РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ

(54) ВОДОРАСТВОРИМАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ В ВИДЕ ИОННОГО КОМПЛЕКСА И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ

(57) Реферат:

Изобретение относится к композиции полипептида, который проявляет биологическую активность при взаимодействии с внеклеточным рецептором на клеточной мембране. Композиция содержит комплекс ионного фармацевтически эффективного полипептида, выбранного из группы, включающей hedgehog-протеины, костные морфогенетические протеины, факторы роста, эритропоэтин, тромбопоэтин, G-CSF, интерлейкины и интерфероны. Эта композиция отличается тем, что она дополнительно содержит амфифильное соединение, при этом полипептид и амфифильное соединение образуют ионный комплекс, причем образование комплекса не увеличивает растворимость полипептида и полученный комплекс является растворимым в воде или представляет собой смесь растворимого и нерастворимого комплекса. Такая композиция пригодна для увеличения активности полипетида или для замедленного высвобождения полипептида. 3 с. и 8 з.п. ф-лы, 2 ил. Изобретение относится к композиции полипептида, который проявляет биологическую активность при взаимодействии с внеклеточным рецептором на клеточной мембране, причем указанный полипептид присутствует в композиции в виде ионного комплекса с амфифильным соединением. Изобретение также относится к применению указанной композиции. Применение амфифильных соединений, например, в качестве системы доставки лекарства, хорошо известно в данной области (см. патенты US 5650393, US 5688761, US 5665328, US 5124081, US 5109038). Известно также образование комплексов поверхностно-активных веществ и фармацевтических агентов в форме мицелл, например, для увеличения трансдермального и трансмембранного проникновения действующего вещества [Tomlinson и Davis, J. Colloid. Interf. Sci. 74 (1980) 349] . Также установлено, что фармацевтические агенты, как правило, обладают более хорошими характеристиками транспорта через биологические мембраны в неионизированной форме, чем в ионизированном состоянии [Cools и Jansen, J. Pharm. Pharmacol. 35 (1983) 689-691]. Кроме того, известно, что пептиды, которые присутствуют в множественной ионизированной форме при физиологических значениях рН, также не являются оптимальными для транспорта к месту действия (доставка лекарства), поскольку заряженные молекулы и, в частности, полипептиды, обладают низкой растворимостью в липидах [Hirai и др., Int. J. Pharm. 7 (1991) 317-325]. Исследования Okada и др. [J. Pharm. Sci. 72 (1993) 75-78] подтвердили, что связывание липофильного противоиона с ионной частью агента является полезным, т.к. в результате этого улучшается взаимодействие с биологической мембраной, что облегчает транспорт протеина через мембраны кишечника. Например, у Hazzenga и Berner в J. Controlled Release 16 (1991), 77-88, описан улучшенный способ трансдермального транспорта цвиттерионных действующих веществ. Другие способы улучшения взаимодействия действующих веществ с биологическими мембранами описаны, например, у Lee и др., Critical Rev. Therp. Drug Carrier Systems 8 (1991), 91-192, у Morimoto и др., Arch. Int. Pharmacodyn. 302 (1989), 18-26, и у Aungst, Int. J. Pharm. 33 (1986), 225-234. Однако целью всех этих способов было увеличение гидрофобности действующего вещества для того, чтобы облегчить его проникновение через биологические мембраны, такие, как кожа, и доставить это вещество в клетку. Для этого используют поверхностно-активные вещества в концентрации, превышающей критическую концентрацию мицеллообразования [CMC, Womack и др., Biochim. Biophys. Acta 733 (1983), 210] . Недостаток таких способов состоит в том, что применяемые высокие концентрации поверхностно-активных веществ оказывают очень сильное воздействие на клеточную мембрану и могут повредить ее. Из WO 94/08599 известно, что для получения связанных с носителем действующих веществ может быть приготовлен гомогенный раствор действующего вещества путем добавления соответствующего количества анионогенного детергента с образованием осадка, выделения осадка и повторного его растворения в органическом растворителе. Этот гомогенный раствор, который содержит комплекс анионогенного детергента с действующим веществом, затем может применяться для введения действующего вещества в твердую матрицу или диспергирования в ней. Кроме того, в WO 94/08599 описано, что может быть образован комплекс протеина с анионогенным детергентом, а действующее вещество может выделяться из него таким образом, чтобы обеспечить контролируемое высвобождение протеина. Известно, что активность протеинов может быть увеличена путем ковалентного связывания с гидрофобными соединениями, такими, как жирные кислоты или стероиды. Однако такие способы являются сложными и приводят к получению негомогенных продуктов в результате химической реакции сочетания [ср., например, Ekrami Н.М. и др., FEBS Letters 371 (1995), 283-286, Pepinski R.B. и др., J. Biol. Chem. 273 (1998), 14037-14045]. В основу настоящего изобретения была положена задача по получению композиций фармацевтически эффективных полипептидов, причем такие композиции должны усиливать активность входящих в их состав полипептидов. Указанная задача решается с помощью композиции, предпочтительно фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически эффективный полипетид, выбранный из группы, включающей hedgehog-протеины, костные морфогенетические протеины, факторы роста, эритропоэтин, тромбопоэтин, G-CSF (коллониестимулирующий фактор гранулоцитов), интерлейкины и интерфероны. Эта композиция отличается тем, что она также содержит амфифильное соединение, при этом полипептид и амфифильное соединение образуют ионный комплекс, причем образование комплекса не увеличивает растворимость