СПИСОК ПАТЕНТОВ С УПОМИНАНИЕМ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ
-
- 2017751 Способ получения гиалурона
- 2192150 БАД для профилактики йодной недостаточности
- 2112542 Препарат для лечения патологий соединительных тканей
- 2225206 Препарат для лечения рака молочной железы
- 2299733 Лечение опорно-двигательного аппарата
- 2299732 Способ лечения глаукомы
- 2299726 Противоинфекционная губная помада
- 2299725 Косметическое средство для ухода за кожей
- 2198878 Ароматическое соединение
- 2198702 Способ подготовки трофических язв к аутодермапластике
- 2198653 Вагинальные суппозитории
- 2197946 Композиция для ухода за волосами
- 2197923 Фармацевтическая композиция для лечения отеков роговицы
- 2298410 Биотрансплантант и способ лечения ревматических и аутоиммунных заболеваний
- 2197501 Фотоотверженный гель на основе сшитой гиалуроновой кислоты
- 2197228 Твердые лекарственные формы
- 2197222 Водная компазиция для ухода за волосами, лица и тела
- 2297425 Полипептиды
- 2297240 Композиция с гиалуроновой кислотой
- 2297230 Фармацевтическая компазиция с ксантоновой смолой
- 2196588 Глазные капли
- 2195955 Применение биологически активных веществ
- 2195926 Дерматологические композиции
- 2295954 Микрочастицы для доставки нуклеиновых кислот
- 2295951 Косметика для ухода за кожей лица и век
- 2195262 Фармакологическое средство на основе гиалуроновой кислоты
- 2194512 Способ профилактики и коррекции процесса старения кожи
- 2194478 Лечение экземы
- 2294716 Расширяемый стент
- 2194055 Сшитые сополимеры
- 2099350 Ассоциаты депротонированной гиалуроновой кислоты
- 2293557 Средство для лечения кожи и слизистых
- 2292878 Приготовление микроцастиц, содержащих метопропол
- 2292746 БАД
- 2192256 Защита кишечника
- 2191782 Получение модифицированной гиалуроновой кислоты
- 2292219 Паратиреоидный гормон человека
- 2291686 Микроцастицы
- 2191000 Косметическая маска
- 2290921 Фармацевтические и косметические средства против старения кожи
- 2290900 Модифицированный биоматериал для использования в офтальмологии
- 2290899 Получение биоматерьяла
- 2290397 Новые инданилиденовые соединения
- 2290186 Лечение сирингомиелии
- 2288702 Иррингационный раствор для офтальмологии
- 2288699 Гель для лечения стоматологических заболеваний
- 2188011 Активирующая остеогенез фармацевтическая композиция
- 2187327 Средство с антисептиком
- 2187325 Средство с радиопротекторным действием
- 2287330 Композиции миноксидила
- 2186786 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2186593 Лечение раненого процесса кожи
- 2286801 Очищение воды
- 2286781 Лечение ожогов пищевода у детей
- 2286764 Средство лечения воспалений полости рта
- 2185840 Лечение инфекционных заболеваний
- 2286151 Альфа-2-Дельта-Лиганда
- 2185149 Ранозаживляющий гель
- 2285527 Лечение ИЛ-6 заболеваний
- 2184448 Раствор хранения роговицы, включающий гиалуроновую кислоту
- 2090179 Крем для кожи
- 2183961 Способ лечения кожи
- 2284331 Соли алифотических аминов
- 2284187 Производные амида
- 2089191 Снизить внутрение давление
- 2283320 Получение гликозаминогликанов
- 2283129 Лечение опухолей
- 2283098 Косметические средства с Q
- 2182574 Ароматические соединения
- 2088257 Средство с гипохолестеролемическим действием
- 2088218 Состав для гигиенических салфеток
- 2088206 Способ получения препарата, создающего исскуственный загар
- 2282462 Противомикробные средства
- 2182008 Интровагинальная компазиция
- 2181999 Препарат с отсроченным высвобождением
- 2181998 Новые композиции липидов
- 2181995 Лечение болевого синдрома
- 2181295 Вирионная вакцина
- 2087144 Витамин Е
- 2379336 Способ стирки
- 2379052 Вакцинация
- 2180855Композиция в виде ионного комплекса
- 2379025 Противоинфекционный гель
- 2180825 Лечение травм роговицы
- 2281082 Способ коррекции эстетических и возрастных проблем кожи
- 2180576 Биоактивная добавка для косметических средств
- 2280459 Средство для изменения скорости роста или репродукции клеток
- 2179981 Соли переходного металла
- 2378010 Жидкие вакцины
- 2378008 Комбинированные вакцины
- 2378007 Анаболическое средство
- 2377973 Растительные экстракты
- 2280041 Способ получения водорастворимых комплексов гиалурил
- 2280038 Биополимеры
- 2323733 Йодный обмен
- 2377260 Гель
- 2178693 Противовирусное средство на основе гиалуроновой кислоты
- 2178692 Облегчающие зуд косметическое средство
- 2377022 Гемостатические спреи
- 2376982 Увлажняющая сыворотка для лица
- 2376974 Трансдермальный гель для лица
- 2362784 Гипо-и гиперацетилированные менингокковые капсульные сахариды
- 2177789 Устройство для доставки лекарства к шейке матки
- 2277954 Крем для лица омолаживающий
- 2376378 Способ получения метионина
- 2177332 Биоматериал для предотвращения послеоперационных спаек, с производной гиалуроновой кислотой
- 2177310 Способ получения таблеток
- 2376011 Средство для позвоночника
- 2277410 Косметическое средство
- 2323748 Медицинская повязка
- 2276998 Гидрогелевые композиции
- 2082416 Способ получения препарата с коллагенном из животного сырья
- 2375081 Адсорбирующее изделие
- 2375049 Охлаждающий пластырь
- 2346049 Способ получения гиалурона
- 2275913 Фармацевтические средства
- 2174985 Полисахарид с антиоксидантом
- 2373957 Носитель для лекарственных средств и биологически активных веществ
- 2373941 Способ коррекции возрастных и патологических изменений кожных покров
- 2174845 Композиции и способы доставки генетического материала
- 2174830 Средство для укрепления волос
- 2373769 Синбиотическая композиция
- 2274472 Лечение апорно-двигательного аппарата и болевых синдромов
- 2372929 Профилактическая композиция на основе веществ фенольной природы в липосомной форме
- 2173563 Способ нанесения на поверхность предметов покрытия на основе гиалуроновой кислоты, её производных и полусинтетических полимеров
- 2079304 фармацевтическая композиция, обладающая иммуносупрессорной и антимикробной активностью
- 2273645 Полипептид ожирения
- 2173154 Фракция кератансульфатолигосахаридов и содержащий ее фармацевтический препарат
- 2173136 Грязная мазь
- 2173128 Способ хирургического лечения центральных разрывов сечатки
- 2078561 Косметическое средство предотвращающее старение кожи
- 2172490 Способ прогнозирования воспалительных заболеваний молочной железы при эндопластике
- 2272645 Способ лечения ЦМВ-Инфекции у детей раннего возроста
- 2272636 Фармацевтическая композиция для местного лечения воспаления
- 2272635 Фармацевтически активная субстанция для офтальмологии
- 2272599 Биоматерьял для стабилизации прогрессирующей миопии "Коллаплант"
- 2172168 Средство для заживления ран на основе гиалуроновой кислоты
- 2371172 Фармацевтическая композиция для лечения нервной системы на основе стефаглабрина
- 2171470 Способ прогнозирования послеоперационной трансформации доброкачественных опухолей нервной системы
- 2077317 Состав для ванн
- 2271213 Комбинированные композиции, содержащие экстракты из растений и морских животных
- 2076872 Способ получения окрашенной гиалуроновой кислоты
- 2076671 Раствор для защиты роговицы
- 2370281 Конъюгаты гидроксиалкилкрахмал
- 2370275 Способ лечения (коррекции) косметических и возрастных дефектов кожи
- 2370258 Фармацевтическая композиция для парентальной доставки в форме лиофилизата
- 2270023 Способ экстракции и очистки протеогликана хрящего типа (варианты)
- 2369408 Гемостатическая композиция, включающая гиалуроновую кислоту
- 2369387 Фармацевтическая композиция для лечения нервной системы
- 2369379 Нетаблитированные жевательные формы для индивидуального введения
- 2169136 Производное коричной кислоты
- 70792 Медицинский аппликатор
- 20741717 Способ стабилизации аскорбиновой кислоты
- 2074712 Способ получения препарата, препятствующего преждевременной эякуляции
- 2367954 Способ прогнозирования развития кожной патологии у женщин с синдромом склерополикистозных яичников (СПКЯ)
- 2268075 Устройство для электрокинетической доставки
- 2268052 Средство для лечения воспалительных и дегенеративных заболеваний суставов
- 2167649 Способ получения твердой дисперсии умеренного водорастворимого лекарственного вещества
- 2167647 Гель для бритья
- 2073520 Лечение урологических инфекций
- 2367476 Биопластический материал
- 2367475 Мембрана для использования при направленной регенерации тканей
- 2367469 Фармацевтическая композиция на основе лизоамидазы
- 2367456 Фармацевтическая композиция обладающая антибактериальным и некролитическим действием
- 2367455 Фармацевтическая композиция обладающая некролитическим и антибактериальным действием
- 2267324 Применение антиадгезивных углеводов, препарат для уменьшения и /или блокирования адгезии патогенных веществ
- 2166934 Композиции включающие биологический агент
- 2166510 Псевдодипептиды
- 2366460 Композиции, имеющие высокую противовирусную и антибактериальную активность
- 2360901 Производные феноксиуксусной кислоты
- 2165749 Способ восстановления эндотелия роговицы
- 2265441 Способ укрепления склеры
- 2365382 Композиции и способы для регуляции развития сосудов
- 2070879 Соли гликозаминогликанов
- 2164914 Циклические и гетероциклические N - замещенные - иминогидроксамовые карбоновые кислоты
- 2264627 Хламидийный конъюктивит
- 2364399 Фармацевтический препарат на основе стефаглабрина
- 2264230 Препарат с замедленным высвобождением активного вещества
- 2363497 Фармацевтические композиции
- 2363496 Способ увеличения объема мягких тканей
- 2363473 Способ антифлогистической активации в эксперементе
- 2363461 Фармацевтический препарат на основе сигетина
- 2363459 Средства для введения в роговицу глаз для предотвращения офтальмологических нарушений
- 2363448 Фармацевтические композиции
- 2163123 Глазные капли
- 2162687 Усовершенствованнная лекарственная форма индуктора интерферана
- 2162343 Биосовместимый полимерный материал и способ его получения
- 2162327 Лечение рака
- 2067841 Способ получения ароматизатора
- 2161478 Способ консервированого лечения гонартроза
- 2361617 Вольфрамовые частицы в качестве рентгеноконтрастных веществ
- 2361552 Способы и устройства для дренирования жидкостей и понижения внутриглазного давления
- 2066996 Способ изготовления пленочного материала для офтальмохирургии
- 2361417 Корм с глюкозамином и экстрактом ивы для профилактики артроза у животных
- 2161002 Пищевой общеукрепляющий лечебно-профилактический продукт из хрящевой ткани акул
- 2360928 Комплексная матрица для медико-биологического применения
- 2160574 Способ лечения глаукомы
- 2360688 Способ лечения повреждений переферических нервов
- 2360670 Фармацевтическая композиция при климактерических расстройствах
- 2360646 Эндолюминальный протез
- 2260445 Способ усовершенствования транспортировки через легко прспосабливаемый полупроницаемый барьер
- 2260007 Производные амида
- 2359975 Способ получения модифицированных арабиногалактанов
- 2359974 Антигенные Пептиды
- 2159775 Псевдопептидный продукт
- 2259833 Фармацевтическая композиция для лечения роговицы глаза
- 2259816 Ранозаживляющее средство
- 2259815 Способ коррекции возрастных изменений, связанных с процессами старения кожи
- 2359706 Способ сохранения офтальмологических растворов
- 2359704 Антисептическое средство
- 2359662 Микрокапсулы
- 2159253 Катионные полимеры
- 2159111 Средство для ухода за кожей лица
- 2159105 Композиция для защиты кожи от опасных химических веществ Получение
- 2158593 Биосовместимый водный раствор
- 2358728 Способ лечения и предупреждения потери костной ткани
- 2258517 Способ хирургического лечения травмотических повреждений селезенки пленкой на основе гиалуроновой кислоты
- 2357968 Кристалические формы производной имидазола
- 2357957 Ингибиторы P38 и их применение
- 2157647 Пищевая добавка и ее получение
- 2357758 Препараты для чрескожной и чересслизистой добавки
- 2063244 Способ стабилизации растворов
- 2063140 Способ получения препарата для консервирования мяса
- 2157381 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2257198 Композиции микроцастиц
- 2356909 Белковый комплекс
- 2356570 Косметическая композиция
- 2256434 Способ закрытия перфорации барабанной перепонки
