РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ

(54) СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ И РЕШЕТКИ, ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ ЖИРОВОЙ ТКАНИ

(57) Реферат:

Настоящее изобретение относится к способу получения стволовых клеток, а также к применению эффлюента липосакции для выделения стволовых клеток. Эффлюент липосакции может быть получен, в частности, от человека. Способ предусматривает использование эффлюента, полученного методом липосакции, для выделения одной или нескольких стволовых клеток, по существу не содержащих адипоцитов и эритроцитов. Полученные стволовые клетки можно культивировать на протяжении десяти и более пассажей без дифференцировки. Стволовые клетки могут быть генетически модифицированы, а также клонально размножены. Клетки могут быть дифференцированы в один или несколько типов клеток-предшественников, таких как преадипоциты, премиоциты, преостеоциты. Использование изобретения позволит увеличить выход липопроизводных стволовых клеток. 2 н. и 24 з.п. ф-лы, 1 табл.

(56) (продолжение):

CLASS="b560m"adipose stromal cells. J. Soc. Gynecal. Investig., 1995, Jan-Feb., 2(1), p.45-50. US 5591625 A, 07.01.1997. US 5827740 A, 27.10.1998. US 5827735 A, 27.10.1998. SU 1739777 A1, 27.01.1995.

Предпосылки создания изобретения

В последнее время идентификация мезенхимальных стволовых клеток, полученных главным образом из костного мозга, привела к достижениям в области возобновления роста и дифференцировки тканей. Такие клетки представляют собой плюрипотентные клетки, находящиеся в костном мозге и надкостнице, и они способны к дифференцировке в различные мезенхимальные и соединительные ткани. Например, такие полученные из костного мозга стволовые клетки могут быть индуцированы для развития в миоциты такими агентами, как 5-азацитидин (Wakitani et al., Muscle Nerve, 18(12), 1417-26 (1995)). Предлагалось использование подобных клеток для восстановления тканей, таких как хрящевые, жировые и костные ткани (смотри, например, патенты США 5908784, 5906934, 5827740, 5827735), и они также могут применяться после генетической модификации (смотри, например, 5591625). Хотя идентификация таких клеток привела к достижениям в области возобновления роста и дифференцировки тканей, применение таких клеток тормозится некоторыми техническими препятствиями. Одним недостатком применения таких клеток является то, что они являются очень редкими (представляя лишь 1/2000000 клеток), что делает любой способ их получения и выделения трудным и дорогостоящим. Конечно, отбор костного мозга является всегда болезненным для донора. Более того, такие клетки трудно культивировать без индуцирования дифференцировки, если не используются специфически отсортированные сывороточные серии, что еще более увеличивает стоимость и трудоемкость применения подобных стволовых клеток. Таким образом, существует необходимость в более легко доступном источнике плюропотентных стволовых клеток, в частности, клеток, которые можно культивировать без дорогостоящего предварительного отбора компонентов культур.

Другие достижения в инженерии тканей показали, что клетки можно культивировать в пространственно определенных культурах с получением трехмерных структур. Пространственная определенность обычно достигается при использовании различных бесклеточных решеток или матриц для поддержания и направления роста и дифференцировки клеток. Хотя такая техника все еще находится на ранней стадии разработки, эксперименты на животных моделях показали, что можно использовать различные бесклеточные материалы решеток для регенерации целых тканей (смотри, например, Probst et al., BJU Int., 85(3), 362-7 (2000)). Подходящий материал решетки представляет собой секретированный межклеточный матриксный материал, выделенный из линий опухолевых клеток (например, выделенное межклеточное вещество ткани (матрикс) опухоли Engelbreth-Holm-Swarm - «матригель»). Данный материал содержит коллаген IV типа и факторы роста и предоставляет превосходный субстрат для роста клеток (смотри, например, Vukicevic et al., Exp. Cell Res., 202(1), 1-8 (1992)). Однако такой материал также облегчает злокачественное перерождение некоторых клеток (смотри, например, Fridman et al., Int.J.Cancer, 51(5), 740-44 (1992)) и не подходит для клинического применения. В то же время разработаны другие искусственные решетки, которые могут оказаться токсичными либо по отношению к клеткам, либо по отношению к пациентам при использовании in vivo. Соответственно сохраняется необходимость в материале решетки, подходящем для применения в качестве субстрата для культивирования и роста популяций клеток.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает получение из жировой ткани стволовых клеток и решетки. В одном аспекте настоящее изобретение относится к липопроизводным стволовым клеткам, по существу не содержащим адипоцитов и эритроцитов, и клональные популяции стволовых клеток соединительной ткани. Клетки можно использовать сами по себе или в биологически совместимых композициях для генерирования дифференцированных тканей и структур как in vivo, так и in vitro. Дополнительно клетки могут быть размножены и культивированы для продуцирования гормонов и для обеспечения кондиционированной культуральной среды для поддержки роста и размножения других клеточных популяций. В другом аспекте настоящее изобретение относится к липопроизводной решетке, по существу лишенной клеток, которая включает вещество внеклеточного матрикса жировой ткани. Решетка может быть использована в качестве субстрата для облегчения роста и дифференцировки клеток, как in vivo, так и in vitro, в зачаточных или даже зрелых тканях или структурах.

Принимая во внимание то, насколько распространена жировая ткань, клетки и решетки изобретения представляют собой готовый источник плюрипотентных стволовых клеток. Более того, поскольку клетки могут быть высеяны в культуру в недифференцированном состоянии в условиях культивирования, не требующих предварительного отбора серий сыворотки, клетки по изобретению можно поддерживать со значительно меньшими затратами, чем другие типы стволовых клеток. Данные и другие преимущества настоящего изобретения, а также дополнительные признаки изобретения будут очевидными из следующего подробного описания.

Подробное описание изобретения

В одном своем аспекте данное изобретение относится к липопроизводным стволовым клеткам. Предпочтительно стволовые клетки по существу не содержат клеток других типов (например, адипоцитов, эритроцитов, других стромальных клеток и т.д.) и вещества внеклеточного матрикса; более предпочтительно, стволовые клетки совсем не содержат таких других типов клеток и матриксного вещества. Предпочтительно клетки по изобретению получены из жировой ткани примата и более предпочтительно высшего примата (например, павиана или человекообразных обезьян). Обычно клетки изобретения будут получены из жировой ткани человека в соответствии со способами, такими как приведены в данном описании.

Хотя клетки изобретения могут представлять собой любой тип стволовых клеток, для применения в инженерии тканей желательно, чтобы клетка была мезодермального происхождения. Обычно такие клетки при выделении сохраняют два или более мезодермальных или мезенхимальных фенотипа развития (т.е. они являются плюропотентными). В частности, такие клетки обычно обладают способностью развиваться в мезодермальные ткани, такие как зрелая жировая ткань, кость, различные ткани сердца (например, перикард, эпикард, эпимиокард, миокард, ткань клапанов и т.д.), соединительная ткань кожи, ткани сосудистой системы (например, форменные элементы крови, эндокард, сосудистый эпителий и т.д.), мышечные ткани (включая скелетные мышцы, сердечную мышцу, гладкую мускулатуру и т.д.), ткани мочеполового тракта (например, почка, пронефрос, протоки первичной и вторичной почки, дивертикул вторичной почки, мочеточники, почечная лоханка, прямые почечные канальцы, эпителий женских репродуктивных органов (в частности, фаллопиевых труб, матки и влагалища), ткани грудной и брюшной полостей, внутренние органы, мезодермальные железистые ткани (например, ткань коры надпочечников) и стромальные ткани (например, костный мозг). Конечно, поскольку клетки могут сохранять способность развиваться в зрелые клетки, также можно реализовать их фенотипический потенциал развития путем дифференцировки в подходящую клетку-предшественник (например, преадипоцит, премиоцит, преостеоцит и т.д.). Также в зависимости от условий культивирования клетки также могут проявлять такие фенотипы развития, как эмбриональный, плодный, кроветворный, неврогенный или нейроглиагенный фенотипы развития. В данном смысле клетки изобретения могут обладать двумя или более фенотипами развития, такими как адипогенный, хондрогенный, кардиогенный, дерматогенный, кроветворный, гемангиогенный, миогенный, нефрогенный, неврогенный, нейроглиагенный, урогенитогенный, остеогенный, перикардиогенный, перитонеогенный, плеврогенный, спланхогенный и стромальный фенотипы развития. Хотя такие клетки могут сохранять два или более из данных фенотипов развития, предпочтительно такие клетки обладают тремя или более такими фенотипами развития (например, четырьмя или более мезодермальными или мезенхимальными фенотипами развития), и некоторые типы клеток изобретения обладают потенциалом приобретать любой мезодермальный фенотип во время процесса дифференцировки.