полипептида. Композиция не содержит никакого органического растворителя. Для целей хранения композиция может быть лиофилизирована. Согласно изобретению полипептид и амфифильное соединение по отдельности в применяемых концентрациях растворимы в водных, предпочтительно в забуференных растворах, причем только комбинация двух веществ приводит к образованию комплекса в результате ионных взаимодействий, что повышает гидрофобность полипептида и таким образом уменьшает или по крайней мере не увеличивает его водорастворимость. Неожиданно было установлено, что таким образом может быть существенно увеличена активность указанных полипепетидов. Согласно изобретению количество и соотношение амфифильного соединения и полипептида предпочтительно выбирают таким образом, чтобы водная композиция, содержащая ионный комплекс, представляла собой прозрачный раствор. Если при образовании комплекса полипептида с амфифильным соединением происходит помутнение, а композиция предназначена для непосредственного введения пациенту в качестве раствора, то раствор фильтруют, получая прозрачный раствор. Если композиция до введения пациенту должна быть иммобилизована на носителе, помутнение не требуется устранять. Фармацевтически эффективный полипептид представляет собой полипептид, который может присутствовать в ионной форме и который для проявления биологической активности должен распознаваться и связываться рецептором на поверхности клетки (внеклеточным рецептором). Такие полипептиды представляют собой факторы роста (например, NGF, TGF-, FGR, GDF, инсулинподобные факторы роста), эритропоэтин, тромбопоэтин, G-CSF, интерфероны, такие, как интерферон-2b, интерлейкины, такие, как интерлейкин-2 или интерлейкин-12, костные морфогенетические протеины, такие, как ВМР-2, или hedgehog-протеины, такие, как sonic, indian или desert hedgehog-протеины. Особенно предпочтительны hedgehog-протеины. Предпочтительно используют протеины, которые обладают активностью (терапевтическое действие и/или активность протеина in vitro), которая предпочтительно увеличивается в 10 или более раз в комплексе по изобретению по сравнению с некомплексной формой. Ионная форма полипептида может быть получена в среде, которая предпочтительно отличается по крайней мере на 0,5 единиц рН от значения ее степени кислотности (рК). Под амфифильными соединением согласно изобретению следует понимать анионогенное, цвиттерионное или катионогенное гидрофобное поверхностно-активное вещество, жирную кислоту, алкилсульфонат или липид. Предпочтительными анионогенными поверхностно-активными веществами являются анионогенные детергенты, такие, как стероидные поверхностно-активные вещества, например, дезоксихолаты, холаты, таурохолаты, дезокситаурохолаты, дегидрохолаты (пригодны для катионных полипетидов); предпочтительными цвиттерионными поверхностно-активными веществами являются CHAPS (3-[3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфонат) и Zwittergent (N-додецил-N,N-диметил-3-аммонио-1- пропансульфонат); предпочтительными катионогенными детергентами являются цетилтриметиламмонийбромид или додециламмонийхлорид (пригодны для анионных полипептидов); предпочтительными жирными кислотами являются такие жирные кислоты, как пальмитиновая кислота (пригодна для катионных полипептидов). Предпочтительными алкилсульфатами являются алкилсульфонаты, такие, как децилсульфонат (пригоден для катионных полипептидов); предпочтительными липидами являются такие липиды, как фосфатидилсерин (пригоден для анионных полипептидов) и фосфатидат (пригоден для катионных полипептидов). Амфифильное соединение добавляют к композиции в таких условиях, при которых увеличивается гидрофобность полипетида и вследствие этого уменьшается или по крайней мере не увеличивается водорастворимость полипептида. Важно отметить, что согласно изобретению в результате этого процесса образуется водорастворимый ионный комплекс полипетида с амфифильным соединением. Соотношение полипептида и амфифильного соединения в комплексе зависит от используемого значения рН и от значений рК двух соединений, а также от соотношения концентраций. Предпочтительно используют значение рН, которое отличается по крайней мере на 0,5 единиц рН от значений рК полипептида и вспомогательного вещества. Чем большее количество амфифильного соединения добавляют, тем большее количество амфифильного соединения связывается с полипептидом, и комплекс становится более гидрофобным. Это может привести к осаждению комплекса и, следовательно, к образованию смеси растворимого и нерастворимого комплекса, который уже не является полностью водораствормым. Однако добавление неионогенного поверхностно-активного вещества, такого, как полиоксамер типа Tween, может по крайней мере частично восстановить водорастворимость комплекса, или при необходимости композиция может быть профильтрована. В этом случае неионогенное поверхностно-активное вещество также может присутствовать в концентрациях, которые приводят к образованию мицелл. Следует отметить, что тип и концентрацию амфифильного соединения выбирают таким образом, чтобы прежде всего в случае таких протеинов, как полипептид, молекулярная структура полипептида сохранилась в ее естественной активной форме и, таким образом, активность полипептида не уменьшилась. Как правило, для решения этой задачи достаточно использовать 10-кратный молярный избыток амфифильного соединения. Предпочтительно к 5 мкг протеина в мл добавляют от 0,001 до 0,05% (мас./об.) амфифильного соединения. Если согласно изобретению применяют денатурирующее поверхностно-активное вещество, например, такое, как додецилсульфат натрия (ДСН), это соединение можно применять только в низких концентрациях. Известно, что ДСН в высоких концентрациях денатурирует протеины, что увеличивает водорастворимость этих протеинов, но в денатурированной неактивной