- 2356520 Способ лечения постконтузионного повреждения сечатки глаза
- 2156133 Гель
- 2255945 Полимерная композиция
- 2355761 Средства повторной дифференцировки
- 2061043 Способ повышения устойчивости урокиназы к нагреванию
- 2061005 Способ получения красителей для гистологических исследований
- 2355420 Зубная паста
- 2355385 Композиции пролонгированного действия с контролируемым высвобождением
- 2355240 Способ получения пищевого препарата хондропротекторного действия
- 2155057 Пихтово репейный бальзам
- 2354409 Способ производства высвобождающих лекарственные средчтва медицинских устройств
- 2254145 Раневое покрытие на основе коллаген-хитозанового комплекса
- 2254133 Лечение и профилактика ВИЧ-инфекции у человека
- 2253439 Фармацевтическая композиция для защиты и улучшения оптических свойств роговици при проведении эндовитреальных вмешательств
- 2253437 Способ омоложения кожи
- 2153352 Фармацевтическая композиция обладающая ранозаживляющим и противовоспалительным действием
- 2353354 Фармацевтический препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2252787 Способ получения искусственной матрицы кожи
- 2252767 Способ нормализации иммунобиохимического гомеостаза коров в предродовом и послеродовом периодах
- 2352583 Фармацевтическая композиция содержащая Fc-область иммуноглобулина в качестве носителя
- 2152403 Модифицированные полисахариды
- 2352356 Иммуногенная композиция
- 2352342 Исскусственный физиологический солевый раствор Способ его получения
- 2352330 Фармацевтический препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2352323 Фармацевтический препарат с модифицированным высвобождением
- 2152027 Способ подготовки ткани мозга для определения гликозаминогликанов
- 2251842 Интектицидный состав для борьбы с личинками оводов
- 2151580 Способ активации пролиферации эндотелия роговицы
- 2351648 Дифференцировка стромальных клеток, полученных из жировой ткани, в эндокринные клетки поджелудочной железы и их использование
- 2351595 N - гидроксиформамидные соединения в качестве ингибиторов металлопротеина
- 2251411 Косметическое средство в лиофилизированной фармацевтической форме
- 2251405 Косметика...ее композиции для косметических препаратов
- 2251367 Средство со сшитой гиалуроновой кислотой для наращивания тканей
- 2351359 Косметика для профилактики и лечения избыточной массы тела
- 2351322 Препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2351153 Диета при остеортрите собак
- 2350958 Способ определения групповой принадлежности синовальной жидкости
- 2350625 Производные гиалуроновой кислоты с пониженной биодеградируемостью
- 2150266 Крем после бритья
- 2350354 Фармацевтическое средство содержащие антагонист и фактор некроза
- 2350340 Способ коррекции процессов регенерации
- 2350309 Способ лечения избыточной массы тела с помощью рефлексотерапии
- 2250047 Профилактический продукт из хрящевой ткани гидробионтов
- 2249467 Медицинский матерьял и изделия на его основе
- 2055079 Способ получения препарата гиалуроновой кислоты
- 2349599 Биоадгезив мидии
- 2054903 Способ лечения коллагеноза у бычков на откорме
- 2249210 Способ прогнозирования предрасположенности к развитию и тяжести течения деформирующего остеоартроза коленного сустава у взрослых
- 2349339 Средство для соединительной ткани
- 2148988 Человеческий интерферона
- 2148399 Лечение атеросклероза
- 2148396 Способ определения активного вещества в дифильных мазевых основах
- 2148375 Способ диагностики близорукости
- 2348415 Способ противоспаечной терапии после хирургического вмешательства
- 2348400 Препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2348386 Способ непроникающего хирургического лечения первичной открытоугольной глаукомы
- 2248213 Лечение Галактозидальной А недостаточности
- 2347586 Микрофлюидизированные эмульсии типа "масло в воде" и вакцинные средства
- 2147243 Контрастное средство
- 2146526 Лечебный препарат дисбактериоза и урогенитальных инфекций
- 2146148 Терапевтическое применение фактора роста кератиноцитов (ФРК)
- 2146139 Способ повышения активности макрофагов и комбинации для его осуществления
- 2346277 Способ диагностики специфического синовита
- 2345793 Ультразвуковые контрастные вещества и их получение
- 2345782 Терапевтические комбинации на основе PORIFERA для лечения и предотвращения кожных заболеваний
- 2245131 Способ коррекции косметических недостатков кожи
- 2245130 Способ активации восстановительных процессов в коже
- 2144833 Хондроитиназа
- 2344809 Получение твердых дозированных форм с использованием сшитого нетермопластичного носителя
- 2244540 Косметический гель для ухода за кожей лица
- 2244536 Способ лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний тазобедренного сустава
- 2344167 Хмелевый экстракт
- 2143884 Агент регулирования дифференциации клеток кожи, культурная среда для клеток или тканей и способ регулирования дифференциации клеток кожи
- 2343932 Способ получения обладающих пониженной растворимостью в воде пленночных материалов
- 2343903 Устройство доставки лекарств для контролируемого введения препаратов
- 2048817 Способ получения материала для лечения ожогов и гнойно - некронических ран
- 2048803 Гидратантный крем
- 2242974 Средства и способы лечения воспалительных заболнваний
- 2142816 Способ получения антигерпетической вакцины
- 2342923 Средство для обработки рук с увлажняющим эффектом
- 2142781 Косметика для макияжа ресниц и бровей и агент ингирирующий рост микроорганизмов в косметических средствах
- 2242251 Трансплантируемые стенты с биоактивными покрытиями
- 2142257 Способ обработки глазных имплантантов и контакных линз
- 2342389 Мононатриевая соль
- 2342107 Способ устранения западения верхнего века при анофтальме
- 2141828 Средство, пролонгирующее эффективность чесночного порошка
- 2241489 Косметическое средство матриксных протеинов для залечивания ран
- 2241443 Средство для лечения герпеса
- 2241414 Способ получения протезов кровеносных сосудов
- 2341539 Гидрогель
- 2141324 Регулятор скорости воздействия препарата для инъекций
- 2141312 Косметическое средство для ухода за кожей лица
- 2341296 Средства и способы покрытия медицинских имплантантов
- 2341272 Средство для неспецифической иммунотерапии
- 2341266 Стенты с нанесенным покрытием содержащим N - (5-(4-(4-
- 2341257 Иммуномодулирующее средство
- 2341255 Средство для лечения климактерических расстройств
- 2240821 Способ лечения урологических инфекций
- 2140786 Способ лечения лишая
- 2140243 Способ хирургического лечения диабетической ретинопатии и отслоек сечатной оболочки
- 2240140 Медицинская многослойная повязка и изделия на ее основе
- 2240135 Культура клеток, содержащая клетки - предшественники остеонегеза, имплантант на ее основе и его использование для восстановления целостности кости
- 2240123 Экзогенные биологически активные коньюгирующие вещества
- 2139886 Фотоотвержаемое производное гликозаминогликата, сшитое производное гликозаминогликата и способы их получения, способ предотвращения клеточной и тканевой адгезии
- 2139729 Вакцина. Способ стимулирования иммунной системы
- 2339386 Средство обладающее радио - и химиозащитным действием
- 2339369 Лечение офтальмологических нарушений с использованием мочевины и ее производных
- 2139041 Гидратантный регенерирующий крем и способ его получения
- 2139039 Косметический суперкрем для ухода за кожей
- 2139017 Способ получения боисовместимого материала
- 2138503 Производные камптотецина, способы их получения, уникальное средство
- 2338556 Средство содержащие антагонист Р2Х - рецептора и нестероидное противоспалительное лекарственное средство
- 2338514 Косметическое средство для профилактики старения кожи
- 2138297 Медицинские устройства, подверженные вызываемому разложению
- 2138295 Покрытие для ран
- 2337906 Ингибиторы цитозольной фосфолипазы А2 Применение физиологически допустимого корпускулярного ферримагнитного или ферромагнитного материала. Способ формирования магнитометрического изображения
- 2137501 Устройство формирования изображения
- 2137477 Способ лечения заболеваний характеризующихся аутоиммунной агрессией
- 2137467 Крем для кожи лица и тела
- 2137449 Способ коррекции дефектов преломления в глазу млекопитающего
- 2137402 Пищевая Добавка БАД
- 2336899 Способ стимуляции миелопоэза
- 2336862 Способ получения раствора для лечения роговицы
- 2336830 Способ восстановления костных структур челюсти
- 2136696 Новый полипептид и средство против ВИЧ - Инфекции
- 2336092 Биоадгезивное средство, по существу свободное от воды
- 2336089 Средство и способ лечения заболеваний периодонтальных и пульпы
- 2336074 Средства и способы лечения заднего сегмента глаза
- 2235548 Ранозаживляющее средство
- 2135186 Способ лечения рефлекторных синдромов при остеохондрозе
- 2234945 Стабилизатор водного раствора и водосодержащего сырья
- 2334762 Растворимая ассоциативная карбоксиметилцеллюлоза
- 2234514 Макропористые хитозановые гранулы и способ их получения. Способ культивирования клеток
- 2133615 Средство для лечения неврологических заболеваний
- 2233164 Способ профилактики развития послеоперационных спаек брюшной полости
- 2133127 Неткатный материал, способ его получения и способ лечения
- 2333223 Альдегидные производные сиаловой кислоты и средства на их основе
- 2333007 Полипептидные вакцины для широкой защиты против рядов поколений менингококов с повышенной вирулентностью
- 2332985 Дозированные формы анестезирующих средств с длительным высвобождением для обезболивания
- 2132677 Косметическая маска
- 38603 Пленочный аппликатор
- 2232594 Средство содержащие ингибирующие остеокластогенез фактор и полисахарид
- 2332238 Средство для прокладок, раневых повязок и других изделий, контактирующих с кожей
- 2331668 Стромальные клетки, получение из жировой ткани, для заживления дефектов роговицы и внутриглазных дефектов и их использование
- 2331438 Альфа - 2 - Дельта Лигант для лечения симптомов нижних мочевыводящих путей
- 2331411Электропряденые аморфные фармоцевтические средства
- 2331367 Способ профилактики образования спаек и их рецидива
- 2130767 Масло в воде для получения косметических и дерматологических средств, способ косметической обработки
- 2230752 Поперечносшитые гиалуроновые кислоты и их применение в медицине
- 2230558 Способ восстановления и сохранения здоровья скмьи
- 2230550 Средства длительного высвобождения, способ их получения и применения
- 2230458 Поддержания здоровья суставов
- 2330290 Способ определения состояния метаболических процессов в ткани суставного хряща
- 2230073 Способ поперечного сшивания карбоксилированных полисахаридов
- 2329059 Способ лечения полипозного риносинусита
- 2329037 Комбинированная терапия для лечения иммуновоспалительных заболеваний
- 2128666 Гиалуроновая кислота и ее соли, способ очистки гиалуроновой кислоты, способ получения гиалуроновой кислоты. Фармацевтический препарат с гиалуроновой кислотой и средства с гиалуроновой кислотой используемые в офтальмологии
- 2328740 Способ экспресс - оценки действия зубных паст
- 2128502 Косметический гель
- 2328272 Суппозитории индуктора интерферона
- 2328268 Косметика содержащая амфолитный сополимер
- 2128057 Композиционная мембрана, способ ее получения и способ направленной регенерации тканей с ее применением
- 2128055 Средство замедленного освобождения и способ его получения
- 2128049 Свечи
- 2227743 Полипептидные варианты с повышенной гепаринсвязывающей способностью
- 2326893 Ковалентное и нековалентное сшивание гидрофильных полимеров
- 2326697 Новый перевязочный материал для быстрого заживления раневой поверхности кожи
- 2126264 Фармацевтическое средство с гиалуроновой кислотой
- 2326137 Способ получения содержащих альгинат пористых формованных изделий
- 2325902 Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани
- 2225195 Репелленты против насекомых
- 2325193 Сосудистый стент
- 2325184 Улучшенные везикулы наружной мембраны бактерий
- 2325153 Многокомпонентная фармацевтическая дозированная форма
- 2325152 Удерживаемая в желудке система регулируемой доставки лекарственного средства
- 2029955 Способ предоперационного определения помутнения задней капсулы хрусталика при экстракции катаракты