Стволовые клетки изобретения могут быть получены из жировой ткани любым подходящим способом. Первая стадия в любом таком способе требует выделения жировой ткани из животного источника. Животное может быть живым или мертвым, настолько долго, насколько являются жизнеспособными жировые стромальные клетки. Обычно жировые стромальные клетки человека получают от живых доноров с использованием хорошо известных методик, таких как хирургическая или отсасывающая липэктомия. Действительно, поскольку процедуры липосакции являются обычными, липосакционный эффлюент представляет собой особенно предпочтительный источник, из которого могут быть получены клетки изобретения.

Тем не менее полученную жировую ткань обрабатывают для отделения стволовых клеток от остатка материала. В соответствии с одной методикой жировую ткань промывают физиологически совместимым солевым раствором (например, фосфано-буферным раствором (PBS)), а затем энергично перемешивают и оставляют осаждаться; это стадия, на которой удаляют рыхлое вещество (например, поврежденную ткань, кровь, эритроциты и т.д.) из жировой ткани. Таким образом стадии промывки и осаждения обычно повторяют до тех пор, пока супернатант не становится относительно прозрачным от дебриса.

Оставшиеся клетки обычно будут присутствовать в виде агглюмератов разного размера, и методика осуществляется путем стадий калибрования для разрушения больших структур с минимальным повреждением самих клеток. Один из способов достижения подобной цели заключается в обработке промытых образований клеток ферментом, который ослабляет или разрушает связи между клетками (например, коллагеназа, диспаза, трипсин и т.д.). Количество и продолжительность такой ферментативной обработки будет изменяться в зависимости от используемых условий, но применение подобных ферментов обычно известно в данной области. Альтернативно или в сочетании с такой ферментативной обработкой агглюмераты клеток могут быть разрушены с использованием других способов обработки, таких как механическое перемешивание, ультразвуковое воздействие, термическая обработка и т.д. Если разрушение достигается ферментативными способами, желательно нейтрализовать фермент после приемлемого периода времени для минимизации отрицательного воздействия на клетки.

Стадия разрушения обычно дает взвесь или суспензию агрегированных клеток (обычно липосом) и жидкой фракции, содержащей обычно свободные стромальные клетки (например, эритроциты, гладкомышечные клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты и стволовые клетки). Следующая стадия в способе отделения заключается в отделении агрегированных клеток от стромальных клеток. Это может быть осуществлено центрифугированием, которое собирает стромальные клетки в осадок, покрытый супернатантом. Супернатант затем может быть отброшен, а осадок суспендирован в физиологически совместимой жидкости. Более того, суспендированные клетки обычно включают эритроциты, и в большинстве случаев желательно их лизировать. Способы селективного лизирования эритроцитов известны в данной области, и можно использовать любую подходящую процедуру (например инкубирование в гипер- или гипотонической среде). Конечно, если эритроциты лизированы, оставшиеся клетки затем следует отделить от лизата, например, фильтрованием или центрифугированием. Конечно, вне зависимости от того лизированы ли эритроциты, суспендированные клетки могут быть промыты, повторно центрифугированы и повторно суспендированы один или последовательно несколько раз для достижения большей чистоты. Альтернативно, клетки могут быть отделены с использованием клеточного сортера или на основании размера клеток и зернистости, поскольку стволовые клетки являются относительно маленькими и незернистыми. Экспрессия теломеразы также может служить в качестве клеточно-специфического маркера стволовых клеток. Они также могут быть отделены иммунногистохимически, например, пэннингом или с использованием магнитных шариков. При желании, любая стадия или способ выделения клеток изобретения могут осуществляться вручную. Альтернативно способ выделения таких клеток может быть облегчен с помощью подходящего устройства, многие из которых известны в данной области (смотри, например, патент США 5786207).

После конечного выделения и повторного суспендирования клетки можно культивировать и, при желании, проанализировать для определения числа и жизнеспособности с целью оценки выхода. При желании, клетки можно культивировать без дифференцировки с использованием стандартной культуральной среды (например, DMEM, обычно дополненная 5-15% (например, 10%) сыворотки (например, околоплодной телячьей сыворотки, лошадиной сыворотки и т.д.). Предпочтительно клетки можно высевать по крайней мере пять раз в такой среде без дифференцировки, хотя все еще сохраняя их фенотип развития, и более предпочтительно, клетки могут быть высеяны по крайней мере 10 раз (например, по крайней мере 15 раз или даже по крайней мере 20 раз) без потери фенотипа развития. Таким образом, культивирование клеток настоящего изобретения без индуцирования дифференцировки можно осуществлять в отсутствие специально отобранных серий сыворотки, что является обычным случаем для мезенхимальных стволовых клеток (например, полученных из костного мозга). Способы измерения жизнеспособности и выхода известны в данной области (например, исключение трипанового синего).

После выделения стволовые клетки дополнительно разделяют с помощью фенотипической идентификации для идентификации тех клеток, которые имеют два или более из вышеуказанных фенотипов развития. Обычно стромальные клетки высевают на чашки с желаемой плотностью, как, например, примерно от 100 клеток/см2 до примерно 100000 клеток/см2 (как, например, от примерно 500 клеток/см2 до примерно 50000 клеток/см2, или, более конкретно, от примерно 1000 клеток/см2 до примерно 20000 клеток/см2). При высевании с более низкой плотностью (например, примерно 300 клеток/см2) клетки можно более легко клонально выделять. Например, через несколько дней высеянные при такой плотности клетки будут пролиферированы в популяцию.

Такие клетки и популяции могут быть клонально размножены, при желании, с использованием подходящего способа клонирования популяции клеток. Например, пролиферированная популяция клеток может быть физически собрана и высеяна на отдельную чашку (или лунку многолуночного планшета). Альтернативно, клетки могут быть субклонированы на многолуночном планшете при статистическом соотношении для облегчения помещения отдельной клетки в каждую лунку (например, от примерно 0,1 до примерно 1 клетки/лунку или даже от примерно 0,25 до примерно 0,5 клетки/лунку, как, например, 0,5 клетки/лунку). Конечно, клетки могут быть клонированы при высевании их при низкой плотности (например, в чашки Петри или другой подходящий субстрат) и отделении их от других клеток с использованием устройств, таких как клонирующие кольца. Альтернативно, когда доступен источник излучения, клоны можно получать, давая клеткам расти в виде монослоя, а затем экранируя одну и облучая оставшиеся клетки в пределах монослоя. Выжившая клетка затем будет вырастать в клональную популяцию. Хотя продуцирование клональной популяции может быть размножено в любой подходящей культуральной среде, предпочтительными условиями культивирования для клонирования стволовых клеток (таких как стволовые клетки изобретения или другие стволовые клетки) является среда из примерно 2/3 F12 среды+20% сыворотки (предпочтительно, околоплодной телячьей сыворотки) и примерно 1/3 стандартной среды, которая была кондиционирована стромальными клетками (например, клетками от стромальной сосудистой фракции аспирата липосакции), относительные доли определяются по объему.

