перемешивается со скоростью 60 г/мин в течение 60 минут и поддерживается при постоянной температуре 25oC в течение двух часов. Всплывший слой удаляется путем центрифугирования. Данная процедура повторяется несколько раз с использованием 0,1 М раствора хлорида натрия, содержащего 0,05% цетилпиридинхлорида. Данная смесь центрифугируется, и всплывший слой удаляется. Осадок диспергируется в 0,30 М растворе хлорида натрия, содержащем 0,05% цетилпиридинхлорида в соотношении 3 : 1. Смесь перемешивается и осадок и прозрачная жидкость собираются. Экстракция осадка повторяется три раза, каждый раз с использованием 0,5 литра того же водного раствора. Осадок удаляется, и прозрачная жидкость собирается в одной емкости. При перемешивании температура этой жидкости повышается до 50oC. Эта жидкость затем доводится до 0,23 М посредством хлорида натрия. Вводится 1 грамм цетилпиридинхлорида, и перемешивание осуществляется в течение 12 часов. Смесь охлаждается до 25oC, затем фильтруется, сначала через набивку из Целита, а затем через фильтр (1 мкм). Полученный раствор подвергается молекулярной ультрафильтрации через мембрану с исключением молекул мол. весом 30000, осуществляется ультрафильтрация 3 исходных объемов с добавлением 0,33 М раствора хлорида натрия. Вводимый раствор хлорида натрия суспензируется, и объем жидкости снижается до четвертой части от ее первоначального объема. Концентрированный таким путем раствор осаждается при перемешивании (60 г/мин) при температуре 25oC тремя объемами этанола (95%). Осадок извлекается путем центрифугирования, и поверхностный слой удаляется. Этот осадок растворяется в 1 литре 0,1 М раствора хлорида натрия, и процедура осаждения повторяется с тремя объемами 95%-ного этанола. Этот осадок собирается и промывается, сначала 75% этанолом (три раза), затем абсолютным этанолом (три раза) и в третий раз абсолютным ацетоном (три раза). Полученный таким путем продукт (фракции ГК-1) имеет средний молекулярный вес в пределах от 750000 Дальтон до 1230000 Дальтон (предпочтительно в пределах от 925000 до 1230000). Выход гиалуроновой кислоты составляет 0,6% от исходной свежепрепарированной ткани. Конечный продукт, полученный как описано выше, имеет нижеследующие свойства:
- Молекулярный вес: 1000000 Дальтон. - Показатель предела вязкости: в пределах от 14,5 до 21 дл/г, при измерении при 25oC в 0,15 М NaCl при величине pH 7,0 с использованием вискозиметра Убелоде. Это соответствует среднему молекулярному весу в пределах от 750000 Дальтон до 1230000 Дальтон (предпочтительно в пределах от 925000 до 1230000 Дальтон). - Содержание белков: не превышает 0,2% в расчете на Альбумин, при определении методом анализа Лоури /Lowry J. и др: Определение белка с использованием реагента фолинфенола, J.Biol.Chem., 193, 265 - 275, 1951). - Спектр ультрафиолетового поглощения при 257 нм и при 280 нм не превышает 1,0 A.U. при измерении в 1%-ном (вес./об.) водном растворе. - Динамическая вязкость 1%-ного раствора (вес./об.) в 0,15 М NaCl при pH 7,0, не превышает нижеследующие предельные значения, определяемые по скоростям сдвига с использованием ротационного вискозиметра, того, что описан в U. S. Pharmocopia XXII ed. (911) стр.1619, при температуре 20oC
Скорость сдвига - Динамическая вязкость (мПа с при 20oC)
1 с-1 - Не более чем 20000 МПА с
10 с-1 - Не более чем 2000 мПА с
100 с-1 - Не более чем 1000 МПА с
350 с-1 - Не более чем 500 мПА с
- Содержание сульфатированного микополисахарида в расчете на серу не превышает 0,07% при определении на приборе с индукционно связанной плазмой /I.C.P./ с использованием подходящего стандартного вещества/