- 2324688 Производные бисбензизоселеназолонила с противоопухолевым, противовоспалительным и антитромбоническим действием
- 2323017 Устройство и способ контролируемый доставки активных веществ в кожу
- 2323011 Содержащий Коллаген I и Коллаген II способный к рассасыванию внеклеточный матрикс, предназначенный для реконструирования хряща
- 2322955 Способ изготовления имплантанта для пластики дефектов хрящевой ткани
- 2322454 Антитело против CCR5
- 2322263 Система продолжительного высвобождения растворимого лекарственного средства
- 2221561 Витамин Е и его сложные эфиры
- 2321634 Гены участвующие в метаболизме углерода и продуцировании энергии
- 2321597 Биоматерьял, способ его приготовления и его применение, медицинское средство, имплантант и вкладыш
- 2121340 Средство для похудения
- 2220737 Средство для улучшения состояния опорно-двигательного аппарата
- 2220729 Гель используемый в стоматологии
- 2320720 Способ культивирования фибропластов для заместительной терапии
- 2320378 Накожный аппликатор
- 2320369 Средства, содержащие Альфа - 2 - Дельта Лиганды и ингибиторы обратного захвата серотонина/норадреналина
- 2320362 Местные фармацевтические средства, содержащие проантоцианидины, для лечения дерматитов
- 2320322 Биоадгезивная доставка лекарств
- 2320318 Чувствительное к температуре изменяющие состояние средство гидрогеля
- 2025120 Способ получения препарата, содержащего Фактор /G-CSF/, стимулирующий рост колоний гранулоцитов
- 2319490 Средство для введения железа при лечении синдрома беспокойных ног
- 25995 Содержащее адгезив приспособление для фиксации зубных протезов в полости рта
- 2218907 Средство для ухода за кожей лица и веками
- 2318830 Способ получения модифицированного дерматансульфата
- 2118153 Косметика - туш для ресниц
- 2217441 Способ получения полимера
- 2317296 Изетионатная соль селективного ингибитора CDK4
- 2217171 Мембрана для использования при направленной регенерации тканей
- 2317095 Экстракты ECHINACEA ANGUSTIFOLIA
- 2216332 Препарат для лечения астроза
- 2216314 Крем - маска для обезвоженной кожи
- 2316333 Средство оздоровительно-восстановительных косметических панто-магниевых ванн
- 2021304 Способ получения биологически активного средства
- 2115662 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2315627 Впрыскиваемые имплантанты на керамической основе для заполнения морщин, кожных впадин, шрамов
- 2315623 Средство получаемое путем лиофилизации препарата
- 2114862 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2314791 Лечебно-Косметическое средство
- 2314791 Косметический крем-бальзам для ухода за кожей лица и шеи
- 2214600 Способ оценки эффективности лечения неврологических проявлений
- 2114602 Способ косметической обработки
- 2114587 Раствор для защиты роговицы
- 2214283 Имплантант для подкожного или внутрикожного введения
- 2313370 Медицинские протезы, имеющие улучшенную биологическую совместимость
- 2313356 Препарат для лечения демодекоза
- 2313338 Средство на основе этиллинолеата и триэтилцитрата для лечения себореи и угрей
- 2313328 Косметика содержащая тонкодисперный и пористый порошок
- 2212880 Способ получения препарата содержащего антибиотик, с замедленным высвобождением активного вещества
- 2312640 Способ лечения Блефароконьюнктивальной формы синдрома сухого глаза
- 2017751 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2312145 Гены CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM, кодирующие белки, участвующие в синтезе мембран и мембранном транспорте
- 2311458 Белки вызывающие измененную иммуногенную реакцию. Способ их получения и использования
- 2311183 Улучшенное разделение с использованием гталуроновой кислоты
- 2311177 Ингибиторы интегрина для лечения заболевания глаз
- 2300069 Косметическая маска
- 2211024 Уход за сухой кожей
- 2310440 Раствор для защиты роговицы от повреждений
- 2309684 Лечение межфалангового остеоатроза узелковой формы
- 2309406 Способ мониторинга фиброза печени у больных хроническим гепатитом с (ХГС)
- 2209088 Опосредованная рецепторами доставка генов с использованием векторов на основе бактериофагов
- 2308967 Уменьшение объема ткани
- 2308962 Средство для опорно-дигательного аппарата
- 2308957 Способ получения препарата для мезотерапии
- 2308954 Средство для лечения ран, содержащее плазму или сыворотку крови
- 2308951 Комплексный способ профилактики вагинальных дисбактериозов
- 2308937 Косметическая биологически активная добавка и косметический литофитокомплекс на ее основе
- 2208638 ДНК (варианты), способ получения белка
- 2207885 Способ подачи небольшого объема лечебного раствора к целевому месту
- 2207858 Лишенные побочных эффектов производные простагландинов для лечения глаукомы
- 2207845 Твердая лекарственная форма пролонгированного действия
- 2207844 Препарат для местного неинвазивного применения
- 2207841 Средства с антиферментативным действием
- 2306335 Стволовые клетки и решетки полученные из жировой ткани
- 2306140 Новые рецепторы для Helicobacter pylori и их применение
- 2205612 Способ эндотелизации IN VITRO протезов кровеносных сосудов
- 2105540 Депигментирующее средство
- 2304960 Косметическое средство для кожи
- 2304616 Гены участвующие в гомеостазе и адаптации
- 2204550Способ получения длинноцепочечной N-Ацилированной кислотой Аминокислот
- 2204415 Способ получения изображения
- 2204394 Средство для лечения грибковых инфекций, желудочных язв
- 2204366 Способ хирургического лечения глаукомы
- 2104034 Вагинальное увлажняющие средство, способ его получения
- 2303991 Биологически активная добавка
- 2303990 БАД
- 2303973 Адсорбирующее изделие
- 2203676 Средство обладающее иммунокорригирующим действием
- 2203672 Способ предупреждения беременности
- 2303635 Гены кодирующие белки резистентности и толерантности к стрессам
- 2303529 Способ фиксации альгинатного геля на твердой фазе, способ получения клеточного чипа на его основе
- 2203078 Способ лечения гнойных ран
- 2302412 Гидразоно-малонитрилы
- 2102400 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2202356 Способ стимуляции репаративных процессов длительно незаживающих ран и трофических язв
- 2202336 Средство для ухода за кожей
- 2302231 Глазные капли
- 2102082 Способ магнитометрического исследования тела человека или животного
- 2301814 Полиакриламидный гидрогель
- 2201765 Гибридные матричные имплантанты и эксплантанты
- 2301677 Биотрансплантант для лечения дегенеративных и трвматических заболеваний хрящевой ткани и способ его получения
- 2301676 Способ лечения ревматизма
- 2301674 Способ лечения больных с переломами нижней челюсти
- 2301661 Средство с регулируемым освобождением и способ его получения
- 2005488 Средство для лечения болезней соединительной ткани
- 2200001 Крем для кожи
|
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
|
Патент №2139729 |
(54) ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицине, оно обеспечивает вакцинные композиции аттенуированного респираторно-синцитиального вируса (RSV). Более конкретно, аттенуированный вирус может быть производным RSV, который был неполностью аттенуирован пассированием на холоду или введением мутаций, которые создают вирус, имеющий чувствительный к температуре (ts) или адаптированный к холоду (са) фенотип. Изобретение относится также к способу стимулирования иммунной системы индивидуума для индуцирования защиты против респираторно-синцитиального вируса путем введения аттенуированного RSV. Изобретение обеспечивает также чистые культуры аттенуированного RS вируса, в которых этот вирус более полно аттенуирован путем дальнейшей дериватизации (дальнейшего получения производных) идентифицированных ранее неполностью аттенуированных ts и ср мутантов. Изобретения обеспечивают высокие уровни защитного иммунитета. 2 с. и 27 з.п. ф-лы, 7 табл. Инфекция человека респираторно-синцитиальным вирусом (RSV) варьирует от бессимптомного до тяжелого заболевания дыхательных путей. У младенцев и детей респираторно-синцитиальный вирус (RSV) рассматривается как одна из наиболее важных причин заболевания нижних дыхательных путей во всех географических зонах мира. RS вирус превосходит все другие микробные патогены в качестве причины пневмонии и бронхиолита у младенцев до 1 года и является главной причиной летального заболевания дыхательных путей у таких младенцев. Фактически все дети инфицируются в возрасте двух лет. Реинфекция имеет место с заметной частотой у детей старшего возраста и у молодых взрослых людей (Chanock et al. , in Viral Infection of Humans, 3d ed., A.S. Evans. ed., Plenum Press, N.Y. (1989)). Хотя большая часть взрослых людей не имеет серьезных заболеваний, вызываемых инфекцией RS вирусом, пожилые больные и индивидуумы с нарушенной иммунной системой могут иметь тяжелые и, возможно, угрожающие жизни инфекции. Лечение RSV инфекции было проблематичным. Маленькие дети имеют ответные реакции в виде образования сывороточных и секреторных антител на антигены RSV и поэтому страдают от более тяжелых инфекций, тогда как кумулятивный иммунитет, по-видимому, защищает более старших детей и взрослых от серьезных форм этой инфекции. Было показано, что одно антивирусное соединение, рибавирин, может быть перспективным в лечении инфицированных младенцев в тяжелом состоянии, хотя не получены доказательства того, что оно сокращает продолжительность или уменьшает необходимость поддерживающей терапии. Механизмы иммунитета к инфекции RSV недавно стали центром внимания исследователей. По-видимому, секреторные антитела являются наиболее важными в защите верхних дыхательных путей, тогда как высокие уровни сывороточных антител, возможно, играют главную роль в устойчивости к инфекции RSV в нижних дыхательных путях. Очищенный человеческий иммуноглобулин, содержащий высокий титр нейтрализующих антител к RSV, может оказаться применимым в иммунотерапевтических подходах к лечению тяжелого заболевания нижних дыхательных путей у младенцев и детей младшего возраста. Однако препараты иммуноглобулина имеют серьезные недостатки, такие как возможность передачи находящихся в крови вирусов и трудности и большие расходы при их приготовлении и хранении. Несмотря на настоятельную потребность в эффективной вакцине против RS вируса, в частности, для младенцев и детей младшего возраста, прежние попытки получения надежной и эффективной вакцины были неудачными. Вакцина с инактивированным формалином вирусом, исследованная в середине 1960-х годов, не давала защиты против инфекции RS вирусом или заболеванием. Вместо этого заболевание обострялось при последующей инфекции RS вирусом. Kim et al., Am. J. Epidemiol 89:422-434; Chim et al., Am.J. Epidemiol. 89: 449-463 (1969); Kapikian et al., Am. J. Epidemiol. 89:405-421 (1969). Для того чтобы обойти проблемы, связанные с инактивированными вакцинами и возможным изменением вируснейтрализующей антигенной детерминанты, усилия были направлены на получение аттенуированных RS мутантов. Friedewald et al., J. Amer. Med. Assoc. 204:690-694 (1968) сообщили о получении низкотемпературного пассированного мутанта RS вируса, который, по-видимому, обладал достаточной аттенуацией для того, чтобы быть кандидатом на вакцину. Этот мутант проявлял слегка увеличенную эффективность роста при 26oC по сравнению с родительским вирусом дикого типа, но его репликация была нечувствительной к температуре и не была адаптирована к холоду. Однако пассированный на холоду мутант был аттенуированным (ослабленным) для взрослых. Хотя этот мутант был достаточно аттенуированным и иммуногенным для младенцев и детей, ранее инфицированных RSV (например, серопозитивных индивидуумов), он сохранял низкий уровень вирулентности для верхних дыхательных путей серонегативных младенцев. Этот мутант был пассирован в культуре клеток почки быка при низкой температуре (26oC) и в результате приобрел аттенуирующие мутации круга хозяев. Приобретение этих мутаций позволяло мутанту эффективно реплицироваться в бычьих тканях, тогда как те же самые мутации ограничивали рост мутанта в дыхательных путях человека по сравнению с родительским штаммом A2 RVS. Подобно этому Garpure et al. , J. Virol. 