РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ

(54) ПОЛИПЕПТИД ОЖИРЕНИЯ (ОВ)(ВАРИАНТЫ), ЕГО АНАЛОГ (ВАРИАНТЫ) И СЛИТЫЙ БЕЛОК (ВАРИАНТЫ), ИЗОЛИРОВАННАЯ МОЛЕКУЛА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, МОЛЕКУЛА ДНК, РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВЕКТОР КЛОНИРОВАНИЯ, РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВЕКТОР ЭКСПРЕССИИ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, МОНОКЛОНАЛЬНОЕ И ПОЛИКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине при диагностике и лечении патологических состояний, связанных с нарушением регуляции веса тела человека, а также в животноводстве и ветеринарии. В изобретении раскрыты аминокислотные последовательности двух изоформ полипептида ожирения (ОВ) человека, обладающих способностью модулировать вес тела животного, их предшественники, содержащие сигнальный пептид, аналоги, получаемые в результате вставок, делеции и аминокислотных замен, которые сохраняют активность, присущую немодифицированным формам ОВ-полипептидов, а также поликлональные и моноклональные антитела, специфически взаимодействующие с новыми модуляторами веса тела. Охарактеризованы последовательности ДНК, кодирующие названные полипептиды и их аналоги; описаны содержащие эти последовательности векторные конструкции, с помощью которых получены рекомбинантные формы полипептидов OB по изобретению. Предлагается использовать новые полипептиды и их аналоги в качестве активного начала в фармацевтических композициях. Применение настоящего изобретения может внести существенный вклад в решение задачи обеспечения медицины, ветеринарии и животноводства эффективным средством для снижения веса тела. 18 с. и 5 з.п., 35 ил., 12 табл.

ОБЛАСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение в целом относится к контролированию веса млекопитающих, включая животных и человека, и более конкретно, к реагентам, которые идентифицированы здесь как модуляторы веса, а также к диагностическому и терапевтическому применению модуляторов.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ожирение рассматривается как избыток жировых отложений по отношению к мышечной массе тела и связано со многими важными физиологическими и медицинскими нарушениями, в том числе гипертензией, повышенным содержанием липидов в крови, диабетом типа II или инсулин-независимым сахарным диабетом (NIDDM). В США NIDDM страдают 6-10 млн человек, включая 18% населения в возрасте около 65 лет (Harris et al., Int. J. Obes., 11: 275-283 (1987)). Примерно 45% мужчин и 70% женщин, больных NIDDM, страдают от ожирения, и тяжесть их заболевания существенно снижается или элиминируется при уменьшении веса (Harris, Diabetes Care, 14 (3): 639-648 (1991)). Как описано ниже, и NIDDM, и ожирение строго наследуются несмотря на то, что гены предрасположенности к данным заболеваниям еще не идентифицированы. Молекулярно-генетические процессы, лежащие в основе указанных метаболических нарушений, составляют важную, плохо изученную проблему.

Ассимиляция, запасание и использование энергии питательных веществ образуют сложную гомеостатическую систему, обеспечивающую выживание многоклеточных организмов. Среди наземных млекопитающих запасание в жировой ткани больших количеств метаболического «топлива» в форме триглицеридов является критическим фактором выживания в условиях нехватки пищи. Необходимость поддержания определенного уровня запасов энергии без постоянных изменений размеров и формы тела требует достижения заданного равновесия между потреблением и расходом энергии. Однако молекулярные механизмы, регулирующие энергетический баланс, остаются неизученными. Получение молекул, которые передают информацию о питательных компонентах и контролируют энергетический баланс, является ключевым моментом понимания механизмов регулирования веса тела, столь важных для развития заболеваний и поддержания здоровья.

Степень ожирения индивидуума в значительной степени генетически детерминирована. Изучение соответствия веса тела и ожирения у монозиготных и дизиготных близнецов и их биологических родителей позволяет предположить, что степень наследования ожирения (0.4-0.8) превышает соответствующие величины для других нарушений, в развитие которых (как считается общепринятым) вовлечен значимый генетический компонент, например шизофрении, алкоголизма и атеросклероза (StunKard et al., N. Engl. J. Med., 322: 1483-1487 (1990)). Сообщалось также о семейном сходстве в уровнях расходования энергии (Bogardus et al., Diabetes, 35: 1-5 (1986)). Генетический анализ в географически ограниченных популяциях позволяет высказать предположение, что относительно небольшое количество генов может обусловливать 35-50% вариации состава тела (Moll et al., Am. J. Hum. Genet., 49: 1243-1255 (1991)). Однако ни один из генов, ответственных за ожирение в популяции в целом, не картирован в каком-либо хромосомальном локусе.