форме. Такие амфифильные соединения, как ДСН, в высоких концентрациях при добавлении к требуемому комплексу по изобретению также могут образовывать мицеллы, что в свою очередь увеличивает растворимость полипептида. Будет ли амфифильное соединение вызывать нежелательную денатурацию полипептида, можно легко определить методами, известными специалисту в данной области. Например, к таким методам относится определение активности, или для проверки структуры могут использоваться физико-химические методы, такие, как ИК-, КД- и флуоресцентная спектроскопия. Под водной водорастворимой фармацевтической композицией в контексте изобретения следует понимать композицию, в которой практически отсутствуют нерастворимые частицы, содержащие фармацевтически эффективный полипептид. В частности, под водной фармацевтической композицией в контексте изобретения следует понимать композицию, в которой отсутствует заметное помутнение. Получение таких растворимых композиций возможно, когда ионный комплекс по изобретению является полностью водорастворимым при используемых концентрациях полипептида, а поверхностно-активное вещество или нерастворенный комплекс удаляют фильтрацией. Кроме того, водная композиция согласно изобретению не содержит органических растворителей. Для приготовления композиций также может оказаться необходимым растворять такие амфифильные соединения, как жирные кислоты, в небольшом количестве органического растворителя (до 5%, предпочтительно до 1% из расчета на объем композиции). Еще одним объектом изобретения является способ приготовления водной фармацевтической композиции по изобретению, который отличается тем, что фармацевтически эффективный полипептид и амфифильное соединение, которое уменьшает или по крайней мере не увеличивает водорастворимость фармацевтически эффективного полипептида, объединяют с использованием такого соотношения концентраций и при таком значении рН, чтобы с помощью ионного взаимодействия получить ионный комплекс полипептида и вспомогательного вещества. Еще одним объектом изобретения является применение фармацевтической композиции по изобретению для системного или локального лечения людей или других млекопитающих. В предпочтительном варианте осуществления в фармацевтической композиции в качестве фармацевтически эффективного полипептида применяют hedgehog-протеин. Известно, что активность hedgehog-протеинов может быть увеличена с помощью ковалентной гидрофобной модификации (заявка на европейский патент 99108032.6). Согласно изобретению неожиданно было установлено, что активность hedgehog-протеинов может быть увеличена в значительной степени при образовании ионного комплекса hedgehog-протеина с амфифильным соединением. В предпочтительном варианте получают увеличение активности hedgehog-протеина (по сравнению с рекомбинантным hedgehog-протеином, который продуцируется Е. coil) в 10 или более раз. Таким образом, предпочтительным объектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая такой комплекс hedgehog-протеина с амфифильным соединением, который получен с помощью ионных взаимодействий и в котором соединение присутствует в концентрации, которая уменьшает или по крайней мере не увеличивает растворимость указанного hedgehog-протеина. Под hedgehog-протеинами (hh-протеины) понимают семейство секретируемых сигнальных протеинов, которые ответственны за образование многочисленных структур в эмбриогенезе [J.C. Smith, Cell 76 (1994), 193-196, N. Perrimon, Cell 80 (1995), 517-520, С. Сhiang и др., Nature 83 (1996), 407, M.J. Bitgood и др., Curr. Biol. 6 (1996), 296, A. Vortkamp и др.. Science 273 (1996), 613, C.J. Lai и др., Development 121 (1995), 2349]. В процессе их биосинтеза после отщепления сигнальной последовательности и автокаталитического расщепления образуются N-концевой домен с молекулярной массой 20 кДа и С-концевой домен с молекулярной массой 25 кДа. N-концевой домен встречающегося в естественных условиях протеина модифицируют с помощью холестерина и пальмитоила [J. A. Porter и др., Science 274 (1996), 255-259, и Pepinski и др., J. Biol. Chem. 273 (1998), 14037-14045] . В высших жизненных формах семейство hh включает по меньшей мере три представителя, а именно, sonic, indian и desert hh [Shh, Ihh, Dhh; M. Fietz и др., Development (Suppl.) (1994), 43-51]. Наблюдали различие в активности hedgehog-протеинов, полученных с помощью метода рекомбинантной ДНК в прокариотических и эукариотических организмах [M. Hynes и др., Neuron 15 (1995), 35-44, и Т. Nakamura и др., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237 (1997), 465-469]. Особенно предпочтительно использовать sonic, indian или desert hh [Fietz M. и др., Development (Suppl.) (1994), 43-51]. Предпочтительно использовать hh-протеин с последовательностью, которая приведена в базе данных EMBL под номером L38518. Аминокислотные последовательности hedgehog-протеинов обладают ярко выраженной гомологией, и поэтому для экспрессии предпочтительно следует использовать те нуклеиновые кислоты, которые кодируют hedgehog-протеины, проявляющие 80%-ную или более высокую гомологию с вышеуказанной последовательностью sonic hedgehog-протеина. Предпочтительно использовать hedgehog-протеины, например, описанные в WO 99/28454 и в европейской заявке на патент 99108032.6. Предшественник sonic hedgehog-протеина человека состоит из аминокислот 1-462 последовательности, которая приведена в базе данных EMBL под номером L38518. Аминокислоты 1-23 представляют собой сигнальный пептид, аминокислоты 24-197 представляют собой зрелый сигнальный домен, аминокислоты 32-197 представляют собой сигнальный домен, укороченный на 8 аминокислот, а аминокислоты 198-462 представляют собой аутопроцессированный С-концевой домен после аутопротеолитического расщепления. Фармакологический эффект hedgehog-протеина предпочтительно заключается в воздействии на нервные клетки, предпочтительно остеогенез и/или остеоиндуцирование и особенно предпочтительно хондрогенез и/или индуцирование хондрогенеза, как это описано у Kinto и др. в FEBS Letters, 404 (1997), 319-323, в отношении индуцирования костной ткани, у Miao и др. в J. Neurosci. 