3:414-421 (1969) сообщили о выделении чувствительных к температуре (ts) мутантов, которые также были перспективными кандидатами на вакцины. Один мутант, ts-1, был подвергнут детальному исследованию в лаборатории и на добровольцах. Мутант вызвал бессимтомную инфекцию у взрослых добровольцев и устойчивость к введению вируса дикого типа через 45 дней после иммунизации. Опять-таки, в то время как серопозитивные младенцы и дети подвергались бессимптомной инфекции, серонегативные младенцы обнаруживали признаки ринита и другие легкие симптомы. Кроме того, была обнаружена нестабильность ts фенотипа, хотя вирус, проявляющий частичную или полную потерю чувствительности к температуре, представлял небольшую часть извлекаемого из вакцин вируса и не был ассоциирован с иными признаками заболевания, чем легкий ринит. Таким образом, эти исследования выявили, что пассированные на холоду и чувствительные к температуре штаммы были недостаточно аттенуированы и вызывали легкие симптомы заболевания у некоторых вакцинированных индивидуумов, в частности у серонегативных младенцев, тогда как другие штаммы избыточно аттенуированы и не реплицируются в достаточном количестве для индуцирования защитных иммунных ответных реакций. (Wright et al., Infect. Immun. 37:397-400 (1982)). Генетическая нестабильность, позволяющая мутантам-кандидатам на вакцины терять их устойчивый к температуре фенотип, также была нарушающим планы открытием. См. Hodes et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 145:1159-1164 (1974). Mc Intosh et al., Pediatr. Res. 8: 689-696 (1974) и Belshe et al., J. Med. Virol. 3:101-110 (1978). Оставив подход, предусматривающий применение вакцин с аттенуированным RS вирусом, исследователи испытали потенциальные субъединичные вакцины, основанные на гликопротеинах оболочки RS вируса, очищенных из лизатов инфицированных клеток. Эти гликопротеины индуцировали устойчивость к инфекции RS вирусом в легких хлопковых (cotton) крыс, Walsh et al., J. Infect. Dis. 155: 1198-1204 (1987), но индуцированные антитела имели очень слабую вируснейтрализующую активность и иммунизация грызунов очищенной субъединичной вакциной приводила к усилению заболевания (Murphy et al., Vaccine 8: 497-502 (1990)). Исследовались такие вакцины, основанные на рекомбинантном вирусе осповакцины, который экспрессирует гликопротеин оболочки F или G. Эти рекомбинанты экспрессируют гликопротеины RVS, которые неотличимы от аутентичной вирусной копии, и мелкие грызуны, инфицированные внутрикожно рекомбинантными вирусами осповакцины, экспрессирующими F- и G-RSV, обнаружили высокие уровни специфических антител, которые нейтрализовали инфекционность вируса. Действительно, инфицирование хлопковых крыс рекомбинантами вируса осповакцины-F стимулировала почти полную устойчивость к репликации RSV в нижних дыхательных путях и значительную устойчивость в верхних дыхательных путях. Olmsted et al. , Proc. Natl. Asad. Sci. USA. 83:7462-7466 (1986). Однако иммунизация шимпанзе рекомбинантами вирус осповакцины -F и вирус осповакцины -G почти не давала защиты против введения RSV/Collins et al., Vaccine 8: 164-168 (1990)). Это привело к заключению, что этот подход, по-видимому, не сможет обеспечить удачной вакцины. В то время как исследователи испытывали несколько различных подходов для получения эффективной и надежной RS вакцины в течение ряда лет. RS вирус оставался наиболее обычной причиной тяжелого вирусного заболевания нижних дыхательных путей у младенцев и детей. В результате остается настоятельная потребность в надежной вакцине, которая способна предотвращать серьезное заболевание в этой популяции, требующее часто госпитализации, и предотвращать заболевание у других индивидуумов. Совершенно удивительно, данное изобретение решает эти и близкие к ним проблемы. Данное изобретение обеспечивает вакцинные композиции аттенуированного респираторно-синцитиального вируса. Аттенуированный вирус обеспечен в количестве, достаточном для индуцирования иммунного ответа в хозяине-человеке, в соединении с физиологически приемлемым носителем и может иногда содержать адъювант для усиления иммунного ответа хозяина. Изобретение рассматривает несколько различных антигенных подгрупп аттенуированного RS вируса, которые произведены из неполностью ослабленного RS вируса и обладают свойствами, до сих пор не обнаруживаемыми аттенуированными RS вирусами, описанными ранее в литературе. В одном из вариантов изобретения аттенуированный вирус содержит RS вирус с ограниченным кругом хозяев, неполностью ослабленный пассированием на холоду (cp RSV), в который введены по меньшей мере одна или несколько дополнительных мутаций для получения вируса и его потомства, имеющих чувствительный к температуре фенотип (ts), обозначаемый далее cpts RSV. В другом варианте RS вирус с ограниченным кругом хозяев, неполностью ослабленный пассированием на холоду (cp RSV), адаптируют к холоду (ca) пассированием при более пониженных температурах для введения дополнительных ограничивающих рост мутаций. Еще в одном варианте неполностью ослабленные ts мутанты RSV, такие как ts-4 и ts-1 NGI RSV, ослаблены далее введением дополнительных мутаций. Аттенуированные производные ts или cp штаммов получают несколькими путями, но предпочтительно введением дополнительных чувствительных к температуре мутаций при помощи химического мутагенеза, дальнейшим пассированием в культуре при ослабляющих температурах 20-24oC или введением мутаций малых бляшек (Small plaque) (cp) и отбором производных, которые более ограничены в репликации, чем неполностью аттенуированный родительский мутантный штамм. Этот аттенуированный вирус изобретения принадлежит к антигенной подгруппе либо A, либо B и вирус из обеих подгрупп может быть объединен в вакцинных препаратах для большего охвата преобладающих RSV инфекций. Вакцину обычно готовят в дозе 103 - 106 бляшкообразующих единиц (PFU) или в более высокой дозе для максимальной эффективности. В других вариантах изобретение обеспечивает способы стимулирования иммунной системы индивидуума для индуцирования защиты против респираторно-синцитиального вируса. Способы предусматривают введение индивидууму иммунологически достаточного количества RSV, аттенуированного введением мутаций, которые придают характер ts, ca и (или) sp фенотипа RSV, исходно неполностью аттенуированному ts мутацией (мутациями) или пассированием при низкой температуре, например, при 26oC. Ввиду потенциальных тяжелых последствий инфекции RSV у новорожденных, серонегативных и серопозитивных младенцев и детей младшего возраста, а также у пожилых людей, иммунизация в соответствии с данными способами обычно наиболее полезна для этих индивидуумов. В большинстве случаев аттенуированный вирус вводят в дыхательные пути индивидуума, предпочтительно интраназально в виде аэрозоля или капель. В дальнейших вариантах изобретение обеспечивает чистые культуры аттенуированного RS вируса, в которых вирус был более полно аттенуирован дальнейшей дериватизацией идентифицированных ранее ts или cp мутантов. Этот аттенуированный вирус способен вызывать защитный иммунный ответ в инфицированном хозяине-человеке, но в то же время достаточно ослаблен, так что не вызывает нежелательных симптомов тяжелого респираторного заболевания в иммунизированном хозяине. Аттенуированный вирус может находиться в супернатанте клеточной культуры, может быть выделен из культуры или частично, либо полностью очищен. Вирус может быть лиофилизирован и может быть соединен со множеством других компонентов для хранения или доставки хозяину, по желанию. Описание характерных вариантов
Данное изобретение обеспечивает RS вирус, пригодный для применения в качестве вакцины для человека. RS вирус, описанный здесь, получают введением дополнительных мутаций в штаммы во время роста вируса в клеточных культурах, к которым добавляют химический мутаген, отбором вируса, подвергнутого пассированию при субоптимальной температуре для введения ограничивающих рост мутаций, или отбором подвергнутого мутагенезу вируса, который продуцирует малые бляшки в клеточной культуре. Таким образом, вакцина данного изобретения содержит аттенуированный RS вирус и физиологически приемлемый носитель. Вакцину вводят в иммуногенно достаточном количестве индивидууму, нуждающемуся в иммунологической защите против RS вируса, например, младенцу, ребенку, пожилым людям или взрослым для иммуносупрессивной терапии. Вакцина вызывает иммунный ответ, защищающий против серьезного заболевания нижних дыхательных путей, например, пневмонии и бронхиолита, при последующем инфицировании индивидуума RS вирусом дикого типа. Хотя циркулирующий в природе вирус еще способен вызывать инфекцию, в частности, в верхних дыхательных путях, в результате вакцинации очень сильно снижается возможность ринита и возможно повышение устойчивости при последующей инфекции вирусом дикого типа. После вакцинации образуются детектируемые уровни сывороточных и секреторных антител у хозяина, которые способны нейтрализовать гомологичный (той же самой подгруппы) вирус дикого типа in vitro и in vivo. Во многих случаях антитела хозяина будут также нейтрализовать вирус дикого типа другой, невакционной подгруппы. Для достижения более высоких уровней перекрестной защиты, т.е. защиты против гетерологичных штаммов другой подгруппы, предпочтительно вакцинировать индивидуумов аттенуированным вирусом по меньшей мере из одного предпочтительного штамма как подгруппы A, так и B. Аттенуированный вирус, являющийся компонентом вакцины, находится в ней в выделенном и обычно очищенном виде. Под словом "выделенный" имеют ввиду, что аттенуированный модифицированный RS вирус находится в другой среде по сравнению с обычной природной средой обитания вируса дикого типа, такой как носоглотка инфицированного индивидуума. Более конкретно, "выделенный" обозначает, что аттенуированный вирус находится в виде гетерологичного компонента в клеточной культуре или иной системе. Например, аттенуированный RS вирус данного изобретения может быть продуцирован инфицированной клеточной культурой, отделен от нее и добавлен к стабилизатору, содержащему другие, не встречающиеся в природе RS вирусы, например, вирусы, которые выбраны как аттенуированные по устойчивости к нейтрализующим моноклональным антителам к F-белку, как описано в одновременно представленном U.S. patent application attorney docket 15280-11-2, даваемом здесь в виде ссылки. Аттенуированный RS вирус данного изобретения обнаруживает очень заметное уменьшение вирулентности при сравнении с вирусом дикого типа, циркулирующего природно в людях. Аттенуированный вирус достаточно ослаблен, так что симптомы инфекции не наблюдаются в большинстве иммунизированных индивидуумов. В некоторых случаях аттенуированный вирус еще способен диссеминировать к невакционированным индивидуумам. Однако его вирулентность достаточно подавлена, так что в вакцинированном или случайном хозяине не бывает серьезных инфекций нижних дыхательных путей. Уровень аттенуации можно определить, например, определением количества вируса, присутствующего в дыхательных путях иммунизованного хозяина и сравнением этого количества с количеством, продуцируемым RS вирусом дикого типа или другими аттенуированными RS вирусами, которые оценивались как кандидаты вакцинных штаммов. Например, аттенуированный вирус данного изобретения имеет более высокую степень ограничения репликации в верхних дыхательных путях высокочувствительного хозяина, такого как шимпанзе, по сравнению с уровнями репликации вируса дикого типа, например, в 10-1000 раз меньше. Также уровень репликации аттенуированного вакцинного штамма RSV в верхних дыхательных путях шимпанзе был ниже, чем уровень репликации неполностью аттенуированного мутанта A2ts-1RSV. Для дальнейшего снижения развития ринореи, связанной с репликацией вируса в верхних дыхательных путях, идеальный вакцинный вирус-кандидат должен проявлять пониженный уровень репликации как в верхних, так и в нижних дыхательных путях. Однако аттенуированные вирусы данного изобретения должны быть достаточно инфекционными и иммуногенными в человеке для выработки защиты в вакцинированных индивидуумах. Способы определения уровней RS вируса в носоглотке инфицированного хозяина хорошо известны в литературе. Пробы получают аспирацией или вымыванием носоглоточных секреций (выделений) и количество вируса определяют при помощи лабораторного способа. См., например, Belshe et al., J. Med. Virology 1:157-162 (1977). Friedewald et al., J. Amer Med. Assoc. 