Модели ожирения на грызунах включают семь явных мутаций в отдельных генах. Наиболее изученными у мышей мутациями, связанными с ожирением, являются мутации в ob (ожирение)- и db (диабет)-генах. При функционировании на одном генетическом фоне гены ob и db приводят к возникновению метаболически и поведенчески неразличимых фенотипов, позволяя предположить, что указанные гены могут функционировать сходным физиологическим путем (Coleman et al., Diabetologia, 14: 141-148, 1978). Мыши, гомозиготные по двум мутациям, отличаются гиперфагичностью и гипометаболизмом, что приводит к фенотипу ожирения, выявляемому в возрасте одного месяца. Вес этих животных стабилизируется на уровне 60-70 г (в сравнении с 30-35 г у контрольных животных). Ob и db животные обнаруживают огромное число других гормональных и метаболических нарушений, которые определенным образом мешают выявить первичный дефект, обусловленный мутацией (Bray et al., Am. J. Clin. Nutr., 50: 891-902 (1989)).

Каждая из моделей ожирения на грызунах характеризуется изменениями углеводного метаболизма, напоминающими диабет типа II у человека. В некоторых случаях тяжесть диабета частично зависит от фона, свойственного данной линии мышей (Leiter, Endocrinology, 124: 912-922 (1989)). Как у ob, так и у db конгенных мышей C57BL/Ks развивается тяжелый диабет с некрозом b-клеток и атрофией островков, что приводит к относительной инсулинопении. В противоположность этому ob и db конгенные мыши C57BL/6J характеризуются транзиторным инсулин-устойчивым диабетом, который полностью компенсируется гипертрофией b-клеток, свойственной диабету типа II человека.

Фенотип ob и db мышей при сопоставлении с ожирением у человека проявляется иным образом, чем развитие диабета. Мутантные мыши едят больше и тратят меньше энергии, чем контрольные животные (так же, как и люди, страдающие ожирением). Такой фенотип практически совпадает с фенотипом животных с нарушениями вентромедиального гипоталамуса. Это позволяет предположить, что обе мутации способны взаимодействовать со способностью надлежащим образом объединять или отвечать на информацию о питательных компонентах в пределах центральной нервной системы. В поддержку этой гипотезы свидетельствуют результаты экспериментов по парабиозу (Coleman, Diabetologia, 9: 294-298 (1973)), из которых следует, что ob мыши дефектны по циркулирующему в крови фактору насыщения, а db мыши устойчивы к воздействиям ob фактора (возможно за счет дефекта ob-рецептора). Указанные эксперименты позволяют заключить, что ожирение у мутантных мышей может являться результатом различных дефектов в афферентной петле и/или интегрированном центре механизма обратной связи, контролирующем состав тела.

При использовании молекулярных и классических генетических маркеров ob и db гены картированы на проксимальной хромосоме 6 и средней хромосоме 4 соответственно (Bahary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8642-8646 (1990); Friedman et al., Genomics, 11: 1054-1062 (1991)). В обоих случаях мутации картированы в участках мышиного генома, аналогичных таковым человека, позволяя предположить, что если существуют человеческие аналоги ob и db, они с большей вероятностью будут картированы на хромосомах человека 7q и 1р соответственно. Дефекты гена db могут приводить к ожирению других видов млекопитающих: в генетических сращиваниях между крысами Zucker fa/fa и крысами Brown Norway +/+ мутация fa (хромосома 5 крысы) фланкирована тем же самым локусом, который фланкирует db-ген мыши (Truett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7806-7809 (1991)).

Поскольку многочисленные факторы влияют на вес тела, практически невозможно предсказать, какие факторы и, что более важно, какие гомеостатические механизмы в первую очередь определяют вес тела. Таким образом, принципиальная проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, связана с получением модуляторов веса тела, которые обеспечивают контроль ожирения и содержания жира у млекопитающих.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с настоящим изобретением проблема контроля ожирения и содержания жира у животных, особенно у млекопитающих, решается посредством получения полипептидов ожирения (OB) и молекул нуклеиновых кислот, кодирующих указанные полипептиды. Настоящее изобретение относится в первую очередь к выделенным полипептидам, полезным для модуляции, т.е, контроля и регулирования веса тела и ожирения, а также к нуклеиновым кислотам, кодирующим указанные полипептиды, которые не только обеспечивают возможность получения рекомбинантных полипептидов OB, но и сами по себе могут использоваться для модуляции веса тела.