В любом случае, будучи клонированными или неклонированными, выделенные клетки могут быть культивированы до подходящего момента, когда может быть спрогнозирован их фенотип развития. Как отмечалось, клетки изобретения обладают по крайней мере двумя из вышеуказанных фенотипов развития. Таким образом, одну или несколько клеточных вытяжек данного клона можно обработать для того, чтобы выявить, обладает ли она таким эволюционным потенциалом. Один тип обработки заключается в культивировании клеток в культуральной среде, которая была кондиционирована действием зрелых клеток (или их предшественников) соответствующего типа для дифференцировки (например, среда, кондиционированная действием миоцитов, может индуцировать миогенную дифференцировку, среда, кондиционированная действием клеток сердечного клапана, может индуцировать дифференцировку в ткань клеточного клапана и т.д.). Конечно, также можно использовать определенную среду для индуцирования дифференцировки. Например, адипогенный фенотип развития может быть оценен путем воздействия на клетки среды, которая облегчает адипогенез, например, содержащей глюкокартикоид (например, изобутилметилксантин, дексаметазон, гидрокортизон, кортизон и т.д.), инсулин, соединение, которое повышает внутриклеточное содержание цАМФ (например, дибутирил-цАМФ, 8-СРТ-цАМФ (8-(4)хлорфенилтио)-аденозин-3',5'-циклический монофосфат; 8-бром-цАМФ; диоктаноил-цАМФ, форсколин и т.д.) и/или соединение, которое ингибирует разрушение цАМФ (например, ингибитор фосфодиэстеразы, такой как метилизобутилксантин, теофиллин, кофеин, индометацин и тому подобные). Таким образом, воздействие на стволовые клетки примерно от 1 мкМ до примерно 10 мкМ инсулина в сочетании с примерно от 10-9 до 10-6 M (например, примерно 1 мкМ) дексаметазона может индуцировать адипогенную дифференцировку. Такая среда, при желании, также может включать другие агенты, такие как индометацин (например, от примерно 100 мкМ до примерно 200 мкМ), и предпочтительно среда не содержит сыворотки. Остеогенный фенотип развития может быть оценен при подвергании клеток воздействию от примерно 10-7 M до примерно 10-9 M дексаметазона (например, примерно 1 мкМ) в сочетании с от примерно 10 мкМ до примерно 50 мкМ аскорбат-2-фосфата и от примерно 10 нМ до примерно 50 нМ 8-глицерофосфата, и среда также может включать сыворотку (например, бычью сыворотку, лошадиную сыворотку и т.д.). Миогенная дифференцировка может быть индуцирована путем воздействия на клетки от 10 мкМ до примерно 100 мкМ гидрокортизона, предпочтительно в обогащенной сывороткой среде (например, содержащей от примерно 10% до примерно 20% сыворотки (бычьей, лошадиной либо их смеси)). Хондрогенная дифференцировка может быть индуцирована путем подвергания клеток воздействию от примерно 1 мкМ до примерно 10 мкМ инсулина и от примерно 1 мкМ до примерно 10 мкМ трансферрина, от примерно 1 нг/мл до 10 нг/мл трансформирующего фактора роста (TGF) 1 и от примерно 10 нМ до примерно 50 нМ аскорбат-2-фосфата (50 нМ). Для хондрогенной дифференцировки клетки предпочтительно культивируют при высокой плотности (например, примерно несколько миллионов клеток/мл или с использованием микромассовой методики культивирования) и также в присутствии низких количеств сыворотки (например, от примерно 1% до примерно 5%). Клетки также могут быть индуцированы для принятия более неустановившегося фенотипа развития (например, плодного или эмбрионального фенотипа). Такое индуцирование достигается при подвергании клеток изобретения воздействию условий, которые имитируют таковые в пределах плодов и эмбрионов. Например, клетки изобретения или популяции могут быть сокультивированы с клетками, выделенными из плодов или эмбрионов или в присутствии околоплодной сыворотки. По таким линиям клетки могут быть индуцированы для дифференцировки в любую из вышеуказанных мезодермальных линий дифференцировки сокультивированием их со зрелыми клетками соответствующего типа или их предшественниками. Таким образом, например, миогенная дифференцировка может быть индуцирована путем культивирования клеток изобретения с миоцитами или предшественниками, и аналогичные результаты могут достигаться в отношении других отмеченных в данном описании типов тканей. Другие способы индуцирования дифференцировки известны в данной области и многие из них можно использовать в качестве подходящих.

После культивирования клеток в среде, индуцирующей дифференцировку, в течение подходящего времени (например, от нескольких дней до недели или более) клетки могут быть проанализированы для определения того, действительно ли они продифференцировали, приобретя физические качества данного типа клеток. Одно измерение дифференцировки per se представляет собой длину теломера, недифференцированные стволовые клетки имеют более длинные теломеры, чем дифференцированные клетки, таким образом клетки могут быть проанализированы в отношении уровня теломеразной активности. Альтернативно из клеток можно выделить РНК или белки и проанализировать (с помощью Нозерн-гибридизации, от ПЦР, Вестрен-блот анализа и т.д.) на присутствие маркеров, характеристичных для желаемого фенотипа. Конечно, клетки могут быть проанализированы иммунногисто-химически или с красителем с использованием тканеспецифических красителей. Таким образом, например, для оценки адипогенной дифференцировки клетки могут быть окрашены жироспецифическими красителями (например, масляный красный О, сафарин красный, судан черный и т.д.) или зондированы для оценки пристуствия адипозно-родственных факторов (например, коллагена IV типа, PPAR-, адипсина, липопротеинлипазы и т.д.). Аналогично остогенез может быть оценен окрашиванием клеток костно-специфическими красителями (например, щелочной фосфатазой, фон Косса (von Kossa) и т.д. или зондированием на присутствие костно-специфических маркеров (например, остеокальцина, остеонектина, остеопонтина, коллагена I типа, костных морфогенных белков, cbfa и т.д.). Миогенез может быть оценен идентификацией классических морфологических изменений (например, полиядерные клетки, образование синцития и т.д.) или оценены биохимически на присутствие мышечно-специфических факторов (например, мио D, миозиновой тяжелой цепи, NCAM и т.д.). Хондрогенез может быть определен окрашиванием клеток с использованием хрящ-специфических красителей (например, альциан синий) или зондированием клеток для экспрессии/продуцирования хрящ-специфических молекул (например, сульфатированных гликозоаминогликанов и протеогликанов (например, кератина, хондроитина и т.д.) в среде, коллагена типа II и т.д. Другие способы оценивания фенотипа развития известны в данной области и подходящим является любой из них. Например, клетки могут быть сортированы по размеру и зернистости. Также клетки можно использовать для наработки моноклональных антител, которые затем могут быть использованы для оценки связываются ли они предпочтительно с данным типом клеток. Корреляция антигенности может подтвердить, что стволовые клетки дифференцировались по данному эволюционному пути.

Хотя клетка может быть одиночной и отделенной от других клеток, предпочтительно она находится в популяции клеток, и изобретение обеспечивает определенную популяцию, включающую клетки изобретения. В некоторых вариантах осуществления популяция является гетерогенной. Так, например, популяция может включать поддерживающие клетки для обеспечения факторами клеток изобретения. Конечно, стволовые клетки изобретения сами могут служить в качестве поддерживающих клеток для культивирования других типов клеток (таких, как другие типы стволовых клеток, например, невральные (мозговые) стволовые клетки (NSC), кроветворные стволовые клетки (НРС, особенно CD34+ стволовые клетки), эмбриональные стволовые клетки (ESC) и их смеси), и популяция может включать такие клетки. В других вариантах осуществления популяция по существу является гомогенной, состоя в основном из липопроизводных стволовых клеток изобретения.

Поскольку клетки изобретения могут быть клонированы, по существу гомогенная содержащая их популяция может быть клональной. Действительно, изобретение также относится к любой определенной клональной клеточной популяции, состоящей по существу из мезодермальных стволовых клеток, стволовых клеток соединительной ткани или их смеси. В данном варианте осуществления клетки могут быть липопроизводными или полученными из других мезодермальных или соединительных клеточных тканей (например, костный мозг, мышцы и т.д.) с использованием способов, известных в данной области. После выделения клетки могут быть размножены клонально так, как описано в данном описании.

Клетки изобретения (и клеточные популяции) могут использоваться во многих целях. Как отмечалось, клетки могут поддерживать рост и размножение клеток других типов, и изобретение относится к способам осуществления этого. В одном аспекте изобретение относится к способу кондиционирования культуральной среды с использованием стволовых клеток изобретения и к кондиционированной среде, получаемой таким способом. Среда становится кондиционированной при воздействии клеток на желаемую культуральную среду в условиях, достаточных для того, чтобы клетки кондиционировали среду. Обычно среду используют для поддержания роста клеток изобретения, которые секретируют гормоны, клеточный матриксный материал и другие факторы в среду. После подходящего периода времени (например, один или несколько дней) культуральную среду, содержащую секретированные факторы, можно отделить от клеток и хранить для последующего применения. Конечно, при желании клетки изобретения и популяции можно повторно использовать последовательно для кондиционирования среды. В других применениях (например, для сокультивирования клеток изобретения с клетками других типов) клетки можно оставлять в кондиционированной среде. Таким образом, изобретение обеспечивает кондиционированную среду, полученную с использованием такого способа, которая, при желании, может либо содержать клетки изобретения, либо по существу не содержать клетки изобретения.