- Содержание железа не превышает 10 ч//млн/ при определении по спектру атомного поглощения или способом I.P.C. Проведено сопоставительное исследование для сравнения фракции ГК-1 и растворов натриевой соли гиалуроновой кислоты, полученных в промышленных масштабах, в отношении содержания в них железа. Полученные результаты (таблица 9) ясно показывают различные содержания железа: фракциz ГК-1 имеет намного более низкое содержание железа, чем другие продукты
Таблица 9
Содержание железа (ч./млн.) y ГК-1 в равнении с другими продуктами:
Железо, ч./млн.: ГК-1 <10; Образец A 130; Образец B 120; Образец C 40,
где образец A соответствует SODIEHIM (Партия 154);
образец B соответствует BIOCHEMO (Партия 542),
образец C соответствует BIOTECHNOLOGY GENERAL (Партия B-25). Содержание железа определяли примерно на 0,5 г вещества, которое прокаливалось в платиновом тигле, и остаточный продукт снова растворяли в HNO3 (0,1 М);
стабильность изотонических буферных растворов с pH фракции НА-1, равной pH физиологического раствора, естественного старения с термической стерилизацией, определяли по измерению показателя статической вязкости, и она была выражена как соответствующее снижения среднего молекулярного веса и не превышала следующих значений: 97% от исходной величины (хранение при 25oC в течение 6 месяцев); 75% от исходной величины (стерилизация при 118oC в течение 32 минут; 80% от исходной величины (стерилизация при 121oC в течение 16 минут) 90% от исходной величины (стерилизация при 124oC в течение 8 минут). Проводили сопоставительное исследование для сравнения изотонического буферного раствора со значением pH НА-1, равного pH физиологического раствора, с аналогичными растворами гиалуроновой кислоты, полученными в промышленных масштабах, с целью определения стабильности в следующих условиях:
- естественное старение (хранение в течение 6 месяцев при комнатной температуре)
- термическая стерилизация в различных условиях. Использовались материалы фармацевтического назначения и оборудование, которые уже проявили себя надежными для описанных целей. Использовались, в частности:
Бесцветные стеклянные пробирки со следующими характеристиками:
- стекло: боросиликатное стекло типа 1 (согласно Ph. Eur. lled)
- минимальная толщина стенки: 0,90 мм
- максимальная толщина стенки: 1,00 мм
- стопорные стержни изготовлены из галобутилового каучука со следующими характеристиками:
- тип эластомера: хлорбутил
- инертный наполнитель: каолин
- пигменты: диоксид титана и сажа
- вулканизирующий агент: оксид цинка
- характеристики выделения: согласно Ph. Eur. lled. YI.2.3.1. - алюминиевые перекрытия с защелкой
- вода для инъекции (согласно Ph. Eur. lled)
Использовались реагенты аналитической степени чистоты. Для стерилизации использован автоклав Fedеgari модели FOF5 суперспектра. Показатель статической вязкости определяли в вискозиметре типа Убеллоде с суспензионной средой при температуре 23oC в 0,15 М NaCl и величине pH 7,0. Соответствующий средний молекулярный вес вычислялся по формуле Марка-Хоуинка (H.Mark: J. Electrochemic, 40, 499, 1934; R.Houwink: J.Prakt. Chem., 157, 15, 1940). Значения среднего молекулярного веса были выражены как проценты от начальной величины для лучшей оценки тенденций к деполимеризации. Полученные результаты (таблицы 10 и 11) показывают, что НА-1 имеет большую стабильность (по крайней мере в два раза больше), чем стандартные образцы (см. таблицу 9), которые имеют значительно большее содержание железа, чем НА-1. В таблице:
- Образцы A, B и C те же самые, что использовались для определения содержания железа. - Обработке подвергались растворы примерно 10 кг/мл каждого продукта в 0,9% (вес./об.) раствора NaCl в 0,002 М фосфатном буфере с величиной pH 7,5;