Полипептиды ожирения (ОВ), согласно настоящему изобретению имеющие примерно от 145 до около 167 аминокислот, способны к модуляции веса тела животных, в особенности млекопитающих, и включают аллельные варианты или аналоги, в том числе фрагменты, обладающие сходной биологической активностью. Полипептиды могут быть получены рекомбинантным путем или в результате химического синтеза. Предпочтительные полипептиды ОВ включают соединения, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NOS: 2, 4, 5 или 6 или их аллельные варианты или аналоги, в том числе фрагменты.

Имуногенные фрагменты полипептидов ОВ согласно данному изобретению включают: Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lhs-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr (SEQ ID NO:18); Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-GIn-Thr-Leu-Ala (SEQ ID NO:19); Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (SEQ ID NO:20); и Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys (SEQ ID NO:21). Аналоги полипептида ОВ человека имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NOS: 4 и 6 при том, что одна или более аминокислот в положениях 53, 56, 71, 85, 89, 92, 95, 98, 110, 118, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 132, 157, 159, 163 и 166 (в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID NO:4) замещены другими аминокислотами, такими как дивергентные аминокислоты полипептида ОВ мыши, в соответствии с SEQ ID NO:2 или аланин. Указанные аналоги также включают следующие: (а) остаток серина в положении 53 замещен на глицерин, аланин, валин, цистеин, метионин или треонин; (б) остаток серина в положении 98 замещен на глицин, аланин, валин, цистеин, метионин или треонин; и (в) остаток аргинина в положении 92 замещен на аспарагин, лизин, гистидин, глутамин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, серин, треонин, метионин или цистеин. Аналог полипептида ОВ в соответствии с изобретением предпочтительно на 83% и более гомологичен по аминокислотной последовательности полипептиду ОВ с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, 4, 5 или 6. Дополнительные аналоги полипептида ОВ человека в соответствии с данным изобретением имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NOS: 4 и 6 при том, что: (а) один или более остатков аспарагиновой кислоты замещены глутаминовой кислотой; (б) один или более остатков изолейцина замещены лейцином; (в) один или более остатков глицина или валина замещены аланином; (г) один или более остатков аргинина замещены на гистидин; (д) один или более остатков тирозина или фенилаланина замещены на триптофан; (е) один или более остатков в положениях 121-128 (в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID NO:4) замещены на глицин или аланин и (ж) один или более остатков в положениях 54-60 или 118-166 (в соответствии с последовательностью SEQ ID NO:4) замещены на лизин, глутаминовую кислоту, цистеин или пролин. Предпочтительные усеченные аналоги полипептидов ОВ человека, согласно настоящему изобретению, включают следующие соединения (в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID NO:4): (а) один или более остатков в положениях 121-128 делетированы; (б) остатки 1-116 делетированы; (в) остатки 1-21 и 54-167 делетированы; (в) остатки 1-21 и 54-167 делетированы; (г) остатки 1-60 и 117-167 делетированы; (д) остатки 1-60 делетированы; (е) остатки 1-53 делетированы и (ж) аналог в соответствии с (а) при том, что остатки 1-21 делетированы. Полипептиды ОВ и аналоги полипептида ob, полученые согласно настоящему изобретению, утратившие 21 аминокислоту сигнальной последовательности (например, аминокислоты 1-21 последовательности SEQ ID NO:4), могут иметь N-концевую аминокислоту или аминокислотную последовательность, такую как (1) метионин, (2) глицин-серин-гистидин-метиониновую последовательность (SEQ ID NO:38), (3) метионин-глицин-серин-серин-гастидин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-серин-серин-глицин-лейцин-валин-пролин-аргинин-глицин-серин-гистидин-метиониновую последовательность (SEQ ID NO:98), (4) лейцин-глутаминовая кислота-лизин-аргинин-глутаминовая кислота-аланин-глутаминовая кислота-аланиновую последовательность (SEQ ID NO:26), (5) глутаминовая кислота-аланин-глутаминовая кислота-аланиновую последовательность (SEQ ID NO:27), (6) лейцин-глутаминовая кислота-лизин-аргининовую последовательность (SEQ ID NO:28), (7) метионин-глицин-серин-серин-гистилин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-серин-серин-глицин-лейцин-валин-пролин-аргинин-глицин-серин-пролиновую последовательность (SEQ ID NO:99) и (8) глицин-серин-пролиновую последовательность.