Кондиционированную среду можно использовать для поддержания роста и размножения целевых типов клеток, и изобретение обеспечивает способ культивирования клеток (в частности, стволовых клеток) с использованием кондиционированной среды. Способ включает поддержание желаемой клетки в кондиционированной среде в условиях, при которых клетка остается жизнеспособной. Клетку можно поддерживать при любых подходящих условиях их культивирования, таких, какие известны в данной области. Предпочтительно способ дает возможность осуществления последовательных циклов митотического деления клетки с образованием размноженной популяции. Точные условия (например, температура, уровни CO2, перемешивание, присутствие антибиотиков и т.д.) будут зависеть от других составляющих среды и от типа клетки. Однако оптимизация таких параметров доступна для обычного специалиста в данной области. В некоторых вариантах осуществления желательно, чтобы среда не содержала липопроизводных клеток, использованных для кондиционирования среды, как указано в данном описании. Однако в других вариантах осуществления желательно, чтобы липопроизводные клетки сохранялись в кондиционированной среде и сокультивировались с другими представляющими интерес клетками. Действительно, поскольку липопроизводные клетки изобретения могут экспрессировать поверхностные клеточные медиаторы межклеточной коммуникации, часто желательно для клеток изобретения и других целевых клеток осуществлять сокультивирование при условиях, при которых два типа клеток находятся в контакте. Это может достигаться, например, высеванием клеток в виде гетерогенной популяции клеток на подходящий субстрат для культивирования. Альтернативно первоначально можно вырастить до слияния липопроизводные клетки изобретения, которые будут служить в качестве субстрата для вторых целевых клеток для культивирования в кондиционированной среде.

В другом варианте осуществления липопроизводные клетки изобретения могут быть генетически модицифированы, например, для экспрессии экзогенных генов или для подавления экспрессии эндогенных генов, и изобретение обеспечивает способ генетического модифицирования таких клеток и популяций. В соответствии с данным способом клетки подвергают действию вектора генного переноса, содержащего нуклеиновую кислоту, включающую трансген, таким образом, что нуклеиновую кислоту вводят в клетку в условиях, подходящих для экспрессии трансгена внутри клетки. Трансген обычно представляет собой экспрессирующую кассету, включающую кодирующий полинуклеотид, оперативно связанный с подходящим промотором. Кодирующий полинуклеотид может кодировать белок, или он может кодировать биологически активную РНК (например, антисмысловую РНК или рибосом). Таким образом, например, кодирующий полинуклеотид может кодировать ген, придающий устойчивость к токсину, гормон (такой как пептидные гормоны роста, рилизинг-факторы гормонов, половые гормоны, адренокортикотропные гормоны, цитокины (например, интерферины, интерлейкины, лимфокины) и т.д.), связанный с поверхностью клетки сигнальный фрагмент (например, молекулы адгезии клеток, рецепторы гормонов и т.д.), фактор, стимулирующий данную линию дифференцировки и т.д. Конечно, когда желательно использовать технологию переноса гена для развития данного трансгена, его последовательность будет известной.

Внутри экспрессирующей кассеты кодирующий полинуклеотид оперативно связан с подходящим промотором. Примеры подходящих промоторов включают прокариотические промоторы и вирусные промоторы (например, ретровирусные ITRs, LTRs, немедленноранние вирусные промоторы (IEp), такие как IEp вируса герпеса (например, IСР4-IEp и ICP0-IEp), цитомегаловирусный (CMV) IEp и другие вирусные промоторы, такие вирусные промоторы саркомы Роуса (RSV) и вирусные промоторы лейкоза мышей (MLV)). Другие подходящие промоторы представляют собой эукариотические промоторы, такие как энхансеры (например, регуляторные элементы -глобина кролика), конститутивные промоторы (например, -актиновый промотор и т.д.), сигнал-специфические промоторы (например, индуцибельные промоторы, такие как промотор, реагирующий на RU486 и т.д.) и тканеспецифические промоторы. Среди специалистов в данной области принято выбирать промотор, подходящий для управления экспрессией гена в определенном клеточном контексте. Экспрессирующая кассета может включать более одного кодирующего полинуклеотида, и, при желании, она может включать другие элементы (например, последовательности полиаденилирования, последовательности, кодирующие сигнальную последовательность мембранной вставки, или лидерную последовательность секреции, последовательности связывания рибосом, транскрипционные регуляторные элементы (например, энхансеры, силенсеры и т.д.) и тому подобное).

Экспрессирующая кассета, содержащая трансген, должна быть введена в генетический вектор, подходящий для доставки трансгена в клетки. В зависимости от желательного конечного применения любой такой вектор также можно использовать для генетической модификации клеток (например, плазмиды, голые ДНК, вирусы, такие как аденовирус, адено-ассоциированный вирус, вирусы герпеса, лентивирусы, папилломавирусы, ретровирусы и т.д.). Для конструирования желаемой экспрессирующей кассеты внутри таких вирусов можно использовать любой способ, многие из которых хорошо известны в данной области (например, прямое клонирование, гомологичная рекомбинация и т.д.). Конечно, выбор вектора будет в большой степени определять способ, используемый для введения вектора в клетки (например, посредством слияния протопласта, кальций-фосфатного осаждения, генной пушки, электропорации, инфицирования вирусными векторами и т.д.), которые обычно известны в данной области.

Генетически измененные клетки можно использовать в качестве биореакторов для продуцирования продукта трансгена. В других вариантах осуществления генетически модифицированные клетки используют для доставки трансгена и его продукта животному. Например, клетки, будучи генетически модифицированными, могут быть введены животному в условиях, достаточных для того, чтобы экспрессировать трансген in vivo.

Помимо того, что многие клетки и популяции настоящего изобретения применимы в качестве мишеней для генетической модификации, они секретируют гормоны (например, цитокины, пептидные или другие (например, монобутириновый) факторы роста и т.д.). Некоторые из клеток природно секретируют такие гормоны по первоначальном выделении, а другие клетки могут быть генетически модифицированы для секретирования гормонов, как описано в данной заявке. Клетки настоящего изобретения, секретирующие гормоны, можно использовать в различных контекстах in vivo и in vitro. Например, такие клетки могут использоваться в качестве биореакторов для обеспечения легкодоступного источника данного гормона, и изобретение относится к способу получения гормонов из таких клеток. Согласно данному способу клетки культивируют в условиях, подходящих для того, чтобы они секретировали гормон в культуральную среду. После подходящего периода времени и, предпочтительно периодически, среду собирают и обрабатывают для выделения гормона из среды. Для выделения гормона из среды можно использовать любой стандартный способ (например, гель- или аффинную хроматографию, диализ, лиофилизацию и т.д.), многие из которых известны в данной области.

В других вариантах осуществления секретирующие гормоны клетки (и популяции) настоящего изобретения можно использовать в качестве терапевтических агентов. Обычно, такие способы включают перенос клеток к желаемой ткани либо in vitro (например, в качестве трансплантата перед имплантацией или приживлением), либо in vivo, непосредственно к ткани животного. Клетки можно переносить к желаемой ткани любым подходящим способом, который обычно будет изменяться в соответствии с типом ткани. Например, клетки могут быть перенесены к трансплантату путем выдерживания трансплантата (или настаивания его) вместе с культуральной средой, содержащей клетки. Альтернативно клетки можно высеивать на требуемое место в пределах ткани для основания популяции. Клетки можно перенести in vivo с использованием устройств, таких как катетеры, троакары, канюли, стенты (на которые может быть сделан посев клеток) и т.д. Для таких применений клетки предпочтительно секретируют цитокин или гормон роста, такой как человеческий фактор роста, фактор роста фибробластов, фактор роста нервной ткани, инсулиноподобные факторы роста, факторы роста кроветворных стволовых клеток, члены семейства факторов роста фибробластов, члены семейства тромбоцитарных факторов роста, факторы роста сосудистых и эндотелиальных клеток, члены семейства TGFb (включая костный морфогенетический фактор) или ферменты, специфичные для врожденных заболеваний (например, дистрофии).

В одном применении изобретение обеспечивает способ стимулирования заживления раны у пациента с использованием таких клеток. В соответствии с таким способом клетки изобретения, секретирующие гормон, переносят в область раны в условиях, достаточных для того, чтобы клетка продуцировала гормон. Присутствие гормона в области раны стимулирует заживление раны. Способ стимулирует заживление как внешних (например, поверхностных), так и внутренних ран. Раны, для стимулирования заживления которых применим способ настоящего изобретения, включают, не ограничиваясь, ссадины, рваные раны, открытый пневмоторакс, ожоги, ушибленные раны, огнестрельные раны, резаные раны, открытые раны, проникающие ранения, сквозные ранения, колотые раны, сквозные ранения поверхностных тканей, хирургические раны, поверхностные раны кожи и подкожной клетчатки или касательные ранения. Способ не требует достижения полного заживления или затягивания раны; достаточно того, что способ стимулирует любую степень затягивания раны. В данном аспекте способ можно использовать сам по себе или в сочетании с другими способами заживления поврежденной ткани.