а) естественное старение при 6-месячной выдержке при комнатной температуре (25oC) в темноте, с контролем через 3 месяца (см. таблицу 10). в) Стерилизация в автоклаве при следующих условиях:
- Т = 118oC в течение 32 минут (указано как Iс)
- Т = 121oC в течение 16 минут (указано как IIс)
- Т = 124oC в течение 8 минут (указано как IIIс)
с контролем в начале и в конце каждого состояния. Пример 2
Процедура получения фракции ГК-1 и определение ее характеристик
Куриные гребешки, как свежие, так и замороженные (3000 г), измельчаются в мясорубке и затем тщательно гомогенизируются в механическом гомогенизаторе. Полученная паста обрабатывается в стеклянной емкости четырьмя объемами 95%-ного этанола, содержащего 0,1% (вес./об.) специфического хелатообразующего (связывающего железо в комплекс) агента. Примерами хелатообразующих агентов являются 1,10-фенантролин (С.А. R.N. 66-71-7) или его диметиловые производные. Стеклянные емкости и специфические связывающие железо хелатообразующие агенты используются с целью устранения процесса деполимеризации натриевой соли гиалуроновой кислоты, которая в противном случае может быть вызвана ионами железа от стальных емкостей или кровяных остатков. Куриные гребешки обрабатываются до полного удаления ионов железа (контроль с помощью приборов: определение спектра поглощения комплекса железо-хелатообразующий агент в фазе ацетона или этанола в 1-см ячейках при длине волны, соответствующей максимальному поглощению (510 нм, в случае 1,10-фенантролина не более чем 0,005 A.U.). Дальнейший процесс промывки осуществляется с использованием таких же объемов безводного ацетона (или этанола) для удаления любого остаточного хелатообразующего агента. Данные обработки осуществляются до тех пор, пока результаты последующего испытания "A" не станут отрицательными. - Испытание "A": осуществляется выпаривание 5 мл фазы ацетона (или этанола) посредством умеренного потока азота. Остаточный продукт выпаривания растворяется в 5 мл воды и измеряется спектр поглощения при длине волны, соответствующей максимальному поглощению хелатообразующего агента. Испытание рассматривается как отрицательное, когда спектр поглощения менее чем 0,1 A.U. Конечный продукт реакции перемешивается в течение 6 часов со скоростью 50 об. /мин и отстаивается для разделения в течение 12 часов, после чего растворитель отсасывается и удаляется. Этот процесс экстракции повторяется до тех пор, пока удаленный растворитель не достигает нужного значения влажности (по методу Карла-Фишера). Затем полученный продукт центрифугируется и высушивается в вакууме при подходящей температуре в течение не менее чем 8 часов. Выход продукта в данном процессе в форме сухого порошка составляет 500 - 600 граммов. Затем 300 граммов этого сухого порошка подвергается ферментному вывариванию с 0,2 граммами подходящего протеолитического агента (папаина, пепсина, трипсина или проназы) в водной буферной среде с фосфатным буфером, с использованием хлоргидрата цистеина в таком количестве, чтобы отношение его к сухому порошку составляло от 20 : 0,01 до 20 : 1. Затем эта смесь перемешивается в течение 24 часов со скоростью 60 об./мин при постоянной температуре 60 - 65oC. По окончании реакции вводится 60 граммов Целита, и вся смесь перемешивается дополнительно в течение часа. Полученная смесь фильтруется до тех пор, пока не получается прозрачная жидкость. Вводится 45 граммов цетилпиридинхлорида с одновременным перемешиванием со скоростью 60 об./мин. Смесь перемешивается в течение 60 минут, после чего вводится 50 г Целита. Образуемый таким путем осадок извлекается путем центрифугирования, и он суспензируется в растворе 0,01 М NaCl (5 литров), содержащем 0,05% цетилпиридина. Перемешивание