17 (1997), 5891-5899, в отношении воздействия на нервные клетки, и у Stott и др. в J. Cell Sci. 110 (1997), 2691-2701, в отношении индуцирования хрящевых клеток. Для изготовления матриц-носителей, которые покрыты или в которые вводят комплексы по изобретению таким образом, чтобы при локальном применении они проявляли требуемый фармацевтический эффект, необходимы растворы hedgehog-протеинов в высоких концентрациях. Было установлено, что фармацевтически приемлемые носители предпочтительно должны содержать hedgehog-протеин в концентрации 0,1-10 мг/мл носителя или выше. Hedgehog-протеинам свойственна низкая растворимость. Однако неожиданно было установлено, что в растворах, которые содержат аргининовые или аргининиевые ионы, растворимость hedgehog-протеинов резко возрастает и улучшается стабильность hedgehog-протеинов в низких концентрациях (<1 мг/мл или ниже). Таким образом, предпочтительно добавлять аргининовые или аргининиевые ионы в водные растворы и в носитель, связанный с комплексом. В контексте настоящего изобретения под понятием "активность hedgehog-протеина" понимают активность щелочной фосфатазы (стимуляция экспрессии щелочной фосфатазы), которую полипептид способен индуцировать в клетках млекопитающих (активность в испытании с щелочной фосфатазой). Согласно этому методу линию клеток фибробластов мыши культивируют в среде, которая содержит фетальную телячью сыворотку. Затем добавляют образец, стерилизованный фильтрацией, по истечении примерно 5 дней клетки лизируют и в клеточном лизате путем расщепления хромогенного субстрата (п-НФ, пара-нитрофенол) определяют щелочную фосфатазу [J. Asahina, Exp. Cell. Res. 222 (1996), 38-47, и Т. Nakamura (1997)]. Фармацевтическая композиция согласно изобретению включает фармакологически эффективную дозу hh-протеина и может применяться системно или предпочтительно локально. Предпочтительно применять протеины по изобретению в комбинации с другими протеинами из hedgehog-семейства или с факторами роста кости, такими, как морфогенетические костные протеины (BMP) [Wozney и др., Cell Mol. Biol. of Bone, Bone Morphogenetic Proteins and their Gene Expression (1993) Academic Press Inc., 131-167)], или с паратиреоидными гормонами [Karablis и др., Genes and Development 8 (1994), 277-289)], или с инсулинподобными факторами роста (IGF-I или II), или с семейством трансформирующих факторов роста [TGF-, фактор роста и развития (GDF)]. Эти другие протеины могут присутствовать в комплексах по изобретению, но могут и не присутствовать в них. Таким образом, еще одним объектом изобретения является способ приготовления предпочтительно водорастворимой фармацевтической композиции hedgehog-протеина путем объединения hedgehog-протеина с амфифильным соединением в условиях, которые позволяют образоваться ионному комплексу hedgehog-протеина с амфифильным соединением. Объектом изобретения также является применение комплекса hedgehog-протеина по изобретению для приготовления фармацевтической композиции, в которой этот комплекс используют в качестве основного компонента композиции и необязательно объединяют с приемлемыми дополнительными фармацевтическими вспомогательными веществами, предпочтительно в забуференном водном растворе. В еще одном предпочтительном варианте осуществления комплекс hedgehog-протеина по изобретению присутствует в виде смеси растворенной и осажденной форм или только в осажденной форме, которая дает возможность замедлить высвобождение hedgehog-протеина или использовать его для локального нанесения на место действия in vivo. Из этой смеси высвобождение протеина в месте действия происходит медленнее по сравнению с полностью растворенной фармацевтической препаративной формой. Согласно еще одному из предпочтительных вариантов при приготовлении фармацевтической композиции целесообразно добавлять вспомогательные вещества, такие, как хлорид натрия, сахара (маннит, сахароза, лактоза, глюкоза, трегалоза, предпочтительно в концентрации 20-100 мг/мл) или аминокислоты, такие, как глицин или аргинин, метионин, цистеин, а также антиоксиданты, такие, как ЭДТК, цитраты, тиоглицерин, ацетилцистеин, полиэтиленгликоль (1-10 мас.%), противовоспалительные средства, местные анестезирующие средства, антибиотики и/или стабилизаторы. В еще одном предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция hedgehog-протеина согласно изобретению предпочтительно содержит сурамин, что позволяет использовать ее более эффективно. Фармацевтическая композиция может содержать дополнительные фармацевтические вспомогательные вещества и предпочтительно является лиофилизированной. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит hedgehog-протеин в концентрации 0,1-10 мг/мл, предпочтительно 0,1-5 мг/мл. В предпочтительном варианте фармацевтическая композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый буфер, который является биологически совместимым, предпочтительно в диапазоне значений рН от 4 до 10, особенно предпочтительно в диапазоне значений рН от 6 до 8. Предпочтительная концентрация буфера составляет от 10 до 500 ммолей/л, более предпочтительно от 10 до 100 ммолей/л. Целесообразно выбирать такие концентрации солей, чтобы они не оказывали влияния на образование комплекса вследствие высокой ионной силы. В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит комплекс по изобретению, введенный в носитель, который является биологически совместимым и может, например, использоваться в качестве имплантата. Носитель предпочтительно представляет собой полимер, который