В том случае, когда клетки изобретения секретируют ангиогенный гормон (например, сосудистый фактор роста, фактор роста сосудистых и эндотелиальных клеток и т.д.), их (а также содержащие их популяции) можно использовать для индуцирования ангиогенеза в тканях. Таким образом, изобретение обеспечивает способ стимулирования образования новых сосудов в ткани с использованием таких клеток. В соответствии с данным способом клетку вводят в желаемую ткань в условиях, достаточных для того, чтобы клетка продуцировала ангиогенный гормон. Присутствие гормона в ткани стимулирует образование новых сосудов в ткани.

Поскольку стволовые клетки изобретения обладают фенотипом развития, их можно использовать в тканевой инженерии. В этом отношении изобретение обеспечивает способ продуцирования животного материала, включающий поддержание клеток изобретения в условиях, достаточных для их размножения и дифференцировки с образованием желаемого материала. Материал может включать зрелые ткани или даже целые органы, включая типы тканей, в которые могут дифференциировать клетки изобретения (как указано в данном описании). Как правило, такой материал включает жировую, хрящевую, сердечную, кожную соединительную ткань, кроветворную, мышечную, почечную, костную, плевральную, висцеральную ткани, сосудистые ткани и тому подобные. Более типично, материал включает комбинации данных типов тканей (т.е. более одного типа ткани). Например, материал может включать все части органа животного (например, сердце, почку) или конечность (например, ногу, крыло, руку, кисть руки, стопу ноги и т.д.). Конечно, поскольку клетки могут делиться и дифференцировать с получением таких структур, они также могут образовывать зачаток подобных структур. На ранних стадиях такие зачатки могут быть сохранены замороженными в жидком азоте для дальнейшей генерации желаемой зрелой структуры или органа.

Для получения таких структур клетки изобретения и популяции поддерживают при условиях, подходящих для того, чтобы они размножались и делились с образованием целевых структур. В некоторых применениях это осуществляют путем их переноса животному (т.е. in vivo) обычно в поле зрения, где желателен новый материал. Таким образом, например, изобретение может облегчить регенерацию тканей (например, кости, мышцы, хряща, сухожилия, жировой ткани и т.д.) у животного в том случае, когда клетки имплантированы в такие ткани. В других вариантах осуществления и, в особенности для создания зачатка клетки, можно индуцировать для дифференцировки и размножить в ткани in vitro. В таких применениях клетки культивируют на субстратах, которые облегчают формирование в трехмерные структуры, способствующие развитию ткани. Таким образом, например, клетки могут быть культивированы или высеяны на биосовместимые решетки, как, например, решетку, включающую межклеточный матриксный материал, синтетические полимеры, цитокины, факторы роста и т.д. Такая решетка может быть сформована в желаемую форму для облегчения развития типов тканей. Также, по крайней мер, на ранней стадии во время такого культивирования среду и/или субстрат дополняют факторами (например, факторами роста, цитокинами, межклеточным матриксным материалом и т.д.), что облегчает развитие подходящих типов тканей и структур. Действительно, в некоторых вариантах осуществления желательно сокультивировать клетки вместе со зрелыми клетками соответствующего типа ткани или их предшественниками или подвергать клетки действию соответствующей кондиционированной среды, как обсуждается в данном описании.

Для облегчения применения липопроизводных клеток и популяций изобретения для продуцирования таких животных материалов и тканей изобретение обеспечивает композицию, включающую клетки изобретения (и популяции) и биологически совместимую решетку. Обычно решетка образована из полимерного материала, имеющего волокна в виде ячейки или губки, обычно с пространствами, составляющими примерно от 100 мкм до 300 мкм. Такие структуры обеспечивают достаточную площадь, на которой могут расти и пролиферировать клетки. Желательно, что решетка была со временем биоразрушаемой, так что она будет поглощаться животным материалом по мере его развития. Подходящие полимерные решетки, таким образом, могут быть образованы из мономеров, таких как гликолевая кислота, молочная кислота, пропилфумарат, капролактон, гиалурон, гиалуроновая кислота и тому подобные. Другие решетки могут включать белки, полисахариды, полигидроксикислоты, сложные полиортоэфиры, полиангидриды, полифосфазены или синтетические полимеры (особенно биоразрушаемые полимеры). Конечно, подходящий полимер для образования такой решетки может включать более одного мономера (например, комбинации из указанных мономеров). Также, при желании, решетка может включать гормоны, такие как факторы роста, цитокины и морфогены (например, ретиноевая кислота, арахадоновая кислота и т.д.), желательные межклеточные матриксные молекулы (например, фибронектин, ламинин, коллаген и т.д.) или другие материалы (например, ДНК, вирусы, другие типы клеток и т.д.).

Для образования композиции клетки вводят в решетку таким образом, что они проникают в ее интерстициальное пространство. Например, матрикс можно вымачивать в растворе или суспензии, содержащей клетки, или они могут быть введены или впрыснуты в матрикс. Особенно предпочтительная композиция представляет собой гидрогель, образованный сшиванием суспензии, включающей полимер и содержащей также диспергированные в ней клетки изобретения. Такой способ образования позволяет клеткам распределяться сквозь решетки, облегчая в большей мере даже проникновение клеток сквозь решетку. Конечно, композиция также может включать зрелые клетки желаемого фенотипа или их предшественники, особенно для того, чтобы потенцировать индукцию стволовых клеток изобретения, дифференцировать соответствующим образом внутри решетки (например, в качестве эффекта сокультивирования таких клеток внутри решетки).

Композицию можно использовать любым подходящим способом для облегчения роста и генерирования желаемого типа тканей, структур или зачатков. Например, композиция может быть сконструирована с использованием трехмерных или стеротактических способов моделирования. Таким образом, например, слой или домен с композицией может быть заселен клетками, примированными для остеогенной дифференцировки, а другой слой или домен в композиции может быть заселен клетками, примированными для миогенного и/или хондрогенного развития. Наложение таких доменов друг на друга облегчает формирование и дифференцировку комплексных структур, включая множественные типы тканей (например, кость, окруженная мышцами, как в конечности). Для направления роста и дифференцировки целевой структуры композицию можно культивировать ex vivo в биореакторе или инкубаторе, как будет являться подходящим. В других вариантах осуществления структуру имплантируют животному-хозяину непосредственно в место, в котором желательно вырастить ткань или структуру. Еще в одном варианте осуществления композиция может быть приживлена хозяину (обычно животному, такому как свинья, павиан и т.д.), где она будет развиваться и созревать до тех пор, пока не станет готова к применению. После этого зрелую структуру (или зачаток) иссекают из хозяина и надлежащим образом имплантируют хозяину.

Решетки, подходящие для введения в композицию, могут быть получены из любого подходящего источника (например, матригель) и существуют некоторые коммерческие источники для подходящих решеток (например, подходящая полигликолевая кислота может быть получена из источников, таких как Ethicon, N.J.). Другая подходящая решетка может быть получен из неклеточной части жировой ткани, то есть межклеточного матриксного вещества жировой ткани, по существу не содержащего клеток, и изобретение относится к такой липопроизводной решетке. Обычно такая липопроизводная решетка включает белки, такие как протеогликаны, гликопротеины, гуалуронины, фибронектины, коллагены (типа I, типа II, типа III, типа IV, типа V, типа VI и т.д.) и тому подобное, что служит превосходными субстратами для роста клеток. Дополнительно, такие липопроизводные решетки могут включать гормоны, предпочтительно цитокины и факторы роста, для облегчения роста клеток, высеянных в матрикс (межклеточный материал).