204: 690-694 (1968); Gharpure et al., J. Virol. 3: 414-421 (1969) и Wright et al., Arch. Ges Virusforsch. 41: 238-247 (1973). Вирус может быть измерен пригодным для этого способом в носоглотке хозяев-животных, таких как шимпанзе. Для получения удовлетворительно аттенуированного производного вируса данного изобретения мутации вводят в родительский вирусный штамм, который неполностью или частично аттенуирован, такой как ts-1 или ts-4 мутант или cp RSV. Для вируса подгруппы A предпочтительным неполностью аттенуированным родительским вирусом является ts-1 или ts-1 NG-1 или cp RSV, которые представляют собой мутанты штамма A2 подгруппы A или их производные или субклоны. Частично ослабленные мутанты вируса подгруппы B моно получить биологическим клонированием вируса подгруппы B дикого типа в приемлемом клеточном субстрате и получением из него мутантов пассированием на холоду, а также при помощи химического мутагенеза с образованием ts мутантов или отбором мутантов, образующих малые бляшки. Различные способы отбора можно также комбинировать для получения частично аттенуированных мутантов подгрупп A или B, пригодных для дальнейшей описанной здесь дериватизации. Как только отобран (отобраны) желаемый частично аттенуированный родительский штамм (штаммы), дальнейшее аттенуирование, достаточное для получение вакцины, приемлемой для применения в человеке, согласно данному изобретению выполняется несколькими путями, как описано здесь. Согласно данному изобретению, cp мутант может быть подвергнут дальнейшему мутагенезу различными путями. В одном из вариантов способ предусматривает пассирование частично ослабленного вируса в клеточной культуре при прогрессивно более низких, ослабляющих температурах. Например, в то время как вирус дикого типа в типичном случае культивируют приблизительно при 34-35oC, частично аттенуированные мутанты получают пассированием в клеточных культурах (например, в первичных клетках почек быков) при субоптимальных температурах, например, при 26oC. Эти мутанты имеют слабое, но четко выраженное доказательство адаптации к холоду (ca), т.е. повышенную эффективность роста при 26oC по сравнению с родительским вирусом дикого типа, но обычно не ts. Так, в одном способе данного изобретения cp мутант или другой частично ослабленный штамм, например, ts-1 или sp, адаптируют для эффективного роста при пониженной температуре пассированием в клетках MRС-5 или Vero до температуры приблизительно 20-24oC, предпочтительно 20-22oC. Этот отбор мутантного RS вируса во время холодного пассирования в основном исключает какую-либо остаточную вирулентность в производных штаммах по сравнению с частично аттенуированным родителем. В другом варианте изобретения неполностью аттенуированные штаммы подвергают химическому мутагенезу для введения ts мутаций или, в случае вирусов, которые уже ts (чувствительны к температуре), дополнительные ts мутации достаточны для увеличения стабильности ts фенотипа аттенуированного производного. Способы для введения ts мутаций в RS вирус предусматривают репликацию вируса в присутствии мутагена, такого как 5-фторуридин или 5-фторурацил в концентрации приблизительно 10-3 - 10-5 М, предпочтительно приблизительно 10-4 М, или экспонирование вируса с нитрозогуанидином при концентрации приблизительно 100 мкг/мл в соответствии с общим способом, описанным, например, в Gharpure et al., J. Virol. 3: 414-421 (1969) и Richardson et al. , J. Med. Virol. 3: 91-100 (1978). Можно использовать и другие химические мутагены. Аттенуирование может быть результатом ts мутации почти в любом гене RS вируса. Уровень температурной чувствительности репликации аттенуированного RS вируса изобретения определяют сравнением его репликации при разрешающей температуре с репликацией при нескольких ограничивающих температурах. Самая низкая температура, при которой репликация вируса снижается в 100 раз или более по сравнению с его репликацией при пермиссивной температуре, названа температурой выключения (shutoff). В экспериментальных животных и людях как репликация, так и вирулентность RS вируса коррелируют с температурой выключения мутанта. Репликация мутантов с температурой выключения 39oC умеренно ограничена, тогда как мутанты с температурой выключения 38oC размножаются менее хорошо и симптомы болезни в основном ограничиваются верхними дыхательными путями. Вирус с температурой выключения 35-37oC должен быть полностью ослаблен в человеке. Так, аттенуированный RS вирус изобретения, который чувствителен к температуре, имеет температуру выключения в диапазоне приблизительно 35-39oC, предпочтительно 35-38oC. Добавление свойства чувствительности к температуре частично аттенуированному штамму создает полностью аттенуированный вирус, применимый в вакцинных композициях данного изобретения. В дополнение к критериям жизнеспособности, ослабленности и иммуногенности свойства производного, которое отбирают, должны также быть несколько возможно стабильными, так чтобы желаемые признаки сохранялись. Генетическая нестабильность ts фенотипа после репликации in vivo была правилом для ts вирусов (Murphy et al., Infect. and Immun. 37: 235-242 (1982)). Затем идеально, если вирус, применяемый в вакцинах данного изобретения, сохраняет жизнеспособность, ослабленность, способность размножаться в иммунизированном хозяине (хотя и с низкими уровнями) и способность эффективно индуцировать иммунный ответ в вакцинированных индивидуумах, достаточный для защиты против серьезного заболевания, вызываемого последующей инфекцией вирусом дикого типа. Очевидно, что известные до сих пор и описанные мутанты RS вируса не отвечают всем этим критериям. Действительно, вопреки ожиданиям, основанным на результатах, сообщенных для известных аттенуированных RS вирусов, некоторые из вирусов данного изобретения, имеющие минимально две-три разные мутации, не только жизнеспособны и более ослаблены, чем прежние мутанты, но и более стабильны генетически in vivo, чем исследованные ранее мутанты, и сохраняют способность стимулировать защитный иммунный ответ и в некоторых случаях расширять защиту, полученную в результате множественных модификаций, например, индуцировать защиту против различных вирусных штаммов или подгрупп или защиту на различной иммунологической основе, например, на основе секреторных, а не сывороточных иммуноглобулинов, на основе клеточного иммунитета и т.п. Аттенуированный вирус данного изобретения может быть размножен в ряде клеточных линий, которые пригодны для роста RS вируса. RS вирус растет во многих человеческих и животных клетках. Предпочтительными клеточными линиями для размножения аттенуированного RS вируса для применения в вакцинах являются клетки DBS-FRhL-2, MRC-3 и Vero. Наибольшие выходы вируса обычно достигаются в гетероплоидных линиях, таких как клетки Vero. Обычно клетки инокулируют вирусом при множественности заражения в диапазоне 0,001-1,0 или более. Клетки культивируют при условиях, разрешающих репликацию вируса, например, при 30-37oC в течение 3-5 дней или так долго, как это необходимо для достижения требуемого титра. Вирус удаляют из клеточной культуры и отделяют от клеточных компонентов, обычно хорошо известными способами, например, центрифугированием, и, если нужно, очищают далее при помощи способов, известных специалистам данной области. Вирус, аттенуированный, как описано здесь, может быть испытан в моделях in vitro и in vivo для подтверждения адекватного аттенуирования, генетической стабильности и иммуногенности для применения в вакцинах. В тестах in vitro модифицированный вирус тестируют на sp фенотип. Далее модифицированные вирусы тестируют в животных моделях RS инфекции. Описаны многие животные модели, которые суммированы в Meignier et al., eds., Animal Models of Respiratory Synсytial Virus Infection, Merieux Foundation Publication, (1991), даваемой в виде ссылки. Модель инфекции RSV хлопковых крыс описана в U.S. 4800078 и Prince et al., Virus Res. 3: 193-206 (1985), включенных в ссылки. Эта модель, как считают, предсказывает аттенуирование и эффективность в человеке. Модель RS инфекции приматов с применением шимпанзе предсказывает аттенуирование и эффективность в человеке и описана в деталях в Richardson et al. , J. Med. Virol. 3: 91-100 (1978); Wright et al., Infect. Immun. 37: 397-400 (1982); Crowe et al. , Vaccine (1993) (in press), включенных в ссылки. Например, было показано, что терапевтическое действие RSV нейтрализующих антител в инфекционных крысах было очень близким к последующему опыту с иммунотерапией обезьян и человека, инфицированных RSV. Действительно, хлопковая (cotton) крыса, по-видимому, является надежным экспериментальным заменителем для изучения ответа инфицированных обезьян и людей на иммунотерапию RSV нейтрализующими антителами. Например, количество RSV нейтрализующих антител, дающих терапевтический эффект на крысах, измеренный по уровню таких антител в сыворотке обработанных животных (т.е. титр RSV нейтрализующей сыворотки 1: 302 - 1:518) лежит в том же самом диапазоне, который продемонстрирован для обезьян (т.е. титр 1:539) или младенцев человека или детей младшего возраста (т.е. 1:877). Терапевтическое действие в крысах проявлялось в виде 100-кратного или большего снижения титра вируса в легком (Prince et al. , J. Virol. 61: 1851-1854), тогда как в обезьянах терапевтическое действие проявлялось в виде 50-кратного снижения титра легочного вируса. (Hemming et al., J. Infect. Dis. 152: 1083-1087 (1985)). Наконец, терапевтическое действие в младенцах и детях младшего возраста, госпитализированных с тяжелым RSV бронхиолитом или пневмонией, проявлялось в виде значительного увеличения оксигенации в подвергнутой лечению группе и значительном снижении количества RSV, извлекаемого из верхних дыхательньых путей прошедших лечение больных. (Hemming et al. , Antimicrob. Agents _ Chemother. 31: 1882-1886 (1987)). Следовательно, на основе этих исследований видно, что хлопковая крыса представляет собой удобную модель для предсказания успеха RSV вакцины у младенцев и детей младшего возраста. Другие грызуны, в том числе хомяки и мыши, должны быть также применимыми, поскольку эти животные могут допускать репликацию в них RSV и имеют температуру внутри тела, подобную температуре человека (Wight et al. , J. Infect. Dis. 122: 501-512 (1970) и Anderson et al., J. Gen. Virol. 71: (1990)). Для применения в вакцинах аттенуированный вирус данного изобретения можно использовать непосредственно в препарате вакцины или он может быть лиофилизирован, если желательно, при помощи известных протоколов лиофилизации. Лиофилизированный вирус обычно хранят приблизительно при 4oC. Перед использованием лиофизилированный вирус воссоздают в стабилизирующем растворе, например, солевом растворе или в растворе, содержащем SPG, Mg++ и HEPES, с адъювантом или без него, как описано ниже. Таким образом, RS вирусные вакцины изобретения содержат в качестве активного ингредиента иммунногенно эффективное количество аттенуированного RS вируса, как описано здесь. Аттенуированный вирус может быть введен в хозяина, в частности человеку, с физиологически приемлемым носителем и(или) адъювантом. Применимые носители хорошо известны в этой области и представляют собой, например, воду, содержащую буфер воду, 0,4%-ный солевой раствор, 0,3%-ный глицин, гиалуроновую кислоту и т.п. Полученные водные растворы могут быть упакованы для применения или лиофилизированы, причем лиофилизированный препарат соединяют со стерильным раствором перед введением, как упомянуто выше. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для создания близких к физиологическим условий, такие как корректоры pH и буферные средства, корректоры тоничности, смачивающие вещества и т.п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, сорбитанмонолаурат, олеат триэтаноламина и т.п. При инокуляции композицией аттенуированного RS вируса, как описано здесь, через аэрозоль, капли, грубый спрей, пероральным, топическим или иным путем, наиболее предпочтительным для интраназальной доставки, иммунная система хозяина отвечает на вакцину образованием антител, как секреторных, так и сывороточных, специфических для белков RS вируса. В результате вакцинации хозяин становится по меньшей мере частично или полностью иммунным к инфекции RS вирусом или устойчивым к развитию умеренной или тяжелой RS вирусной инфекции, в частности, нижних дыхательных путей. Вакцинные композиции, содержащие аттенуированный RS вирус данного изобретения, вводят лицу, восприимчивому к инфекции RS вирусом или по иной причине подвергающемуся опасности инфекции RS вирусом, для усиления возможностей собственной иммунной системы индивидуума. Такое количество определено как "иммуногенно эффективная доза". При этом точные количества зависят от состояния здоровья больного и его веса, способа введения, природы препарата и т. д. , но находятся в диапазоне приблизительно 103 - 106 бляшкообразующих единиц (PFU) или более вируса на больного, более типично, приблизительно 104 - 105 PFU вируса на больного. В любом случае вакцинные препараты должны обеспечить количество аттенуированного RV вируса данного изобретения, достаточное для эффективной защиты больного против тяжелой или угрожающей жизни инфекции RS вирусом. Аттенуированный RS вирус изобретения одной определенной RS подгруппы или одного штамма может быть соединен с аттенуированными вирусами другой подгруппы или других штаммов для получения защиты против множественных RS вирусов. В типичном случае различные модифицированные вирусы должны находиться в смеси и вводиться одновременно, но они могут вводиться и раздельно. Благодаря феномену перекрестной защиты среди определенных штаммов вируса иммунизация одним штаммом может защищать против нескольких различных штаммов той же самой или другой подгруппы. В некоторых случаях может быть желательным комбинирование вакцин аттенуированного вируса данного изобретения с вакцинами, которые индуцируют защитные ответные реакции на другие агенты, в частности, на другие поражающие детей вирусы. Например, вакцину данного изобретения можно вводить одновременно (в типичном случае раздельно) или последовательно с вакциной против вируса парагриппа, как это описано в Clements et al., J. Clin. Microbiol. 29: 1175-1182 (1991). Можно проводить одноразовые или множественные введения вакцинных композиций изобретения. Для новорожденных и младенцев до 2 лет множественное введение может быть необходимым для индуцирования достаточных уровней иммунитета. Введение следует начинать на первом месяце жизни и продолжать с интервалами, например, в 2 месяца, шесть месяцев, один год и два года, что необходимо для поддержания достаточных уровней защиты против нативной (дикого типа) RS вирусной инфекции. Подобным образом, взрослым, которые особенно восприимчивы к повторяющейся или тяжелой RS вирусной инфекции, например, работникам медико-санитарной помощи, дневной медицинской помощи, членам семей с детьми младшего возраста, пожилым людям, индивидуумам с нарушенной кардиолегочной функцией и т.д. могут быть необходимы многократные иммунизации для создания и(или) поддержания иммунных ответных реакций. Уровни индуцированного иммунитета могут прослеживаться путем измерения количеств нейтрализующих секреторных или сывороточных антител, и корректированные дозировки или вакцинации могут повторяться при необходимости для поддержания желаемых уровней защиты. Для иллюстрации (но не для ограничения) приведены следующие примеры. Пример I
Выделение и характеристика полученных в результате мутагенеза производных пассированного на холоду RSV. Этот пример описывает химический мутагенез неполностью аттенуированого cp RSV с ограниченным кругом хозяев для получения производных ts и cp штаммов, которые более сильно ослаблены и, следовательно, предпочтительны для применения в вакцинных препаратах RSV. Был приготовлен родительский исходный запас пассированного на холоду RSV (cp RSV). Вирус Flow Laboratories Lot 3131, родительский cp RSV, который неполностью аттенуировали в человеке, пассировали дважды в клетках MRC-5 при 25oC, в конце разбавляли в два раза в клетках MRC-5 при 25oC, затем пассировали три раза в клетках MRC-5 для получения суспензии cp RSV для мутагенеза. cp RSV подвергали мутагенезу выращиванием родительской исходной популяции в MRC-5 клетках при 32oC в присутствии 5-фторурацила в среде при концентрации 4 10-4 М. В предварительных исследованиях было показано, что эта концентрация является оптимальной, поскольку она вызывала 100-кратное снижение титра вируса на 5-й день роста в культуре клеток по сравнению со средой без 5-фторурацила. Затем подвергнутую мутагенезу исходную популяцию анализировали методом бляшек (пятен) на клетках Vero, которые поддерживались под верхним слоем агара, и после определенного интервала инкубирования бляшки окрашивали красителем нейтральным красным. 854 бляшки извлекали и потомство каждой бляшки отдельно размножали путем выращивания на свежих монослоях клеток Vero. Содержимое каждой из тканевых культур инокулировали потомством одной бляшки подвергнутого мутагенезу cp RSV, собирали отдельно, когда эффекты подтверждения на клетках Vero казались максимальными. Потомство вируса, обнаруживающее чувствительный к температуре (ts) или содержащий малые бляшки (sp) фенотип, находили титрованием пулов бляшек на HEp-2 клетках при 32oC и 38oC. Каждый вирус, обнаруживающий sp фенотип (размер бляшек был уменьшен на 50% или более по сравнению с родительским вирусом при 32oC) или ts фенотип (100-кратное снижение титра при ограничивающей температуре 37o-40oC по сравнению с 32oC) оценивали далее. Эти штаммы биологически клонировали серийной очисткой бляшек на клетках Vero три раза и затем размножали на клетках Vero. Клонированные штаммы титровали при 32o, 37o, 38o, 39o и 40o (в тесте эффективности бляшкообразования (ECP)) для подтверждения их sp и ts фенотипов. Поскольку титры некоторых клонированных штаммов были относительно низкими даже при пермиссивной температуре (32oC), эти вирусы пассировали один раз в HEp-2 клетках, получая вирусные суспензии для анализа in vitro. Фенотипы потомства подвергнутого мутагенезу cp RSV представлены в табл. 1 (табл. 1-17 см. в конце описания). Одно из мутантных потомств имело фенотип малых бляшек, RSV cpsp-143 (sp обозначает фенотип малых бляшек (sp), остальные мутантные потомства имели ts фенотип. RSV cpts мутанты обнаруживают вариации в способности продуцировать бляшки в монослойных культурах in vitro в диапазоне температур 37oC - 40oC. Так, cpts 368 сохраняет способность продуцировать бляшки при 40oC, тогда как наиболее чувствительный к температуре (ts) вирус, cpts 248, не мог продуцировать бляшки при 38oC. Таким образом, некоторые из подвергнутых мутагенезу cp RSV потомств обнаруживают заметное отличие от родительского cp RS вируса в отношении чувствительности к температуре бляшкообразования. Исследование репликации и генетической стабильности в мышах
Уровень репликации cp RSV потомства вируса в верхних и нижних дыхательных путях BALB/c мышей изучали на следующем этапе исследований (табл. 2). Было обнаружено, что cpts 530 и cpts 248, два из наиболее чувствительных к температуре ts вирусов (см. табл. 1), имели в 7-12 раз сниженную репликацию в носовых раковинах мышей (табл. 2). Однако ни один из этих вирусов не был ограничен в репликации в легких по сравнению с cp RSV родительским вирусом. Большее ограничение размножения в носовых раковинах чем в легких, не является характерным для ts мутантов, которые обычно имеют более ограниченное размножение в более теплых нижних дыхательных путях (Richman and Murphy, Rev. Jnfect. Dis. 1: 413-433 (1979). Вирус, образовавшийся в легких и носовых раковинах, сохранял ts характер вошедшего вируса (данные не представлены). Эти открытия предполагают, что комбинация ts мутаций на фоне мутаций родительского cp вируса привела к ts потомству cp RSV с более высоким уровнем стабильности ts фенотипа после репликации in vivo, чем это было показано для изучаемых ранее ts мутантов. Для дальнейшего изучения уровня генетической стабильности ts фенотипа потомств cp RSV эффективность бляшкообразования вируса, присутствующего в легких, и в носовых раковинах мышей исследовали для двух потомств подвергнутого мутагенезу cp RSV, которые были среди наиболее чувствительных к температуре (ts) потомств, а именно ts 248 и ts 530. Голые мыши были выбраны, поскольку их иммунная система нарушена вследствие врожденного отсутствия функциональных T-клеток, и вирус может реплицироваться в этом хозяине в течение более длительного периода времени. Более длительный период репликации благоприятствует появлению вирусных мутантов с измененным фенотипом. Вирус, присутствующий на 12-й день (примечание: в нормальных мышах в это время уже нельзя детектировать вирус), был охарактеризован и обнаружили, что он сохраняет неизмененный ts фенотип (табл. 3). Как и ожидали, ts-1 мутант, включенный в тест в качестве положительного контроля, обнаруживал нестабильный ts фенотип in vivo. Таким образом, в противоположность прежней оценке ts мутантных вирусов в грызунах, эти результаты показывают, что после пролонгированной репликации в грызунах был достигнут высокий уровень стабильности ts фенотипа, что является важным и до сих пор не достигаемым очень желательным свойством вирусов данного изобретения. В шимпанзе
Далее уровень аттенуирования ts потомства cp RSV оценивали в серонегативных шимпанзе, хозяине, наиболее близком к человеку. Опыты на шимпанзе или совинолицых мартышках проводили согласно общему протоколу Richardson et al., J. Med. Virol. 3: 91/100 (1979); Crowe et al., Vaccine (1993) (in press). Один мл суспензии, содержащей приблизительно 104 бляшкообразующих единиц/PFU/мутантного аттенуированиого вируса, вводили интраназально каждому животному. Альтернативным способом является инокуляция RSV как в верхние, так и в нижние дыхательные пути в дозе 104 PFU к каждому сайту. Шимпанзе брали для взятия проб ежедневно в течение 10 дней, затем каждые 3-4 дня до 20-го дня. Пробы из нижних дыхательных путей шимпанзе брали при помощи трахеального лаважа согласно протоколу Shyder et al., J. Infect. Dis. 154: 370-371 (1986) и Crowe et al., Vaccine (1993) (in press). Некоторых животных заражали спустя 4-6 недель вирусом дикого типа. Животных оценивали на признаки респираторного заболевания каждый день при взятии проб из носоглотки. Ринорея, оцениваемая от 0 до 4+, считалась сильным заболеванием верхних дыхательных путей при оценке + 2+ или выше. Вирус выделяли из проб-мазков из носа и горла и жидкостей трахеального лаважа путем инокуляции в чувствительные к RSV HEp-2 клетки, как описано выше. Количество вируса можно также определять непосредственно по методу бляшек с применением HEp-2 клеток, как описано Schnitzer et al., J. Virol. 17: 431-433 (1976). Пробы крови брали перед введением вируса и через 3-4 недели после инокуляции для определения RSV нейтрализующих антител, как описано в Mills et al., J. Immunol. 