- не денатурирует hedgehog-протеин при введении в носитель,

- имеет среднюю молекулярную массу по крайней мере 10000 Да. Такие полимеры представляют собой, например, гиалуроновую кислоту, коллаген, альгинат или органические полимеры, такие, как ПМГК (сополимер полимолочной и гликолевой кислоты) или их производные. Если комплекс введен в носитель, то не обязательно, чтобы комплекс был полностью растворим в растворе, что является целесообразным для описанной выше водной фармацевтической композиции. В случае, когда связанный с носителем комплекс, предпочтительно в виде комплекса hedgehog-полипептида, используют для локальной терапии на костях или хрящах, протеин медленно высвобождается из комплекса в растворимой форме, оказывая при этом требуемое биологическое действие. Еще одним объектом изобретения является применение фармацевтической композиции по изобретению, которая иммобилизована (обратимо связана с носителем) на биологически совместимом носителе, для локальной терапии человека или животных. Такие биологически совместимые носители представляют собой, например, гиалуроновую кислоту, коллаген, альгинат или органические полимеры, такие, как ПМГК или их производные. Комплекс по изобретению предпочтительно локализован на биологически совместимом носителе, причем носитель может in vivo локально высвобождать комплекс в активной форме. Такие композиции особенно пригодны для устранения дефектов кости и хряща, но также могут применяться для устранения дефектов нейронов или для осуществления системного действия. Фармацевтическая композиция по изобретению предпочтительно содержит полимер, который в основном действует в качестве структурного вещества, выполняя также адгезионную функцию в отношении клеток. Таким структурным веществом является, например, коллаген. В еще одном предпочтительном варианте осуществления фармацевтическую композицию по изобретению применяют для уменьшения системных побочных действий вне нужного места действия при локальной обработке. Локальное применение фармацевтически эффективного полипептида, который не полностью иммобилизован или не имеет очень короткого времени полужизни, может привести к распространению полипептида или по крайней мере его части за пределы нужного места действия, где он может вызывать нежелательные системные действия. При реализации изобретения эти нежелательные системные действия могут быть в значительной степени уменьшены или даже исключены. Способ пригоден для полипептидов, активность которых в ионном комплексе повышается в 10 или более раз по сравнению с некомплексной формой, причем комплекс обладает более низкой растворимостью в забуференном водном растворе по сравнению с полипептидом, когда он не входит в комплекс. Такие полипептиды предпочтительно представляют собой hedgehog-протеины, цитокины и факторы роста, такие, как NGF. Согласно способу по изобретению ионный комплекс полипептида и амфифильного соединения предпочтительно применяют локально в таком количестве, чтобы входящий в комплекс полипептид обладал активностью, соответствующей его терапевтической дозе (эффективной дозе) in vivo. Количество комплекса должно быть выбрано таким образом, чтобы при диссоциации комплекса, что, например, происходит при его разбавлении в 10-20 раз в физиологических условиях, например, в крови, активность полипептида составляла только 20% или менее от терапевтической дозы. Поэтому при такой локальной обработке комплексом по изобретению фармацевтически эффективный полипептид полностью проявляет свое терапевтическое действие локально в требуемом месте действия, например, в отношении роста кости, когда полипептид представляет собой фактор роста кости, или такое, как цитостатическое или апоптозиндуцирующее действие, когда полипептид представляет собой уничтожающий опухолевые клетки агент. Когда комплекс диффундирует от места действия, он разбавляется в физиологических условиях, превалирующих вне места действия, что приводит к его диссоциации. Результатом этого является уменьшение концентрации входящего в комплекс полипептида и увеличение концентрации не входящего в комплекс полипептида. Поскольку активность не входящего в комплекс полипептида значительно меньше, чем активность входящего в комплекс полипептида, его терапевтический эффект также снижается вне места действия. Еще одним объектом изобретения является применение фармацевтической композиции по изобретению для локальной обработки людей, отличающееся тем, что комплекс вносят в таком количестве, чтобы входящий в комплекс полипептид обладал активностью, соответствующей его терапевтической дозе, причем такое же количество полипептида в некомплексной форме должно обладать активностью, составляющей 20% или менее от активности терапевтической дозы. Кроме того, объектом изобретения является способ приготовления фармацевтической композиции для локальной обработки людей, отличающийся тем, что комплекс фармацевтически эффективного полипептида и амфифильного соединения, образованный в результате ионного взаимодействия, используют в качестве основного компонента, в котором соединение присутствует в концентрации, которая ухудшает водорастворимость фармацевтически эффективного полипептида, и комплекс вносят в количестве, в котором входящий в комплекс полипептид обладает активностью, соответствующей его терапевтической дозе, в то время как такое же количество не входящего в комплекс полипептида обладает активностью, составляющей 20% или менее от активности терапевтической дозы. Ниже изобретение более подробно проиллюстрировано на примерах, не ограничивающих его объем, со ссылкой на публикации и чертежи, при этом объем изобретения определяется только формулой изобретения. Описанные методы следует рассматривать только как примеры, которые, тем не менее, иллюстрируют сущность изобретения даже при условии внесения в них соответствующих модификаций. Описание чертежей

На фиг. 1 показана зависимость индукции щелочной фосфатазы с помощью shh от возрастающих концентраций дезоксихолата, полученная в опытах на клетках. На фиг. 2 показана зависимость образования агрегата от концентрации дезоксихолата. Пример 1