Липопроизводный матрикс может быть выделен из жировой ткани просто, как описано выше, за исключением того, что он будет присутствовать в неклеточной фракции. Например, жировая ткань или ее производные (например, фракция клеток после центрифугирования, как обсуждалось выше) могут быть подвергнуты ультразвуковому или термическому воздействию и/или ферментативно обработаны для выделения межклеточного материала. Также желательно клеточную фракцию жировой ткани разрушают, например, обработкой липазами, детергентами, протеазами и/или с помощью механического или ультразвукового разрушения (например, с использованием гомогенизатора или ультразвукового дезинтегратора). Однако, будучи выделенным, материал первоначально вязок, но его можно впоследствии обработать, при желании, в зависимости от требуемой конечной цели. Например, сырой матриксный материал может быть обработан (например, подвергнут диализу или обработан протеазами или кислотами и т.д.) для получения целевого материала решетки. Таким образом, решетка может быть получена в гидратированной форме, или она может быть высушена или лиофилизована по существу в безводную форму или порошок. После этого порошок можно повторно гидратировать для применения в качестве субстрата клеточной культуры, например, путем суспендирования в подходящей среде для кутивирования клеток. В данном отношении, липопроизводная решетка может быть смешана с другими подходящими материалами решеток, такими как описано выше. Конечно, изобретение относится к композициям, включающим липопроизводную решетку и клетки или популяции клеток, такие как липопроизводные клетки изобретения, а также другие клетки (в особенности, другие типы стволовых клеток).

Как обсуждалось выше, клетки, популяции, решетки и композиции изобретения можно использовать в инженерии и регенерации тканей. Таким образом, изобретение относится к имплантируемой структуре (т.е. имплантату), включающему любую из отличительных особенностей изобретения. Точная природа имплантата будет изменяться в соответствии с применением, куда его будут помещать. Имплантат может представлять собой или включать в себя, как описано, зрелую ткань, или он может включать незрелую ткань или решетку. Таким образом, один тип имплантата может представлять собой костный имплантат, включающий популяцию клеток изобретения, которые подвергаются (или примированы для) остеогенной дифференцировки, необязательно будучи высеянными внутри решетки подходящего размера и протяженности, как описано выше. Такой имплантат может быть введен или приживлен хозяину для стимуляции генерирования или регенерации зрелой костной ткани внутри пациента. Подобные имплантаты можно использовать для стимуляции роста или регенерации мышцы, жира, хряща, сухожилия и т.д. внутри пациентов. Другие типы имплантатов являются зачатками (такими, как описано в данной заявке), например, зачатками конечностей, зачатками пальцев, развивающимися почками и т.д., которые, будучи приживлены пациенту, будут развиваться в соответствующие структуры.

Липопроизводная решетка может подходящим образом использоваться в качестве части набора для культивирования клеток. Соответственно изобретение относится к набору, включающему липопроизводную решетку по изобретению и один или несколько других компонентов, таких как гидратирующие агенты (например, вода, физиологически совместимые физиологические растворы, готовые среды для культивации клеток, сыворотка или ее производные и т.д.), субстраты клеточных культур (например, диски для культивирования, планшеты, ампулы и т.д.), культуральная среда для клеток (либо в жидкой, либо в порошкообразной форме), соединения-антибиотики, гормоны и тому подобное. Хотя набор включает любой из таких ингредиентов, предпочтительно он включает все необходимые ингредиенты для обеспечения культивирования и роста желаемых типов клеток в подходящем сочетании. Конечно, при желании, набор также может включать клетки (обычно замороженные), которые могут быть высеяны в решетку, как здесь описано.

Хотя многие аспекты изобретения относятся к росту и дифференцировки тканей, изобретение также имеет другие применения. Например, липопроизводную решетку можно использовать в качестве экспериментального реагента, такого как в развивающихся улучшенных решетках и субстратах для роста и дифференцировки тканей. Липопроизводная решетка также может использоваться косметически, например, для скрывания морщин, шрамов, атрофических очагов кожи и т.д. или для наращивания ткани. Для таких применений решетку предпочтительно стирилизуют и упаковывают в виде разовой дозированной формы. При желании, она может быть смешана с носителями (например, растворителями, такими как глицерин или спирты), отдушками, антибиотиками, красителями и другими ингредиентами, обычно применяемыми в косметических продуктах. Субстрат также может использоваться аутологически или в виде аллогенного трансплантата, и он может использоваться в качестве, или будучи включенным в состав, мазей и повязок для облегчения заживления ран. Липопроизводные клетки также можно использовать в качестве экспериментальных реагентов. Например, их можно использовать для облегчения идентификации факторов, ответственных за ранние процессы дифференцировки. Например, клетки изобретения могут быть подвергнуты воздействию среды для индуцирования конкретной линии дифференцировки и затем проанализированы на дифференциальную экспрессию генов (например, с помощью инициированной случайным образом ПЦР или электрофореза, или белка, или РНК и т.д.).

В качестве любых стадий выделения стволовых клеток изобретения или липопроизводной решетки изобретение относится к набору для выделения таких реагентов из жировых тканей. Набор может включать устройства для выделения жировой ткани из пациента (например, канюлю, иглу, аспиратор и т.д.), а также средства для отделения стромальных клеток (например, с помощью описанных здесь способов). Набор можно использовать, например, в качестве выделенного источника стволовых клеток, которые затем могут быть повторно введены от того же человека, как будет предназначено. Таким образом, набор может облегчить выделение липопроизводных стволовых клеток для имплантации пациенту, нуждающемуся в росте желаемого типа ткани, даже в одной и той же процедуре. В данном отношении набор также может включать среду для дифференцировки клеток, такую, как вышеуказанные. Как будет являться подходящим, клетки можно подвергнуть действию среды для примирования их для дифференцировки внутри нуждающегося в этом пациента. Конечно, набор можно использовать в качестве удобного источника стволовых клеток для манипуляций in vitro (например, клонирования или дифференцировки, как здесь описано). В другом варианте осуществления набор можно использовать для выделения липопроизводной решетки, как описано в данном описании.

ПРИМЕРЫ

Хотя специалист в данной области полностью способен осуществить на практике настоящее изобретение по прочтении вышеизложенного подробного описания, следующие примеры помогут прояснить некоторые его признаки. В частности, в них продемонстрировано выделение липопроизводных стволовых клеток человека, по существу не содержащих зрелых адипоцитов, выделение клональной популяции таких клеток, способность таких клеток дифференцировать in vivo и in vitro и способность таких клеток поддерживать рост других типов стволовых клеток. В примерах также показано выделение липопроизводной решетки, по существу не содержащей клеток, которая способна служить в качестве подходящего субстрата для клеточной культуры. Конечно, поскольку данные примеры представлены в чисто иллюстративных целях, их не следует использовать для истолковывания объема изобретения ограниченным образом, но скорее следует рассматривать в качестве расширения вышеизложенного описания изобретения как целого.

Способы, использованные в данных примерах, такие как хирургическое вмешательство, клеточная культура, ферментативное расщепление, гистология и молекулярный анализ белков и полинуклеотидов, знакомы обычным специалистам в данной области. Поэтому и в интересах краткости экспериментальные подробности не изложены детально.

Пример 1

В данном примере продемонстрировано выделение липопроизводных стволовых клеток человека, по существу не содержащих зрелых адипоцитов.

Сырой аспират липосакции получали от пациентов, подвергавшихся избирательному хирургическому вмешательству. Перед процедурой липосакции пациентам вводили адреналин для сведения к минимуму загрязнения аспирата кровью. Аспират процеживали для отделения попутных кусочков жировой ткани от жидких отходов. Выделенную ткань тщательно прополаскивали нейтральным фосфатно-буферным раствором и затем ферментативно расщепляли с использованием 0,075% (м/о) коллагеназой при 37°С в течение 20 минут при прерывистом перемешивании. После ферментативного гидролиза коллагеназу нейтрализовали и суспензию центрифугировали при примерно 260 g в течение приблизительно 10 минут, что давало многослойную надосадочную жидкость (супернатант) и клеточные шарики. Супернатант удаляли и сохраняли для дальнейшего применения, а шарики повторно суспендировали в эритроцитлизирующем растворе и инкубировали без перемешивания при примерно 25°С в течение примерно 10 минут. После инкубации среду нейтрализовали, а клетки опять центрифугировали при примерно 250 g в течение примерно 10 минут. После второго центрифугирования клетки суспендировали и оценивали на жизнеспособность (с использованием исключения по трипану синему) и количество клеток. После этого клетки помещали при плотности примерно 1×106 клеток/100 мм чашку. Их культивировали при 37°С в среде DMEM+околоплодная телячья сыворотка (примерно 10%) в приблизительно 5% CO2.