осуществляется в течение 60 минут при температуре 50oC, затем раствор доводится до температуры 25oC, и осадок центрифугируется. Процедура промывки повторяется три раза. Осадок извлекается и собирается в 3-литровых емкостях с 0,05 М раствором хлорида натрия, содержащим 0,5% цетилпиридинхлорида. Перемешивание осуществляется со скоростью 60 об./мин, в течение 60 минут, и затем раствор выдерживается при постоянной температуре 25oC в течение двух часов. Прозрачная всплывшая на поверхность фаза удаляется путем центрифугирования. Данная процедура повторяется дважды с растворами 0,1 М хлорида натрия, содержащего 0,5% цетилпиридинхлорида. Смесь центрифугируется, и верхняя (всплывшая) фаза удаляется. Осадок диспергируется в растворе 0,30 М хлорида натрия, содержащего 0,05% цетилпиридинхлорида (3 литра). Смесь перемешивается, и осадок и прозрачная жидкость извлекаются. Осадок экстрагируется второй раз с использованием 1,5 литра того же водного раствора. Прозрачные жидкости собираются в одну емкость и подвергаются молекулярной ультрафильтрации через мембраны с исключением молекул с мол. весом 30000 Дальтон, затем они концентрируются до объема, составляющего третью часть от исходного объема. Концентрированный раствор обрабатывается ионообменной макромолекулярной смолой Dowex M-15, полученной в форме тетрабутиламмония (ТВА) и перемешивается в течение ночи. В суспензию вводится подходящий объем N-метилпирролидона до тех пор, пока не будет достигнуто отношение NMP - H2O 70/30 (об./об.). Затем эта смесь фильтруется, и смола удаляется. Далее в раствор вводится подходящее количество NaCl и величина pH доводится до >7,5 посредством 1 М NaOH, и этот раствор двукратно промывается хлористым метиленом (CH2Cl2), каждый раз с удалением нижней фазы. Верхняя фаза осаждается при перемешивании со скоростью 60 об./мин при температуре 25oC с тремя объемами этанола (95%). Осадок извлекается путем центрифугирования, и верхняя фаза удаляется. Осадок извлекается и промывается, сначала 75%-ным этанолом, затем абсолютным этанолом и наконец ацетоном. Затем промытый продукт высушивается в вакууме в течение не менее чем 20 часов при температуре 25oC. Высушенный продукт солюбилизируется в воде с осуществлением принципа обратного осмоса, так чтобы получался раствор концентрацией >1 мг/мл. Вводится подходящее количество хлорида натрия так, чтобы получалась молярность от 0,1 до 0,4, и этот раствор подщелачивается 1 М NaOH. Затем этот раствор фильтруется через стерилизующие фильтры. Раствор осаждается тремя объемами этанола (95%) при перемешивании (60 об./мин) при температуре 25oC. Осадок выделяется центрифугированием и верхняя фаза удаляется. Осадок собирается и промывается сначала 75% этанолом, затем - абсолютным этанолом и наконец ацетоном. Промытый продукт сушится в вакууме в течение не менее 50 часов при температуре 25oC. Полученный таким образом продукт имеет молекулярный вес 1180000. Примеры фармацевтических препаратов
Представленные ниже примеры описывают, только лишь с целью иллюстраций, возможно фармацевтические препараты для терапевтического использования фракции ГК-1. Рецептура 1: 2-мл ампулы, каждая ампула содержит, мг:
натриевую соль гиалуроновой кислоты (ГК-1) - 24,0
одноосновный фосфат натрия 2H2O - 0,1
двухосновный фосфат натрия 12H2O - 1,2
хлорид натрия - 17,0
воду для инъекции до объема - 2,0
Рецептура 2: стерильные, готовые для наполнения 1,1-мл шприцы, каждый шприц содержит, мг:
натриевую соль гиалуроновой кислоты (ГК-1) - 20,0
хлорид натрия - 9,350
одноосновный фосфат натрия 2H2O - 0,055
двухосновный фосфат натрия 12H2O - 0,660
воду для инъекции до объема - 1,1
Рецептура 3: 0,2- мл емкость одной дозы, каждая емкость содержит, мг:
натриевую соль гиалуроновой кислоты (НА-1) - 400,0
хлорид натрия - 440,0
одноосновный фосфат натрия 2H2O - 5,0
двухосновный фосфат натрия 12H2O - 60,0
воду для инъекции до объема - 100,0
Рецептура 4: 0,2-мл емкость одной дозы, каждая емкость содержит, мг:
натриевую соль гиалуроновой кислоты (НА-1) - 200,0
хлорид натрия - 670,0
хлорид калия - 250,0
одноосновный фосфат натрия 2H2O - 5,0
двухосновный фосфат натрия 12H2O - 60,0
воду для инъекции до объема - 100,0
Рецептура 5: 5-мл склянки, каждая склянка содержит, мг:
натриевую соль гиалуроновой кислоты (НА-1) - 200,0
хлорид натрия - 670,0
хлорид калия - 250,0
одноосновный фосфат натрия 2H2O - 5,0
двухосновный фосфат натрия 12H2O - 60,0
этилртутьтиосалицилат натрия - 5,0
воду для инъекции до объема - 100,0
Описанное таким образом изобретение может осуществляться различными путями. Такие варианты его осуществления не следует рассматривать как отклонение от сферы действия и объема изобретения, и все эти модификации, как должно быть ясно для специалиста в данной области, охватываются приведенной ниже формулой изобретения.
Формула изобретения
1. Фракция гиалуроновой кислоты или ее соли со средним молекулярным весом в пределах 750000 - 1230000 Дальтон, содержанием белка, не превышающем 0,2% в расчете на альбумин, и ультрафиолетовым поглощением при 257 нм и при 280 нм, не превышающем 1,0 А.U., при измерении в 1%-ном (вес./об.) водном растворе, характеризующаяся следующими показателями:
а) показатель статической вязкости в пределах 14,5 - 21 дл/г при определении при 25oC в 0,15 М NaCl при рН 7,0 с использованием вискозиметра Убеллоде с суспензионной средой;
в) динамическая вязкость 1%-ного раствора (вес./об.) в 0,15 М NaCl при рН 7,0 не превышает указанных ниже предельных значений при определенных скоростях сдвига, с использованием ротационного вискозиметра при температуре 20oC;
Скорость сдвига - Динамическая вязкость (мПа с при 20oC)
1 с-1 - Не более чем 20000 мПа с
10 с-1 - Не более чем 2000 мПа с
100 с-1 - Не более чем 1000 мПа с
350 с-1 - Не более чем 500 мПа с
с) содержание сульфатированного мукополисахарида не превышает 0,07% в расчете на серу;
d) содержание железа не превышает 10 ч./млн;
е) стабильность изотонических буферных растворов с величиной рН данной фракции такой же, как у физиологического раствора, подвергнутых естественному старению и термически стерилизованных, определяемая по измерению показателя статической вязкости и выраженная как соответствующее снижение среднего молекулярного веса, не превышает следующих пределов:
97% начального значения (хранение при 25oC в течение 6 месяцев);
75% начального значения (стерилизации при 118oC в течение 32 мин);
80% начального значения (стерилизация при 121oC в течение 16 мин);
90% начального значения (стерилизация при 124oC в течение 8 мин). 2. Фракция гиалуроновой кислоты или ее соли по п.1, отличающаяся тем, что указанный средний молекулярный вес находится в пределах 925000 - 1230000. 3. Фракция гиалуроновой кислоты по п.1 или 2, отличающаяся тем, что указанная фракция свободна от молекул гиалуроновой кислоты, имеющих молекулярный вес 30000 или менее. 4. Способ очистки фракции гиалуроновой кислоты или ее соли по п.1, заключающийся в следующем:
а) превращение фракции гиалуроновой кислоты или ее соли в соответствующую четвертичную аммониевую соль путем абсорбции водного раствора указанной фракции соли гиалуроновой кислоты кислотным ионообменником, образующим соль с четвертичным аммониевым основанием;
в) растворение соответствующей четвертичной аммониевой соли в органическом растворителе, способном растворять такие аммониевые соли;