107: 123-130 (1970). Наиболее ts и аттенуированное потомство cp RSV (cp RSV 248) исследовали и сравнивали с RSV дикого типа и родительским cp RSV (табл. 4). Репликация родительского cp RSV была слегка понижена в носоглотке по сравнению с диким типом, наблюдали снижение ринореи по сравнению с вирусом дикого типа, а также приблизительно 600-кратное уменьшение репликации вируса в нижних дыхательных путях по сравнению с вирусом дикого типа. Ясно, что cp вирус имел значительное ограничение репликации в нижних дыхательных путях шимпанзе, что является очень желательным признаком, не обнаруживаемым ранее при прежних оценках cp RSV в животных и человеке. Более важно то, что cp RSV 248 вирус имел 10-кратное ограничение размножения в носоглотке по сравнению с вирусом дикого типа и это ограничение было связано с заметным уменьшением ринореи. Эти результаты показали, что это производное cp RSV обладает двумя крайне желательными свойствами для живой RSV вакцины, а именно аттенуацией как в верхних, так и в нижних дыхательных путях высокочувствительных серонегативных шимпанзе. Далее оценивали уровень генетической стабильности вируса, присутствующего в дыхательных путях шимпанзе (табл. 5). Вирус, присутствующий в выделениях дыхательных путей, сохранял ts фенотип, и это было видно даже для вируса из шимпанзе N 3 на 8-й день, имеющего 100-кратное снижение титра при 40oC и обнаруживающего фенотип малых бляшек при 40oC, что свидетельствует о том, что его размножение все еще было чувствительным к температуре. Это наиболее генетически стабильный ts мутант, идентифицированный до настоящего времени. Увеличенная стабильность ts фенотипа вирусов cp RSV 248 и cp RSV 530 отражает влияние cp мутаций на генетическую стабильность тех мутаций, которые важны для ts фенотипа in vivo. Таким образом, ts мутации в сочетании с мутациями, присутствующими в родительском вирусе cp 3131, по-видимому, являются более стабильными, чем можно было бы ожидать в их отсутствие. Это важное свойство не было обнаружено и сообщено ранее. Инфицирование шимпанзе вирусом cpts 248 индуцировало высокий титр нейтрализующих антител, а также антител к F и G гликопротеинам (табл. 6). Существенно, что иммунизация при помощи cpts 248 защищала животных от заражения RSV (табл. 7), что указывает на то, что этот мутант действует как эффективный вакцинный вирус в хозяине, близкородственном человеку. Представленные здесь результаты свидетельствуют о том, что cpts 248 вирус обладает многими свойствами, желательными для живой RSV вакцины, в том числе: 1) аттенуацией для верхних и нижних дыхательных путей; 2) повышенной генетической стабильностью после репликации in vivo даже после пролонгированной репликации в животных с супрессией иммунного ответа; 3) удовлетворительной иммуногенностью; 4) значительной защитной эффективностью против заражения RSV дикого типа. Вирус cpts 530 имеет подобную чувствительность бляшкообразования к температуре по сравнению с cpts 248, подобную степень ограничения размножения в носовых раковинах мышей и высокий уровень генетической стабильности в иммунонедостаточной голой мыши. Поэтому он также представляет собой вакцинный штамм RSV. Дальнейшее аттенуирование
Поскольку RS вирус вызывает больше симптомов заболевания нижних дыхательных путей у человека, чем у шимпанзе, и поскольку мутанты, которые удовлетворительно ослаблены для шимпанзе, могут быть недостаточно ослабленными для серонегативных младенцев и детей, производные cpts 248 и 530, обладающие нехарактерными свойствами ts мутантов, а именно, ограниченным размножением и аттенуированием в верхних дыхательных путях и высоким уровнем генетической стабильности, были подвергнуты дальнейшему мутагенезу. Для дальнейшего исследования были выбраны потомства вирусов, которые обнаружили более высокую степень чувствительности к температуре in vitro, чем cpts 248, или которые имели фенотип малых бляшек. Мутантные производные cpts 248, обладающие одной или несколькими дополнительными ts мутациями, получали при помощи мутагенеза в присутствии 5-фторурацила (табл. 8). Ts мутанты, более чувствительные к температуре (ts), чем cpts 248, были идентифицированы и некоторые из них имели фенотип малых бляшек (sp). Эти производные cpts 248 вводили мышам. Мутанты cpts 248/804, 248/955, 248/404, 248/26, 248/18 и 248/240 были более ограничены в размножении в верхних и нижних дыхательных путях мышей, чем их родительский вирус cpts 248 (табл. 9). Таким образом, были идентифицированы жизнеспособные мутанты cpts 248, которые были более аттенуированы, чем cpts 248, и эти производимые cpts 248 обнаружили широкий диапазон действия на размножение в мышах, причем ts 248/26 имел наибольшее ограничение размножения. Ts фенотип вируса, присутствующий в носовых раковинах и легких мышей, был почти идентичен ts фенотипу введенного вируса, что свидетельствует о генетической стабильности. Высокоаттенуированное производное cpts 248, вирус cpts 248/404, был в 100 раз более ограничен в размножении в носоглотке по сравнению с вирусом дикого типа. Мутант cpts 248/404, обладающий по меньшей мере тремя аттенуирующими мутациями, был также значительно ограничен в размножении в верхних и нижних дыхательных путях двух серонегативных шимпанзе и инфекция не вызывала ринореи (табл. 10). Этот вирус также обнаруживал высокую степень ограничения размножения по сравнению с диким типом, имея сниженную в 60000 раз репликацию в носоглотке и в 100000 раз - в легких. Тем не менее эти два шимпанзе были высокоустойчивы к последующему заражению RS вирусом дикого типа (табл. 11). Кроме того, были получены ts производные вируса cpts 530 (табл. 12). Эти результаты представляют собой дальнейшее усовершенствование в свойствах RS вирусов данного изобретения и также являются очень важным и значительным успехом в разработке вакцинных штаммов RS вируса. Эти результаты были совершенно неожиданными, если основываться на опыте, приобретенном во время прежних исследований. Например, результаты более раннего исследования указывали на то, что in vivo свойства ts мутантов RSV, полученных в одном цикле мутагенеза с применением 5-фторурацила, не могут быть предсказаны a priori. Более того, хотя один из первых четырех ts мутантов, полученных этим способом, обнаруживал ту же самую температуру выключения бляшкообразования, что и другие мутанты, он был чрезмерно ослаблен при тестировании в восприимчивых шимпанзе и младенцах и деталях младшего возраста (Wright et al. , Infect. Immun. 37(1): 397-400 (1982). Это свидетельствует о том, что получение ts фенотипа, приводящего к температуре выключения бляшкообразования 37o-38oC, не давало надежно мутанта с желаемым уровнем аттенуирования для восприимчивых шимпанзе, младенцев и детей. Действительно, эти результаты исследований с известными до сих пор мутантами были полностью не способны обеспечить какую-либо основу для вывода о том, что введение трех независимых мутаций (или множества мутаций) в RSV путем пассирования на холоду с последующими двумя последовательными циклами химического мутагенеза могут дать жизнеспособные мутанты, которые сохранят инфекционность для шимпанзе (и, путем экстраполяции, для младенцев) и обнаружат желаемый уровень аттенуирования, иммуногенности и защитную эффективность, требуемые для живой вирусной вакцины, которая могла бы применяться для предотвращения RSV заболевания. Представленные выше вирусы ясно демонстрируют, что определенные ts производные cp RSV данного изобретения являются инфекционными и обнаруживают значительную степень аттенуирования для мышей и шимпанзе. Эти производные ts мутанта аттенуированы и обнаруживают высокую генетическую стабильность после репликации in vivo. Эти мутанты также индуцируют значительную устойчивость к инфекции RSV в шимпанзе. Таким образом эти производные cp RSV представляют собой вирусные штаммы, пригодные для применения в живых вакцинах, предназначенных для предотвращения тяжелого заболевания, вызываемого респираторно-синцитиальным вирусом у человека. Пример II
Применение адаптации к холоду для аттенуирования cp RSV мутантов
Этот пример описывает введение ограничивающих рост мутаций в неполностью аттенуированные cp RSV штаммы с ограниченным кругом хозяев путем дальнейшего пассирования этих штаммов при все более сниженных температурах для получения производных штаммов, более удовлетворительно аттенуированных для использования в вакцинах для человека. Эти подходы адаптации к холоду (ca) были применены для введения дальнейшего аттенуирования в cp RSV 3131 вируса, который неполностью ослаблен в серонегативных детях. При первой стратегии родительский исходный запас популяции пассированного на холоду RSV (cp RSV 3131), полученного из Flow Laboratories, был приготовлен пассированием в MRС-5 клетках при 25oC, как описано в примере 1. Вкратце, пассированный на холоду вирус инокулировали в монослойную культуру MRC-5 или Vero клеток при множественности заражения  0,01 и инфицированные клетки инкубировали в течение 3-14 дней перед последующим пассированием. Вирус пассировали свыше 20 раз при 20-22oC для получения более ослабленного вируса. Способ быстрого пассирования, как только становилось очевидным первое указание на репликацию вируса (т.е. 3-5 дней), был предпочтительным для отбора мутантов, способных эффективно реплицироваться при низких температурах. Дополнительно штамм RSV подгруппы B, St. Louis (14617) 85 клон IAI, был выделен из первичных клеток почек африканской зеленой мартышки, а также пассирован и клонирован в MRC клетках (IAI-M C14) и пассирован на холоду 51 раз в этих клетках при 3-22oC. Вторая стратегия предусматривала применение биологически клонированного производного неклонированного родительского вируса cp RSV 3131. Вирус биологически клонировали в клетках почки эмбриона быка (BEK) (ткань, применяемая для исходного получения вируса cp RSV 3131, - см. Friedewold et al., J. Amer. Med. Assoc. 204: 690-694 (1968). Клонированный вирус затем пассировали с 10-дневными интервалами в Vero клетках при низкой температуре. Альтернативно, вирус cp RSV 3131 клонировали конечным разведением (TD2P4) в MRC-5 клетках и пассировали с 10-дневными интервалами в Vero клетках. Третья стратегия предусматривала отбор мутантов, продуцирующих бляшки при низкой температуре. Было идентифицировано производное вируса RSV cp 3131, названное plaque D1, продуцирующее большие бляшки при 25oC. Этот вирус получали из уровня третьего пассирования (P3) cp 3131-1 (BEK) cp. 3131-17 (BEK) линии. Самую большую бляшку, продуцируемую P3 вирусом, размножали при 32oC, затем получали бляшки при 25oC. Опять выбирали самую большую бляшку, размножали и вновь получали бляшки. После пяти таких циклов был получен мутантный вирус D1 с большими бляшками. D1 клонировали биологически при помощи двух дополнительных циклов очистки при помощи повторения бляшкообразования. Биологически клонированный вирус D1 образует заметно и равномерно большие бляшки при 25oC, чем cp 3131 или вирус A2 дикого типа. Таким образом, D1 адаптирован к холоду согласно критерию большого размера бляшек при 25oC. Предварительные исследования позволили предположить, что D1 не является чувствительным к температуре. При 37oC бляшки D1 неотличимы от бляшек RSV дикого типа или cp 3131, что позволяет предположить, что D1 не ограничен в росте при этой температуре. В соответствии с этим D1 производит сильное цитопатогенное действие в монослоях Vero клеток при 37oC и 40oC (т.е. при самых высоких испытуемых температурах). Пример III