Большинство клеток были липкими, небольшого размера, моноядерными, относительно агранулярными, фибробласто-подобными клетками, не содержащими видимых капелек жира. Большинство клеток окрашивалось отрицательно масляным красным О и по фон-Косса. Клетки также анализировали на экспрессию теломеразы (с помощью коммерчески доступного набора для анализа TRAP) с использованием клеток HeLa и HN-12 в качестве положительного контроля. Фибробласты крайней плоти человека и HN-12 теплые клеточные экстракты использовали в качестве отрицательного контроля. Теломерные продукты разлагали на 12,5% полиакриламидных клетках и сигналы определяли фосфорографией. Теломерные лэддеры, свидетельствующие о теломеразной активности, наблюдали в полученных из жировой ткани стволовых клетках, так же, как и для положительного контроля. Лэддеры не наблюдались в отрицательном контроле.

Таким образом, данные клетки не идентифицировались как миоциты, адипоциты, хондроциты, остеоциты или клетки крови. Данные результаты показывают, что полученные из жировой ткани клетки экспрессируют теломеразную активность аналогично ранее описанным стволовым клеткам человека.

Субпопуляции данных клеток затем подвергали действию следующих сред для оценки их фенотипа развития:

Адипогенез	Остеогенез	Миогенез	Хондрогенез
DMEM	DMEM	DMEM	DMEM
10% FBS	10% FBS	10% FBS	1% FBS
0,5 мМ IBMX	5% лошадиной сыворотки	5% лошадиной сыворотки	6,25 мкг/мл инсулина
1 мкМ дексаметазона
	0,1 мкМ дексаметазона	50 мкМ гидрокортизона	6,25 мкг/мл трансферрина
10 мкМ инсулина
	50 мкМ аскорбат-2-фосфата	1% АВАМ	10 нг/мл TGF1
200 мкМ индометацина			50 нМ аскорбат-2-фосфата
	10 мМ глицерофосфата
1% АВАМ			1% АВАМ
	1% АВАМ

Популяцию культивировали при высокой плотности в хондрогенной среде в течение нескольких недель. Гистологический анализ тканевой культуры и парафиновые срезы проводили с использованием окрашивания Н&Е, альцианом синим, толуденом синим и трихромом Голднера на 2, 7 и 14 дни. Иммуногистохимию проводили с использованием антител против хондроитин-4-сульфата и кератинсульфата и коллагена типа II. Также осуществляли качественную оценку окрашивания матрикса. Результаты показывали, что хрящевые сферические узелки с четкой границей перихондральных клеток образовывались по крайней мере через 48 часов после первоначальной обработки. Необработанные контрольные клетки не проявляли свидетельств хондрогенной дифференцировки. Данные результаты подтверждают, что стволовые клетки имеют хондрогенный фенотип развития.

Популяцию культивировали до ближайшего слияния и затем подвергали действию адипогенной среды в течение нескольких недель. Популяцию исследовали через две и четыре недели после помещения в среду с помощью колориметрической оценки относительной непрозрачности после окрашивания масляным красным О. Определяли, что адипогенез протекает через две недели и полностью развивается через четыре недели (относительная непрозрачность 1 и 5,3 соответственно). В качестве положительного контроля использовали стволовые клетки, полученные из костного мозга, и такие клетки проявляли несколько меньший адипогенный потенциал (относительная плотность 0,7 и 2,8 соответственно).

Популяцию культивировали до ближайшего слияния и затем подвергали действию остеогенной среды в течение нескольких недель. Популяцию исследовали через две и четыре недели после помещения в среду с помощью колориметрической оценки относительной непрозрачности после окрашивания по фон-Косса. Определяли, что остеогенез протекает через две недели и полностью развивается через четыре недели (относительная непрозрачность 1,1 и 7,3 соответственно). Стволовые клетки, полученные из костного мозга, использовали в качестве положительного контроля и такие клетки проявляли несколько меньший остеогенный потенциал (относительная плотность 0,2 и 6,6 соответственно).

Популяцию культивировали до ближайшего слияния и затем подвергали действию миогенной среды в течение нескольких недель. Популяцию исследовали через одну, три и шесть недель после помещения в среду с помощью оценки многоядерных клеток и экспрессии мышца-специфических белков (MyoD и тяжелая цепь миозина). Фибробласты крайней плоти человека и скелетные миобласты использовали в качестве контроля. Клетки, экспрессирующие MyoD и миозин, были выявлены во всех временных точках после действия миогенной среды во всех популяциях стволовых клеток, и доля таких клеток увеличилась через 3 и 6 недель.

Многоядерные клетки наблюдали через 6 недель. В противоположность этому фибробласты не проявляли ни одной из таких характеристик ни в одной временной точке.

Данные результаты демонстрируют выделение липопроизводных плюрипотентных стволовых клеток человека, по существу не содержащих зрелых адипоцитов.

Пример 2.

В данном примере продемонстрировано, что липопроизводные стволовые клетки не дифференцируют в ответ на действие 5-азацитидина.

Липопроизводные стволовые клетки, полученные в соответствии с примером 1, культивировали в присутствии 5-азацитидина. В противоположность стволовым клеткам, полученным из костного мозга, действие данного агента не индуцирует миогенной дифференцировки (смотри Wakitani et al., выше).

Пример 3

Данный пример показывает генерирование клональной популяции липопроизводных стволовых клеток человека.

Клетки, выделенные в соответствии с методикой, указанной в примере 1, помещали из расчета примерно 5000 клеток/100 мм чашку и культивировали в течение нескольких дней, как указано в примере 1. После нескольких циклов деления клеток некоторые клоны собирали с помощью кольца клонирования и переносили в лунку 48-луночного планшета. Данные клетки культивировали в течение нескольких недель, заменяя среду дважды в неделю до тех пор, пока они не достигали примерно от 80% до 90% слияния (при 37°С в присутствии примерно 5% СО2 в 2/3 F12 среды + 20% околоплодной телячьей сыворотки и 1/3 стандартной среды, которая была первоначально кондиционирована клетками, выделенными в примере 1, «клональная среда»). После этого каждую культуру переносили в 35 мм чашку и выращивали, а затем повторно переносили в 100 мм чашку и выращивали до тех пор, пока не приближалось слияние. После этого одну клеточную популяцию замораживали, а оставшиеся популяции помещали на 12-луночные планшеты из расчета 1000 клеток/лунку.

Клетки культивировали в течение более 15 пассажей в клональной среде и контролировали дифференцировку, как указано в примере 1. Недифференцированное состояние каждого клона сохранялось верным после последовательных циклов дифференцировки.

Популяции клонов затем создавали и подвергали действию адипогенной, хондрогенной, миогенной и остеогенной среды, как обсуждалось в примере 1. Наблюдалось, что по крайней мере один из клонов был способен дифференцироваться в костную, жировую, хрящевую и мышечную ткани при действии соответствующей среды и большинство из клонов оказалось способным дифференцироваться, по крайней мере, в три типа тканей. Способность клеток развиваться в мышцу и хрящ дополнительно демонстрирует плюрипотентность данных липопроизводных стволовых клеток.

Данные результаты показывают, что липопроизводные стволовые клетки могут поддерживаться в недифференцированном состоянии на протяжении многих пассажей, не требуя специально отобранных сывороточных серий. Такие результаты также демонстрируют, что клетки сохраняют плюрипотентность после такого интенсивного пассажирования, при условии, что клетки действительно представляют собой стволовые клетки, а не просто коммитированные клетки-предшественники.

Пример 4

Данный пример показывает, что липопроизводные стволовые клетки могут поддерживать культуру других типов стволовых клеток.

Липопроизводные стволовые клетки человека пассажировали на 96-луночные планшеты при плотности примерно 30000/лунку, культивировали в течение одной недели, а затем облучали. Кроветворные стволовые клетки человека CD34+, выделенные из крови пуповины, затем высевали в лунки. Сокультуры поддерживали в среде MyeloCultH5100 и жизнеспособность клеток и пролиферацию контролировали субъективно с помощью наблюдения под микроскопом. Через две недели совместного культивирования кроветворные стволовые клетки оценивали на CD34 экспрессию с помощью проточной цитометрии.

После двухнедельного периода сокультивирования вместе со стромальными клетками кроветворные стволовые клетки образовывали большие колонии круглых клеток. Проточный анализ выявил, что 62% клеток оставались клетками CD34+. На основании наблюдений под микроскопом человеческие стромальные клетки, полученные из жировой ткани, поддерживали выживаемость и обеспечивали рост кроветворных стволовых клеток человека, полученных из крови пуповины.

Данные результаты показывают, что стромальные клетки из подкожной жировой ткани человека способны обеспечивать ех vivo поддержание, рост и дифференцировку других стволовых клеток.