Производные полипептида ОВ в соответствии с изобретением имеют одну или более прикрепленных химических групп, включая водорастворимые полимеры, такие как полиэтиленгликоль. Производные, полученные с помощью полиэтиленгликоля, могут быть моно-, ди-, три- или тетрапэгированными, например, монопэгированы на N-концевом участке.

Предпочтительные монопэгированные на N-концевом участке производные полипептидов ob, согласно настоящему изобретению, включают полипептиды OB, содержащие аминокислотные остатки 22-167 последовательности SEQ ID NO:4 или остатки 22-166 последовательности SEQ ID NO:6 и факультативно содержащие (пэгированный) метионин в положении 21.

Выделенные молекулы нуклеиновых кислот, полученные согласно настоящему изобретению, кодируют полипептид OB, аллельный вариант или аналог, в том числе фрагменты, как описано выше. Особо важные ДНК-молекулы для использования с целью обеспечения безопасной экспрессии полипептида ОВ обладают биологической активностью, модулирующей вес тела млекопитающих, и выбраны из группы, включающей: (а) ДНК- молекулы с последовательностями SEQ ID NO:1 и 3 или их фрагменты, (б) ДНК-молекулы, способные гибридизоваться с ДНК-молекулами, определенными в (а) или с их фрагментами, и (в) ДНК-молекулы, определяющие экспрессию аминокислотной последовательности, кодируемую любой из указанных выше ДНК-молекул. Примерами таких молекул служат геномные ДНК-молекулы с последовательностями SEQ ID NOS: 22 и 24. Предпочтительные ДНК-молекулы, согласно настоящему изобретению, кодируют полипептид, имеющий следующую аминокислотную последовательность: (a) SEQ ID NO:2, (б) аминокислоты 22-167 последовательности SEQ ID NO:2, (в) SEQ ID NO:4, (г) аминокислоты 22-167 последовательности SEQ ID NO:4, (д) SEQ ID NO:5, (e) аминокислоты 22-166 последовательности SEQ ID NO:5, (ж) SEQ ID NO:6 и (з) аминокислоты 22-166 последовательности SEQ ID NO:6. Кроме того, указанные ДНК-молекулы кодируют полипептиды, имеющие N-концевую аминокислоту или аминокислотную последовательность, приведенную ранее. Например, предпочтительная ДНК-молекула имеет последовательность, представленную как белок-кодирующая последовательность SEQ ID NO:3, и, в особенности, последовательность, кодирующая аминокислоты 22-167.

Кроме того, изобретение относится к нуклеиновым кислотам с выявляемой меткой, которые гибридизуются с заявленными нуклеиновыми кислотами. Такие нуклеиновые кислоты, в частности, гибридизуются с некодирующим участком нуклеиновой кислоты OB, выбранным из группы, включающей интрон, 5'-некодирующий участок и 3'-некодирующий участок. Настоящее изобретение также относится к олигонуклеотилным праймерам для амплификации геномной ДНК человека, кодирующей полипептид ob, например, олигонуклеотилам 29-32 последовательности SEQ ID NOS:29.

Заявленные согласно настоящему изобретению векторы содержат ДНК-молекулу, полученную в соответствии с изобретением, как описано выше, и предпочтительно представляют собой векторы экспрессии, включающие ДНК-молекулу, функционально связанную с последовательностью, контролирующей экспрессию. Одноклеточные клетки-хозяева в соответствии с изобретением трансформированы или трансфицированы ДНК-молекулами или векторами, описанными выше. Предпочтительные клетки-хозяева включают бактерии, дрожжи, клетки млекопитающих, клетки растений, клетки насекомых и клетки человека в культуре тканей. Например, такие клетки-хозяева выбирают из группы, включающей Е. Coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, дрожжи, СНО-, R1.1-, B-W-, L-M-, COS 1-, COS7-, BSC1-, BSC40-, ВМТ10- и Sf9-клетки. Предпочтительными дрожжевыми хозяевами являются Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula u Torulopsis. Объектом изобретения являются также клетки млекопитающих, содержащие ДНК-последовательность, кодирующую полипептид ob, и модифицированные in vitro для облегчения повышенной экспрессии полипептида ob путем гомологичной рекомбинации, при которой происходит встраивание регуляторной последовательности экспрессии в функциональной близости от последовательности, кодирующей полипептид ob. Регуляторная последовательность экспрессии может быть соответствующей последовательности для полипептида ob или нет и способна замещать мутантную регуляторную последовательность полипептида ob в клетке.