Анализ активности различных композиций hedgehog-протеинов в опыте на клетках

Индукция щелочной фосфатазы

5000 клеток мезенхимальной плюрипотентной клеточной линии С3Н10Т1/2 (АТСС СС1-226) мыши высевают в каждую лунку 96-луночного микротитрационного планшета. Клетки культивируют в среде DMEM (среда Игла, модифицированная по методу Дульбекко), содержащей 2мМ глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС). На следующий день среду заменяют средой, содержащей человеческий shh (0, 5 или 50 мкг/мл) в различных композициях (0, 0,00016, 0,00052, 0,0013, 0,0019 или 0,01% дезоксихолата (ДХ) натрия), или непосредственно добавляют различные композиции hedgehog-протеинов. Опыт прекращают через 5 дней. Для этой цели надосадочные жидкости сливают и клетки однократно промывают с помощью ЗФР. Клетки лизируют в 50 мкл 0,1%-ного Тритона Х-100 и замораживают при -20oС. После оттаивания аликвоты по 25 мкл используют для определения протеина и для определения активности щелочной фосфатазы. Определение протеина согласно инструкциям фирмы-производителя Pierce:

К смеси добавляют 75 мкл дважды дистиллированной воды, затем добавляют 100 мкл реагента на протеин ВСА (Pierce Micro BCA, 23225). Через 60 мин определяют абсорбцию при 550 нм. Определение активности щелочной фосфатазы согласно инструкциям фирмы-производителя Sigma:

К смеси добавляют 100 мкл реакционного буфера (Sigma 221). Капсулу с субстратом (Sigma 104-40) растворяют в 10 мл воды и затем пипеткой добавляют 100 мкл в тестируемую смесь. Измеряют абсорбцию при 405 нм. В процессе реакции щелочная фосфатаза превращает пара-нитрофенилфосфат в пара-нитрофенол (п-НФ). С помощью стандартных кривых по величинам абсорбции определяют количество нмолей п-НФ. Активность различных композиций hedgehog-протеинов в нмолях п-НФ/мин/мг протеина представлена на фиг. 1. Установлено, что при одних и тех же концентрациях протеина активность оцененных композиций hedgehog-протеинов значительно увеличивается при повышении концентраций дезоксихолата (ДХ). Пример 2

Титрование гидрофобной пары, включающей hshh (димер)

Рекомбинантный человеческий sonic hedgehog-протеин (димер, 0,8 мг/мл в 50мМ трис-HCl, рН 7,4 или в 0,1%-ном Твине 80, 50мМ трис-HCl, рН 7,4) смешивают с возрастающими концентрациями дезоксихолата натрия. В качестве индикатора мутности (образование водонерастворимых агрегатов, состоящих из ионных комплексов протеина и поверхностно-активного вещества) измеряют абсорбцию при 360 нм. На фиг. 2 видно, что переход в водонерастворимые агрегаты происходит при концентрации Na-дезоксихолата выше примерно 0,04%. Образование водонерастворимых агрегатов может быть в значительной степени предотвращено в присутствии 0,1%-ного Твина 80. Установленные величины абсорбции не скорректированы для разбавления. Пример 3

Анализ включающих NGF (фактор роста нервной ткани) композиций с помощью определения биологической активности

Опыт по определению роста нейронов спинномозговых узлов

Биологическую активность NGF определяют in vitro путем морфометрического анализа роста нейронов спинномозговых узлов (СМУ). В целом этот анализ состоит в том, что вырезают поясничные СМУ у эмбрионов цыплят Е7-Е8, освобождают от окружающей соединительной ткани и измельчают растиранием с помощью пастеровской пипетки с оплавленным концом с последующим разложением 0,1%-ным трипсином в течение 20 мин при 37oС. Загрязняющие клетки, такие, как фибробласты, удаляют в результате предварительного культивирования в течение 2 ч всего клеточного препарата в пластиковых чашках для культуры ткани. В этих условиях нейроны не присоединяются к субстрату, в то время как фибробласты и другие клетки, не являющиеся нейронами, прилипают к пластиковой поверхности чашек для культуры ткани. "Чистые" нейроны получают путем сбора надосадочной жидкости и высевают в пластиковые чашки (48 лунок), покрытые полиорнитином/ламинином, с плотностью 10000 клеток/лунку в среду Хама F14, содержащую 5% ФБС. Титрованием с использованием концентраций NGF в диапазоне приблизительно от 1 пг/мл до 15 нг/мл получают кривую зависимости активности NGF от дозы. Нейротрофическую активность оценивают количественно путем подсчета жизнеспособных дифференцированных нейронов, у которых после инкубации в течение 48 ч с разными композициями, включающими NGF, развиваются нейриты, превышающие более чем в 2 раза диаметр перикариона. Результаты выражают в виде зависимости полученного по двум опытам среднего количества дифференцированных нейронов от концентрации NGF в тестируемой композиции, и для нескольких различных композиций определяют концентрацию NGF, которая обладает стимулирующей активностью, составляющей 50% от максимального значения (ЕС50). Значения стимулирующей активности, составляющей 50% от максимального значения (ЕС50), различных композиций NGF

Композиция - ЕС50 (пг/мл)

NGF (без добавок) - 75

NGF (0,006% дезоксихолата натрия) - 17

NGF (0,02% дезоксихолата натрия) - 10

Эти данные ясно показывают, что удельная активность NGF возрастает в композициях, которые содержат добавку амфифильного соединения (в данном случае дезоксихолата натрия). Пример 4