Введение дальнейших аттенуирующих мутацией в ts-RSV. Этот пример описывает применение ts мутантов в качестве родительских вирусов для получения более полно аттенуированных штаммов. Для этого способа выбирали два ts мутанта RSV A2, а именно ts-4 и ts-1 NG 1. Для введения дополнительных мутаций в ts мутантный RSV были выбраны два разных способа. Во-первых, неполностью аттенуированный ts мутант RSV подвергали химическому мутагенезу и мутантные потомства, которые были более чувствительны к температуре относительно бляшкообразования, отбирали для дальнейшего анализа. Во-вторых, ts мутанты RSV пассировали при низкой температуре для отбора ts мутантов RSV с ca фенотипом, т.е. с увеличенной способностью размножаться при субоптимальной температуре по сравнению с родительским вирусом дикого типа. Родительскую исходную популяцию ts-1 NG-1 вируса готовили из ts-1 NG-1 мутанта живого RSV (A-2) из Flow Laboratories Lot M2, росшего в MRC-5 клетках. Этот мутант, полученный из ts-1 мутанта во втором цикле мутагенеза в присутствии 5-фторурацила, имеет две или более независимых ts мутаций, но все еще вызывает ринорею в восприимчивых к нему шимпанзе. Вирус пассировали дважды в Vero клетках при 32oC для получения ts - 1NG-1 суспензии для мутагенеза. Затем вирус выращивали в присутствии 410-4 М 5-фторурацила для индуцирования мутаций во время репликации или экспонировали с 5-азацитидином при 36oC после обработки 5-фторурацилом. Затем мутантную популяцию анализировали при помощи теста бляшкообразования на Vero клетках, которые выдерживали под верхним слоем агара и после определенного периода времени инкубации бляшки идентифицировали микроскопически. Затем извлекали 596 бляшек и потомство каждой бляшки отдельно размножали при помощи роста на свежих монослоях Vero клеток. Содержимое каждой из культур ткани, инокулированных потомством отдельной бляшки мутагенизированного вируса ts-1 NG-1, собирали отдельно при достижении максимальных цитопатогенных эффектов на Vero клетках. Потомство вируса, более чувствительное к температуре, чем ts-1 NG-1, находили титрованием пулов бляшек на HEp-2 клетках при 32oC и 36oC. Каждый вирус, обнаруживающий большую чувствительность к температуре, чем ts-1 NG-1 (т.е. 100-кратное снижение титра при ограничивающей температуре (36oC) по сравнению с 32oC), оценивали далее. Были идентифицированы шесть потомств бляшек, более ts, чем ts-1 NG-1 RSV. Эти штаммы клонировали биологически серийной очисткой с применением бляшкообразования на Vero клетках (3 раза) и затем размножали на Vero клетках. Клонированные штаммы титровали при 32oC, 35oC, 36oC, 37oC и 38oC (тестом эффективности бляшкообразования) для подтверждения их ts фенотипов. Данные эффективности бляшкообразования, полученные на HEp-2 клетках, дали дальнейшее подтверждение фенотипов шести мутантов (табл. 13). Два наиболее ts (чувствительных к температуре) вируса, A-20-4 и A-37-8, были сильно аттенуированы в мышах по сравнению с их родительским вирусом ts-1 NG-1, что свидетельствует о том, что приобретение увеличенного уровня чувствительности к температуре сопровождается увеличенной аттенуацией (табл. 14). Эти вирусы были инфекционными для мышей, так как они индуцировали образование антител. Вирус ts-1 NG 1/A-20-4 аттенуирован для шимпанзе (табл. 15) и инфицирование шимпанзе ts-1 NG 1/A-20-4 вызывало устойчивость к заражению вирусом дикого типа (табл. 16). Важным является то, что ринорея не наблюдалась. Проводили также мутагенез вируса ts-4 при помощи того же способа, который применяли для мутагенеза вируса ts-1 NG-1. Пять потомств бляшек, более чувствительных к температуре, чем родительский вирус ts-4 RSV, были идентифицированы (табл. 17). Мутации были введены также в ts-1 NG-1 и ts-4 вирусы пассированием на холоду. Вирус ts-4 размножается до высокого титра при 22oC после 38 пассирований на холоду. Исследования на человеке
Аттенуированный вирус изобретения вводили человеку в соответствии с хорошо упрочившимися протоколами для RS вакцин, предназначенных для человека, описанных, например, в Wright et al., Infect. Immun. 37: 397-400 (1982), Kim et al., Pediatrics 52: 56-63 (1973) и Wright et. al., J. Pediatr. 88: 931-936 (1976), которые включены в качестве ссылки. Вкратце, взрослых или детей инокулировали интраназально в виде капель с 103 - 105 PFU аттенуированного вируса на мл в объеме 0,5 мл. Образование антител оценивали фиксацией комплемента, нейтрализацией бляшек и(или) твердофазным иммуноферментным анализом. Наблюдали появление признаков и симптомов заболевания верхних дыхательных путей у индивидуумов. Как и при введении шимпанзе, аттенуированный вирус вакцины растет в носоглотке вакцинированных индивидуумов при уровнях, приблизительно более чем в 10 раз более низких по сравнению с уровнями вируса дикого типа и приблизительно в 10 раз или менее при сравнении с уровнями cp RSV, или другого неполностью аттенуированного родительского штамма. Последующие иммунизации проводили периодически по необходимости для поддержания достаточных уровней защитного иммунитета. Из вышесказанного должно быть понятно, что хотя здесь описаны специфические варианты изобретения для иллюстрации и понимания, могут быть введены различные модификации без отхода от духа и сферы действия данного изобретения. Соответственно этому, изобретение не ограничивается за исключением ограничений, указанных в формуле изобретения.
Формула изобретения
1. Вакцинная композиция против респираторно-синцитиального вируса, включающая чувствительный к температуре (ts) мутант вируса, отличающаяся тем, что содержит в физиологически приемлемом носителе один аттенуированный респираторно-синцитиальный вирус, по меньшей мере, с двумя аттенуированными мутациями, который выбран из чувствительных к температуре мутантов пассированного на холоду респираторно-синцитиального вируса, с ограниченным кругом хозяев, или адаптированных к холоду мутантов, пассированного на холоду респираторно-синцитиального вируса с ограниченным кругом хозяев или чувствительных к температуре мутантов респираторно-синцитиального вируса, имеющих дополнительные температурно-чувствительные мутации. 2. Вакцинная композиция по п.1, отличающаяся тем, что содержит, кроме того, адъювант для усиления иммунного ответа. 3. Вакцинная композиция по п.1, отличающаяся тем, что вирус представляет собой пассированный на холоду респираторно-синцитиальный вирус с ограниченным кругом хозяев, который был аттенуирован далее введением одной или нескольких дополнительных мутаций, которые делают вирус чувствительным к температуре или неспособным образовывать бляшки нормального размера на культуре ткани. 4. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что аттенуированный вирус представляет собой пассированный на холоду респираторно-синцитиальный вирус с ограниченным кругом хозяев, который пассировали на холоду при температурах приблизительно 20 - 25oC для дальнейшей аттенуации вируса и превращения его в адаптированный к холоду вирус. 5. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что аттенуированный вирус представляет собой ts-1 NG-1, который был аттенуирован далее введением одной или нескольких мутаций при помощи пассирования на холоду или химического мутагенеза, которые делают вирус неспособным к образованию бляшек нормального размера на культуре ткани или более чувствительным к температуре. 6. Вакцина по п.5, отличающаяся тем, что вирус ts-1 NG-1 аттенуирован далее введением по меньшей мере одной мутации. 7. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что аттенуированный вирус представляет собой ts-4, который был аттенуирован далее введением одной или нескольких мутаций при помощи пассирования на холоду или химического мутагенеза, которые делают вирус неспособным к образованию бляшек нормального размера на культуре ткани или более чувствительным к температуре. 8. Вакцина по п.7, отличающаяся тем, что ts-4 вирус аттенуирован далее введением по меньшей мере одной мутации. 9. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что аттенуированный вирус относится к подгруппе А или В. 10. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что аттенуированный вирус является А2 штаммом подгруппы А. 11. Вакцинная композиция по п.1, отличающаяся тем, что аттенуированный респираторно-синцитиальный вирус выбран из группы: (i) cpts RSV 248, 248/404, 248/804, 248/955, cpts sp RSV 248/1288; (ii) cpts RSV 475; (iii) cpts RSV 530, 530/9, 530/346, 530/653, 530/667, 530/403, 530/188, 530/464, 530/1009, 530/1178, 530/1074, 530/963, 530/977, 530/1030, 530/1003; (iv) cp RSV 3131 D1; (v) RSV ts-1 NG 1/A-20-4, A-37-8, A-15-7, A-25-8, A-21; (vi) RSV ts-4/F-15-8, F-19-1, F-20-7, F-29-7, F-31-2. 12. Вакцинная композиция по п.1, отличающаяся тем, что аттенуированный респираторно-синцитиальный вирус выбран из группы: (i) cpts RSV 248, 248/404, 248/804, 248/955, cpts sp RSV 248/1228; (ii) cpts 530; (iii) cpts RSV 3131 D1; (iv) RSV ts-1 NG 1/A-20-4, A-37-8; (v) RSV ts -4/F-19-1, F-29-7. 13. Вакцинная композиция по п.1, отличающаяся тем, что аттенуированный распираторно-синцитиальный вирус выбран из группы: (i) cpts RSV 248, 248/404; (ii) cpts RSV 530; (iii) RSV ts-1 NG 1/A-20-4, A-37-8; (iv) RSV ts -4/F-19-1, F-29-7. 14. Вакцинная композиция по п.1, отличающаяся тем, что аттенуированный респираторно-синцитиальный вирус выбран из группы: (i) cpts RSV 248/404; (ii) cpts RSV 530; (iii) RSV ts-1 NG 1/A-20-4. 15. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что содержит аттенуированный вирус в дозе 103-106 PFU. 16. Способ стимулирования иммунной системы индивидууама для индукции защиты против респираторно-синцитиального вируса, отличающийся тем, что осуществляют введение индивидуума иммунологически достаточного количества одного аттенуированного респираторно-синцитиального вируса, по меньшей мере, с двумя аттенуированными мутациями, который выбран из чувствительных к температуре мутантов пассированного на холоду респираторно-синцитиального вируса, с ограниченным кругом хозяев, или адаптированных к холоду мутантов, пассированного на холоду респираторно-синцитиального вируса с ограниченным кругом хозяев или чувствительных к температуре мутантов респираторно-синцитиального вируса, имеющих дополнительные температурно-чувствительные мутации, в физиологически приемлемом носителе. 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что вирус является пассированным на холоду респираторно-синцитиальным вирусом с ограниченным кругом хозяев, который был аттенуирован далее введением двух или нескольких мутаций, которые делают вирус чувствительным к температуре или неспособным к образованию бляшек нормального размера в культуре ткани. 18. Способ по п.16, отличающийся тем, что аттенуированный вирус является пассированным на холоду респираторно-синцитиальным вирусом с ограниченным кругом хозяев, который был пассирован на холоду при температурах приблизительно 20 - 25oC для дальнейшей аттенуации вируса и превращения его в адаптированный к холоду вирус. 19. Способ по п.16, отличающийся тем, что аттенуированный вирус является вирусом ts-1 NG-1 или ts-4, который был аттенуирован введением одной или более мутаций при помощи пассирования на холоду или химического мутагенеза, которые делают вирус неспособным к образованию бляшек нормального размера на культуре ткани или более чувствительным к температуре. 20. Способ по п.16, отличающийся тем, что аттенуированный респираторно-синцитиальный вирус выбран из группы: (i) cpts RSV 248, 248/404, 248/804, 248/955, cpts sp RSV 248/1228; (ii) cpts RSV 475; (iii) cpts RSV 530, 530/9, 530/346, 530/653, 530/667, 530/403, 530/188, 530/464, 530/1009, 530/1178, 530/1074, 530/963, 530/977, 530/1030, 530/1003; (iv) cp RSV 3131 D1; (v) RSV ts-1 NG 1/A-20-4, A-37-8, A-25-8, A-15-8, A-21; (vi) RSV ts-4/F-15-8, F-19-1, F-20-7, F-29-7, F-31-2. 21. Способ по п.16, отличающийся тем, что аттенуированный респираторно-синцитиальный вирус выбран из группы: (i) cpts RSV 248, 248/404, 248/804, 248/955, cpts sp RSV 248/1228; (ii) cpts RSV 530; (iii) cpts RSV 3131 D1; (iv) RSV ts-1 NG 1/A-20-4, A-37-8; (v) RSV ts-4/F-19-1, F-29-7. 22. Способ по п.16, отличающийся тем, что аттенуированный респираторно-синцитиальный вирус выбран из группы: (i) cpts RSV 248, 248/404; (ii) cpts RSV 530; (iii) RSV ts-1 NG 1/A-20-4, A-37-8; (iv) RSV ts-4/F-19-1, F-29-7. 23. Способ по п.16, отличающийся тем, что аттенуированный респираторно-синцитиальный вирус выбран из группы: (i) cpts RSV 248/404; (ii) cpts RSV 530; (iii) RSV ts-1 NG 1/A-20-A. 24. Способ по п.16, отличающийся тем, что аттенуированный вирус вводят индивидууму в количестве 103-106 PFU. 25. Способ по п.16, отличающийся тем, что аттенуированный вирус вводят в верхние дыхательные пути индивидуума. 26. Способ по п.25, отличающийся тем, что аттенуированный вирус вводят в носоглотку. 27. Способ по п.25, отличающийся тем, что аттенуированный вирус вводят при помощи распыляемого раствора, капель или аэрозоля. 28. Способ по п.16, отличающийся тем, что аттенуированный вирус вводят индивидууму, серонегативному в отношении антител к этому вирусу. 29. Способ по п.16, отличающийся тем, что аттенуированный вирус вводят индивидууму, серопозитивному в отношении упомянутого вируса. Приоритет по пунктам:
21.04.92 - по пп. 1-11, 13-19 и 24-29;
09.04.93 - по пп. 1-29. |