Настоящее изобретение относится также к способам получения полипептида ob, включающим: (а) культивирование клетки, описанной выше, в условиях, обеспечивающих экспрессию полипептида ob, и (б) выделение экспрессированного полипептида. Указанная процедура может сопровождаться следующими стадиями: (в) хроматографией полипептида на Ni-хелатирующей колонке и (г) очисткой полипептида путем гель-фильтрации. В предпочтительном варианте осуществления изобретения после стадии (в) и перед стадией (г) осуществляют хроматографию полипептида ob на сильной катионообменной колонке.

Настоящее изобретение относится также к меченным и немеченным моноклинальным и поликлональным антителам, специфическим к заявленным полипептидам ob, и бессмертным клеточным линиям, продуцирующим моноклонные антитела в соответствии с изобретением. Получение антител, согласно настоящему изобретению, включает следующие стадии: (а) конъюгацию полипептида ob с белком-носителем, (б) иммунизацию животного-хозяина конъюгатом «фрагмент полипептида ob/белок-носитель», полученным на стадии (а) и смешанным с адъювантом, и (в) выделение антитела из иммунизированного животного-хозяина.

Изобретение относится к способам определения присутствия полипептида OB в образце, включающим: (а) контактирование образца, предпочтительно содержащего полипептид OB, с антителом (предпочтительно связанным с твердой подложкой), которое специфически связывается с полипептидом OB в условиях, обеспечивающих образование реакционных комплексов, содержащих антитело и полипептид ОВ, и (б) выявление образования реакционных комплексов, содержащих антитело и полипептид ob, в образце при том, что выявление образования реакционных комплексов свидетельствует о присутствии полипептида ОВ в образце. Соответственно изобретение относится к способам оценки in vitro уровня полипептида OB в биологическом образце, включающим: (а) выявление образования реакционных комплексов в биологическом образце в соответствии со способом, описанным выше, и (б) оценку количества образовавшихся реакционных комплексов, которое соответствует уровню полипептида OB в биологическом образце. Когда выявляют или диагностируют заболевание, ассоциированное с повышенным или пониженным уровнем полипептида OB в соответствии с изобретением, оценку уровня проводят, как описано выше, и выявленное значение сравнивают со значением уровня полипептида OB у здоровых индивидуумов или же у данного индивидуума в более раннее время. Увеличение уровня полипептида ОВ по сравнению с нормальным или предшествующим уровнем свидетельствует о наличии заболевания, ассоциированного с повышенным уровнем полипептида OB, а снижение уровня полипептида OB по сравнению с нормальным свидетельствует о наличии заболевания, ассоциированного с пониженным уровнем полипептида OB. Соответственно в объем изобретения включены способы мониторинга in vitro терапевтического лечения заболевания млекопитающего, ассоциированного с повышенным или пониженным уровнем полипептида ОВ, предусматривающие оценку уровня полипептида ОВ (как описано выше) в серии биологических образцов, полученных в различные временные точки от млекопитающего, подвергающегося указанному терапевтическому лечению.

Полученные согласно настоящему изобретению фармацевтические композиции содержат полипептид ОВ, описанный выше, и фармацевтически приемлемый носитель и используются при осуществлении терапевтических способов для снижения веса тела животного. Дополнительные фармацевтические композиции, полученные согласно настоящему изобретению для использования при осуществлении терапевтических способов с целью увеличения веса тела животного, содержат антагонист полипептида ОВ, предпочтительно выбранный из группы, включающей: антитело, которое связывается с полипептидом ОВ и нейтрализует его активность, фрагмент полипептида ob, который связывается с рецептором полипептида ОВ, но не активирует его, и небольшую молекулу-антагонист полипептида OB. Кроме того, изобретение относится к соответствующим косметическим композициям, улучшающим внешний вид тела, для снижения или увеличения веса тела индивидуума, которые используются при осуществлении косметических процедур, улучшающих внешний вид тела индивидуума. Такие косметические композиции используются в количественной дозе, достаточной для моделирования веса тела индивидуума до заданного уровня.