с) фильтрацию раствора и обработку его галогенидом натрия для извлечения гиалуроновой кислоты в форме натриевой соли. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанным ионообменником является Dowex 15 в форме четвертичного аммония. 6. Способ по любому из пп.4 и 5, отличающийся тем, что указанный органический растворитель, используемый для растворения четвертичной аммониевой соли гиалуроновой кислоты является апротонным органическим растворителем. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что апротонный растворитель представляет собой низший диалкилсульфоксид или диалкилкарбоксиламид. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанный апротонный растворитель представляет собой диметилсульфоксид или N-метилпирролидон. 9. Способ по любому из пп.4 - 8, отличающийся тем, что указанная соль гиалуроновой кислоты представляет собой натриевую соль. 10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют конверсию полученной аммониевой соли гиалуроновой кислоты в соответствующую натриевую соль путем ввода бромида натрия в раствор полученной аммониевой соли гиалуроновой кислоты в указанном органическом растворителе. 11. Способ получения фракции гиалуроновой кислоты или ее соли по п.1 экстракцией из органа животного, включающий а) экстракцию гиалуроновой кислоты из органа животного первым органическим растворителем в присутствии связывающего железо хелатообразующего агента с образованием содержащего гиалуроновую кислоту экстракта, который практически свободен от ионов железа; в) обработку экстракта, содержащего гиалуроновую кислоту, протеолитическим агентом; с) контактирование обработанного таким образом экстракта, содержащего гиалуроновую кислоту, с кислотным ионообменником в форме четвертичной аммониевой соли; d) растворение этого экстракта из ионообменника во втором органическом растворителе, который способен растворять четвертичную аммониевую соль гиалуроновой кислоты; е) обработку смеси стадии (d) галогенидом натрия для превращения четвертичной аммониевой соли гиалуроновой кислоты в соответствующую натриевую соль; f) выделение натриевой соли гиалуроновой кислоты; g) молекулярную фильтрацию с целью получения фракции натриевой соли гиалуроновой кислоты с молекулярным весом в пределах 750000 - 1230000 Дальтон. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что молекулярной фильтрации подвергают водный раствор натриевой соли гиалуроновой кислоты. 13. Способ по п.11, отличающийся тем, что молекулярной фильтрации подвергают экстракт, содержащий гиалуроновую кислоту. 14. Способ по п.12 или 13, отличающийся тем, что кислотным ионообменником является сульфоновая смола в форме четвертичной аммониевой соли. 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что указанная четвертичная аммониевая соль представляет собой тетраалкиламмониевую соль с алкильной группой, содержащей максимум 6 атомов углерода. 16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что тетраалкиламмониевая соль представляет собой тетрабутиламмониевую соль. 17. Способ по любому из пп.11 - 16, отличающийся тем, что первым органическим растворителем является этанол или ацетон, указанным связывающим железо хелатообразующим агентом является 1,10-фенантролин. 18. Способ по любому из пп.11 -16, отличающийся тем, что натриевую соль гиалуроновой кислоты обрабатывают стерилизующим агентом. 19. Способ по п.18, отличающийся тем, что стерилизующим агентом является цетилпиридинхлорид. 20. Способ по п.11 или 12, отличающийся тем, что натриевую соль гиалуроновой кислоты подвергают молекулярной фильтрации через мембрану с пределом исключения молекул с мол. весом 30 000 Дальтон. 