Фармацевтические композиции на основе дезоксихолата

Для приготовления фармацевтической композиции 100 мл водного раствора, содержащего 5 мг/мл или 1 мг/мл Hshh (человеческий sonic hedgehog-протеин) в 50 ммолях/л трис-буфера, рН 7,4, подвергают диализу в противотоке раствора композиции без дезоксихолата в течение 24 ч при 4oС. После диализа из маточного раствора добавляют при перемешивании дезоксихолат натрия, получая водную фармацевтическую композицию, в растворе которой содержится 1 мг/мл или 5 мг/мл Hshh. Раствор стерилизуют фильтрацией и хранят при 4oС. Для инъекции человеку или животному используют от 0,05 до 2 мл раствора. 4.1. Композиция hedgehog-протеина с повышенной в результате ионного взаимодействия гидрофобностью в водном забуференном фосфатом физиологическом растворе (низкая концентрация дезоксихолата натрия)

Раствор композиции:

NaCl - 150 ммолей/л

Натрий-фосфатный буфер - 10 ммолей/л

Дезоксихолат натрия - 0,05% (мас./об.)

рН - 7,4

4.2. Композиция hedgehog-протеина с повышенной в результате ионного взаимодействия гидрофобностью в водном забуференном фосфатом физиологическом растворе (высокая концентрация дезоксихолата натрия)

Раствор композиции:

NaCl - 150 ммолей/л

Натрий-фосфатный буфер - 10 ммолей/л

Дезоксихолат натрия - 0,1% (мас./об.)

pН - 7,4

4.3. Композиция hedgehog-протеина с повышенной в результате ионного взаимодействия гидрофобностью в фосфатном буфере с низкой ионной силой (низкая концентрация дезоксихолата натрия)

Раствор композиции:

NaCl - 30 ммолей/л

Калий-фосфатный буфер - 20 ммолей/л

Дезоксихолат натрия - 0,05% (мас./об.)

рН - 6,5

4.4. Композиция hedgehog-протеина с повышенной в результате ионного взаимодействия гидрофобностью в фосфатном буфере с низкой ионной силой (высокая концентрация дезоксихолата натрия)

Раствор композиции:

NaCl - 30 ммолей/л

Калий-фосфатный буфер - 20 ммолей/л

Дезоксихолат натрия - 0,1% (мас./об.)

рН - 6,5

Пример 5

Фармацевтические композиции hedgehog-протеина с повышенной в результате ионного взаимодействия гидрофобностью в забуференном фосфатом физиологическом растворе, содержащем липиды, жирные кислоты или стероиды

Для приготовления фармацевтической композиции 100 мл водного раствора, содержащего 1 мг/мл или 2 мг/мл Hshh в 50 ммолях/л трис-буфера, рН 7,4, подвергают диализу в противотоке раствора композиции без липида, жирной кислоты или холата в течение 24 ч при 4oС. После диализа из маточного раствора добавляют при перемешивании 0,01 г фосфатидата, 0,01 г фосфатидилсерина, 0,01 г пальмитата, 0,05 г холата, 0,05 г тауродезоксихолата или 0,05 г таурохолата, получая водную фармацевтическую композицию, в растворе которой содержится 1 мг/мл или 2 мг/мл Hshh. Раствор стерилизуют фильтрацией и хранят при 4oС. Для инъекции человеку или животному используют от 0,05 до 2 мл раствора. Раствор композиции:

NaCl - 150 ммолей/л

Натрий-фосфатный буфер - 10 ммолей/л

Фосфатидат - 0,01% (мас./об.)

рН - 7,4

Раствор композиции:

NaCl - 100 ммолей/л

Натрий-фосфатный буфер - 10 ммолей/л

Фосфатидилсерин - 0,01% (мас./об.)

рН - 7,4

Раствор композиции:

NaCl - 150 ммолей/л

Натрий-фосфатный буфер - 20 ммолей/л

Пальмитат натрия - 0,01% (мас./об.)

рН - 7,4

Раствор композиции:

NaCl - 150 ммолей/л

Натрий-фосфатный буфер - 10 ммолей/л

Холат натрия - 0,05% (мас./об.)

рН - 7,4

Раствор композиции:

NaCl - 100 ммолей/л

Натрий-фосфатный буфер - 10 ммолей/л

Тауродезоксихолат натрия - 0,05% (мас./об.)

рН - 7,4

Раствор композиции:

NaCl - 150 ммолей/л

Натрий-фосфатный буфер - 20 ммолей/л

Таурохолат натрия - 0,05% (мас./об.)

pН - 7,4

Пример 6

Фармацевтические композиции костного морфогенетического протеина (BMP-2) с повышенной в результате ионного взаимодействия гидрофобностью в аргининовом буфере

Для приготовления фармацевтической композиции 100 мл водного раствора, содержащего 0,4 мг/мл ВМР-2, подвергают диализу в противотоке 500 ммолей/л аргинина в 10 ммолях/л калий-фосфатного буфера, рН 6,0, в течение 24 ч при 4oС. После диализа из маточного раствора добавляют при перемешивании 0,01 г пальмитата или 0,05 г дезоксихолата или тауродезоксихолата, получая водную фармацевтическую композицию, в растворе которой содержится 0,4 мг/мл BMP. Раствор стерилизуют фильтрацией и хранят при 4oС. Для инъекции человеку или животному используют от 0,05 до 2 мл раствора. Раствор композиции:

Аргинин - 500 ммолей/л

Калий-фосфатный буфер - 10 ммолей/л

Дезоксихолат натрия - 0,05% (мас./об.)