Пример 5

В данном примере продемонстрировано, что липопроизводные стволовые клетки могут дифференцировать in vivo.

Каждой из 12 бестимусных мышей в четырех группах (A-D) имплантировали подкожно кристаллы гидроксиапатита/трикальцийфосфата, содержащие следующее: группа А - содержали липопроизводные стволовые клетки, которые были предварительно обработаны остеогенной средой, как указано в примере 1. Группа В - содержали необработанные липопроизводные стволовые клетки. Группа С - содержали остеогенную среду, но не содержали клеток. Группа D - содержали неостеогенную среду и не содержали клеток. В каждой группе шесть мышей забивали через три недели, а оставшихся мышей забивали через восемь недель после имплантации. Кристаллы экстрагировали, фиксировали, декальцифицировали и готовили срезы. Каждый срез анализировали с помощью окрашивания Н&Е, костным красителем Mallory и иммунокрасителем на остеокальцин.

Отчетливые области остеоидподобной ткани, окрашенной на остеокальцин и костным красителем Мэллори, наблюдали в срезах групп А и В. Существенно больше остеоидной ткани наблюдалось в группах А и В, чем в других группах (p<0,05 ANOVA), но значительной разницы в остеогенезе между группами А и В не наблюдалось. Более того, качественное увеличение роста костной ткани отмечалось в обоих группах А и В в период между 3 и 8 неделями. Данные результаты показывают, что липопроизводные стволовые клетки могут дифференцировать in vivo.

Пример 6

В данном примере показано выделение липопроизводной решетки, по существу не содержащей клеток.

В одном протоколе сохраненный супернатант из примера 1 подвергали ферментативному расщеплению в течение трех дней с помощью смеси 0,05% трипсин ЭДТА/100 МЕ/мл деокисрибонуклеазы для разрушения клеток. Каждый день дебрис промывали в физиологическом растворе и добавляли свежий фермент. После этого материал промывали в физиологическом растворе и повторно суспендировали в 0,05% коллагеназе и примерно 0,1% липазе для частичного расщепления присутствующих белков и жира. Такую инкубацию продолжали в течение двух дней.

В другом протоколе сохраненный супернатант из примера 1 инкубировали в ЭДТА для элиминирования любых эпителиальных клеток. Оставшиеся клетки лизировали с использованием буфера, содержащего 1% NP40, 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% ДСН, 5 мМ ЭДТА, 0,4 М NaCl, 50 мМ Трис-HCl (рН 8) и ингибиторы протеазы и по 10 мкг/мл каждого из лейпептина, химостатина, антипаина и пепстатина А. Наконец, ткань интенсивно промывали в ФБР, не содержащем двухвалентных катионов.

После обоих протоколов получения оставшееся вещество промывали и идентифицировали в качестве желеобразной массы. Анализ под микроскопом данного материала выявил, что он не содержал клеток и он состоял из большого количества коллагена (вероятно типа IV) и разнообразных факторов роста. Препараты данного материала поддерживали рост клеток, демонстрируя, что он является превосходным субстратом для тканевой культуры.

Введение в качестве ссылок

Все источники (например, авторские свидетельства, заявки на выдачу патента, патенты, публикации, сведения о депонировании, полезные модели, Интернет и тому подобное), на которые ссылаются или которые цитируются в данном документе или в любом рисунке, списке последовательностей или одновременно поданном заявлении, включены и составляют часть данного описания в качестве ссылок.

Руководство по толкованию

Вышеизложенное представляет собой объединенное описание изобретения как целого, а не просто любого конкретного элемента его аспекта. В описании раскрыты «предпочтительные варианты осуществления» данного изобретения, включая лучший способ осуществления, известный авторам изобретения. Конечно, по прочтении вышеизложенного описания вариации данных предпочтительных вариантов осуществления будут очевидны средним специалистам в данной области. Авторы изобретения предполагают, что квалифицированные специалисты будут использовать такие вариации надлежащим образом и что изобретение может практически быть осуществлено иначе, чем конкретно описано в данном описании. Соответственно данное изобретение включает все модификации и эквиваленты объектов, заявленных в прилагаемой формуле изобретения, что допускается законом.

Используемые в вышеизложенном описании и нижеизложенной формуле изобретения указатели единственного числа (например, «один») подразумевают множественное число, если не указано другого. Перечисление диапазона дискретных значений предназначено служить в качестве сокращенного способа упоминания индивидуально каждого отдельного значения, попадающего в данный диапазон, и каждое отдельное значение включено в данное описание, как если бы оно было указано индивидуально.

Кроме того, следующие термины определены следующим образом:

«Зачаток» представляет собой зародышевую структуру, обладающую способностью развиваться в определенную зрелую структуру.

«Фенотип развития» представляет собой потенциал клетки приобретать конкретный физический фенотип в процессе дифференцировки.

«Гормон» представляет собой любое вещество, которое секретируется клеткой и вызывает фенотипические изменения в той же самой или другой клетке при контакте.

«Стволовая клетка» представляет собой плюрипотентную клетку, обладающую способностью дифференцироваться в соответствии по крайней мере с двумя различными эволюционными путями.

Что касается конкретно формулы изобретения, термин «состоящий по существу из» указывает, что неперечисленные ингредиенты или стадии, которые не влияют значительным образом на известные и новые признаки изобретения, можно использовать в дополнение к специально перечисленным ингредиентам или стадиям. В противоположность этому термины, такие как «содержащий», «имеющий» и «включающий», указывают, что любые ингредиенты или стадии могут присутствовать в дополнение к перечисленным. Термин «состоящий из» указывает, что присутствуют только перечисленные ингредиенты или стадии, но не исключает возможности того, что эквиваленты ингредиентов или стадий могут заменять конкретно перечисленные.

Формула изобретения

1. Применение жировой ткани, представляющей собой эффлюент липосакции, для выделения стволовых клеток.

2. Применение по п.1, где эффлюент липосакции получен от человека.

3. Способ выделения одной или нескольких стволовых клеток из жировой ткани, отличающийся тем, что в качестве жировой ткани используют эффлюент, полученный методом липосакции.

4. Способ по п.3, дополнительно предусматривающий культивирование стволовой клетки или стволовых клеток.

5. Способ по п.4, где стволовую клетку или стволовые клетки культивируют на протяжении по меньшей мере десяти пассажей без дифференцировки.

6. Способ по любому из пп.4-5, где клетку или клетки культивируют в среде DMEM с добавлением примерно 5-15% сыворотки.

7. Способ по любому из пп.3-6, дополнительно предусматривающий генетическую модификацию стволовой клетки или стволовых клеток.

8. Способ по любому из пп.3-7, дополнительно предусматривающий клональное размножение стволовой клетки или стволовых клеток.

9. Способ по любому из пп.3-8, дополнительно предусматривающий дифференцировку стволовой клетки или стволовых клеток.

10. Способ по п.9, дополнительно предусматривающий дифференцировку стволовой клетки или стволовых клеток в один или несколько типов клеток-предшественников.

11. Способ по п.10, где один или несколько типов клеток-предшественников выбраны из группы типов клеток-предшественников, состоящей из преадипоцитов, премиоцитов и преостеоцитов.

12. Способ по п.10, где стволовая клетка или стволовые клетки дифференцируются в один или несколько зрелых типов клеток.

13. Способ по п.10, где один или несколько типов клеток представляют собой адипоциты.

14. Способ по п.10, где один или несколько типов клеток представляют собой хондроциты.

15. Способ по п.10, где один или несколько типов клеток представляют собой клетки кожной соединительной ткани.

16. Способ по п.10, где один или несколько типов клеток представляют собой клетки кровеносных сосудов.

17. Способ по п.10, где один или несколько типов клеток представляют собой миоциты.

18. Способ по п.10, где один или несколько типов клеток представляют собой остеоциты.

19. Способ по п.10, где один или несколько типов клеток представляют собой нейроны.

20. Способ по п.10, где один или несколько типов клеток представляют собой нейроглиальные клетки.

21. Способ по п.10, где один или несколько типов клеток представляют собой урогенитальные клетки.

22. Способ по п.10, где один или несколько типов клеток представляют собой плевральные и перитонеальные клетки.

23. Способ по п.10, где один или несколько типов клеток представляют собой висцеральные клетки.

24. Способ по п.10, где один или несколько типов клеток представляют собой мезодермальные железистые клетки.

25. Способ по п.10, где один или несколько типов клеток представляют собой стромальные клетки.

26. Способ по любому из пп.3-25, где эффлюент липосакции получен от человека.