21. Способ получения фракции гиалуроновой кислоты по п.1, заключающийся в том, что включает а) экстракцию органического вещества из куриных гребешков экстракционным растворителем, представляющим собой ацетон или этанол, и содержащим дополнительно фенантролин или его диметиловое производное для получения экстракта, практически свободного от ионов железа; в) обработку указанного экстракта протеолитическим агентом, выбранным из группы, включающей папаин, пепсин, трипсин, проназу и хлоргидрат цистеина; с) контактирование обработанного таким образом экстракта с колонкой, наполненной смолой на основе сульфоновой кислоты в форме тетрабутиламмониевой соли; d) элюирование колонки для получения раствора, содержащего тетрабутиламмониевую соль гиалуроновой кислоты; е) сушку раствора для получения остаточного продукта, состоящего из тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты; f) растворение указанного остаточного продукта в апротонном растворителе; g) фильтрацию раствора, полученного на стадии (f); h) промывку раствора, полученного на стадии (g) метиленхлоридом; i) обработку раствора, полученного на стадии (h) галогенидом натрия для получения гиалуроната натрия; j) осаждение полученного гиалуроната натрия; k) солюбилизацию осадка в воде и диализ данного раствора; l) обработку диализованного раствора для осаждения гиалуроната натрия; m) молекулярную фильтрацию осадка через мембрану с пределом исключения молекул с мол.весом 30 000 Дальтон. 22. Фракция гиалуроната натрия по п.1, полученная способом по п.21. 23. Фармацевтический препарат, используемый в глазной хирургии, отличающийся тем, что содержит эффективное количество фракции гиалуроновой кислоты или ее соли со средним молекулярным весом в пределах 750 000 - 1230000 Дальтон, содержанием белка, не превышающим 0,2% в расчете на альбумин, и ультрафиолетовым поглощением при 257 нм и при 280 нм, не превышающим 1,0 A. U., при измерении в 1%-ном (вес./об.) водном растворе, характеризующуюся следующими показателями:
а) показатель статической вязкости в пределах 14,5 - 21 дл/г при определении при 25oC в 0,15 М NaCl при pH 7,0 с использованием вискозиметра Убеллоде со суспензионной средой;
в) динамическая вязкость 1%-ного раствора (вес./об.) в 0,15 М NaCl при рН 7,0 не превышает указанных ниже предельных значений при определенных скоростях сдвига, с использованием ротационного вискозиметра при температуре 20oC;
Скорость сдвига - Динамическая вязкость (мПа с при 20oC)
1 с-1 - Не более чем 20000 мПа с
10- с-1 - Не более чем 2000 мПа с
100 с-1 - Не более чем 1000 мПа с
350 с-1 - Не более чем 500 мПа с
с) содержание сульфатированного мукополисахарида не превышает 0,07% в расчете на серу;
d) содержание железа не превышает 10 ч./млн.;
е) стабильность изотонических буферных растворов с величиной рН данной фракции такой же, как у физиологического раствора, подвергнутых естественному старению и термически стерилизованных, определяемая по измерению показателя статической вязкости и выраженная как соответствующее снижение среднего молекулярного веса, не превышает следующих пределов:
97% начального значения (хранение при 25oC в течение 6 месяцев);
75% начального значения (стерилизации при 118oC в течение 32 мин);
80% начального значения (стерилизация при 121oC в течение 16 мин);
90% начального значения (стерилизация при 124oC в течение 8 мин). 24. Средство, используемое в глазной хирургии, отличающееся тем, что оно представляет собой фракцию гиалуроновой кислоты по п.1. 25. Средство, используемое в офтальмологии, отличающееся тем, что оно представляет собой фракцию гиалуроновой кислоты по п.1. 26. Средство, используемое в операциях катаракты или при имплантации глазного хрусталика, отличающееся тем, что оно представляет собой фракцию гиалуроновой кислоты по п.1.
|