рН - 6,0

Раствор композиции:

Аргинин - 500 ммолей/л

Калий-фосфатный буфер - 10 ммолей/л

Пальмитат натрия - 0,01% (мас./об.)

рН - 6,0

Раствор композиции:

Аргинин - 500 ммолей/л

Калий-фосфатный буфер - 10 ммолей/л

Тауродезоксихолат натрия - 0,05% (мас./об.)

рН - 6,0

Пример 7

Фармацевтические композиции интерлейкина-2 с повышенной в результате ионного взаимодействия гидрофобностью в забуференном фосфатом физиологическом растворе

Для приготовления фармацевтической композиции 100 мл водного раствора, содержащего 1 или 2 млн ед. интерлейкина-2 в 50 ммолях/л трис-буфера, рН 7,4, подвергают диализу в противотоке раствора композиции без амфифильного соединения в течение 24 ч при 4oС. После диализа из маточного раствора добавляют при перемешивании 0,05 г дезоксихолата, 0,01 г фосфатидилсерина или 0,01 г пальмитата натрия, получая водную фармацевтическую композицию, в растворе которой содержится 1 или 2 млн ед. интерлейкина-2. Раствор стерилизуют фильтрацией и хранят при 4oС. Для инъекции человеку или животному используют от 0,05 до 2 мл раствора. Раствор композиции:

NaCl - 150 ммолей/л

Натрий-фосфатный буфер - 10 ммолей/л

Дезоксихолат - 0,05% (мас./об.)

pН - 7,4

Раствор композиции:

NaCl - 150 ммолей/л

Натрий-фосфатный буфер - 10 ммолей/л

Фосфатидилсерин - 0,01% (мас./об.)

рН - 7,4

Раствор композиции:

NaCl - 150 ммолей/л

Калий-фосфатный буфер - 20 ммолей/л

Пальмитат натрия - 0,01% (мас./об.)

рН - 7,4

Пример 8

Фармацевтические композиции интерферона-альфа с повышенной в результате ионного взаимодействия гидрофобностью в забуференном фосфатом физиологическом растворе

Для приготовления фармацевтической композиции 100 мл водного раствора, содержащего 4 или 40 миллионов ед. интерферона-2b в 50 ммолях/л трис-буфера, рН 7,4, подвергают диализу в противотоке раствора композиции без амфифильного соединения в течение 24 ч при 4oС. После диализа из маточного раствора добавляют при перемешивании 0,05 г дезоксихолата, 0,01 г фосфатидилсерина или 0,05 г тауродезоксихолата, получая водную фармацевтическую композицию, в растворе которой содержится 4 или 40 млн ед. интерферона-2b. Раствор стерилизуют фильтрацией и хранят при 4oС. Для инъекции человеку или животному используют от 0,05 до 2 мл раствора. Раствор композиции:

NaCl - 150 ммолей/л

Натрий-фосфатный буфер - 10 ммолей/л

Дезоксихолат - 0,05% (мас./об.)

pН - 7,4

Раствор композиции:

NaCl - 100 ммолей/л

Натрий-фосфатный буфер - 10 ммолей/л

Фосфатидилсерин - 0,01% (мас./об.)

рН - 7,4

Раствор композиции:

NaCl - 150 ммолей/л

Калий-фосфатный буфер - 20 ммолей/л

Тауродезоксихолат натрия - 0,05% (мас./об.)

рН - 7,4

Пример 9

Фармацевтические композиции человеческого NGF с повышенной в результате ионного взаимодействия гидрофобностью в ацетатных буферах

Для приготовления фармацевтической композиции к 100 мл водного раствора, содержащего 1 или 2 мг/мл человеческого NGF в 100 ммолях/л натрий-ацетатного буфера, рН 6,0, добавляют при перемешивании 0,05 г дезоксихолата, 0,01 г фосфатидата или 0,05 г тауродезоксихолата, получая водные фармацевтические композиции. Раствор стерилизуют фильтрацией и хранят при 4oС. Для инъекции человеку или животному используют от 0,05 до 2 мл раствора. Раствор композиции:

Человеческий NGF - 1 мг/мл

Натрий-ацетатный буфер - 100 ммолей/л

Дезоксихолат - 0,05% (мас./об.)

рН - 6,0

Раствор композиции:

Человеческий NGF - 2 мг/мл

Натрий-ацетатный буфер - 100 ммолей/л

Фосфатидат - 0,01% (мас./об.)

рН - 6,0

Раствор композиции:

Человеческий NGF - 1 мг/мл

Натрий-ацетатный буфер - 100 ммолей/л

Тауродезоксихолат натрия - 0,05% (мас./об.)

рН - 6,0

Пример 10

Получение альгинатного геля, содержащего hedgehog-протеины

Аликвоту раствора композиции из примера 4.1 перемешивают с 1%-ным (мас. /об. ) маточным водным раствором альгината натрия (фирма Pronova Biopolymer, Норвегия) таким образом, чтобы получить гелеобразную смесь альгината и протеина. Этот гель непосредственно используют в качестве инъецируемой матрицы в количестве от 0,05 до 2 мл. Пример 11

Получение коллагеновой смеси, содержащей BMP-2

100 мкл одного из растворов композиций из примера 6 добавляют по каплям на тампоны из коллагена (фирма Helistat, Integra Life Science, США) размером 10103 мм. Затем обработанные носители замораживают (-70oС) и подвергают лиофилизации. Тампон используют локально для заживления переломов кости.

Формула изобретения