Изобретение также относится к применению молекул нуклеиновых кислот, полученных согласно настоящему изобретению, а также молекул антисмысловых нуклеиновых кислот, способных гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, кодирующей заявленный полипептид OB, для приготовления медикамента, модифицирующего вес тела животного (например, для генной терапии). Кроме того, изобретение относится к применению полипептида ОВ или соответствующего антагониста для получения медикамента, модифицирующего вес тела животного. Полученные таким образом медикаменты могут использоваться для модификации веса тела млекопитающего в процессе лечения заболевания, выбранного из группы, включающей диабет, высокое кровяное давление и повышенный уровень холестерина. Такая модификация является частью комбинированной терапии данного заболевания с помощью соответствующих лекарственных препаратов. Указанные выше медикаменты могут быть применимы в терапевтических способах внутривенным, внутриартериальным, интраперитонеальным, внутримышечным, подкожным, назальным, оральным или пульмональным путем.

Приведенные в настоящем описании сведения показывают, что полипептиды ОВ, полученные согласно данному изобретению, именно в такой форме первоначально секретируются из адипоцитов млекопитающих и функционируют по типу гормонов.

Приведенные примеры показывают, что полипептид ОВ, альтернативно обозначенный «лептином» циркулирует в плазме крови мыши, крысы и человека. Лептин отсутствует в плазме крови мышей ob/ob и обнаруживается в десятикратных концентрациях в плазме крови db/db-мышей и в двадцатикратных концентрациях в плазме крови крыс fa/fa. Более того, ежедневные инъекции рекомбинантного лептина существенно уменьшают массу тела ob/ob-мышей, в значительной степени влияют на вес тела мышей дикого типа и не оказывают эффекта на мышей db/db.

Кроме того, полипептид ob одного вида животного биологически активен в организме животного другого вида. В особенности, полипептид ОВ активен в организме мышей.

В первую очередь, модуляторы, заявленные согласно настоящему изобретению, включают молекулы нуклеиновых кислот, в том числе молекулы рекомбинантных ДНК (например, кДНК, или вектора, содержащего кДНК, или выделенной геномной ДНК) или клонированные гены (т.е. выделенные геномные ДНК) или их варианты, полученные на основе вырожденности генетического кода, которые кодируют полипептиды, являющиеся модуляторами контроля веса тела, как описано ниже, или консервативные варианты или фрагменты таких полипептидов, в особенности фрагменты полипептидов, утративших сигнальный пептид (альтернативно называемых здесь зрелыми полипептидами ОВ). Указанные полипептиды имеют аминокислотные последовательности, приведенные на фиг. 1А-Е (SEQ ID NO:2), фиг. 3 (SEQ ID NO:4), фиг. 5 (SEQ ID NO:5) и фиг. 6 (SEQ ID NO:6). В особом варианте осуществления изобретения получают аминокислотные последовательности для ob-полипептидов человека и мыши. Оба полипептида обнаруживаются в форме, утратившей глутамин в положении 49, что может являться следствием аномального сплайсинга мРНК. Полипептиды ОВ различных видов животных могут обладать высокой степенью гомологии. Как показано на фиг. 4, полипептиды ОВ человека и мыши обладают более чем 80%-ной гомологией.

Молекулы нуклеиновых кислот, рекомбинантные ДНК-молекулы или клонированные гены могут иметь нуклеотидные последовательности или могут быть комплементарны ДНК-кодирующими последовательностям, приведенным на фиг. 1А-Е (SEQ ID NO:1) и фиг. 2А и В (SEQ ID NO:3). В частности, такие ДНК-молекулы могут быть молекулами кДНК или геномными ДНК, выделенными из хромосом. Нуклеиновые кислоты, полученные в соответствии с изобретением, могут также соответствовать 5'- и 3'-фланкирующим последовательностям ДНК и интронным ДНК-последовательностям. В связи с этим настоящее изобретение относится также к идентификации нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей последовательности на фиг. 1А-Е (SEQ ID NO:1) и фиг. 2А и В (SEQ ID NO:3), а также их варианты, полученные с учетом вырожденности генетического кода, аллельные варианты и подобные им родственные молекулы.

В соответствии с настоящим изобретением молекулы нуклеиновой кислоты могут быть ДНК и РНК, в том числе их синтетические варианты, имеющие фосфат или аналог фосфата, например, тиофосфатные связи. При этом указанные молекулы могут быть как одноцепочечные, так и двухцепочечные.

Изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, используемым в качестве молекулярных проб или праймеров для амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (PCR), т.е. к природным или синтетическим олигонуклеотидам, имеющим последовательность, соответствующую участку последовательностей, приведенных на фиг. 1А -Е (SEQ ID NO:1), фиг. 2А и В (SEQ ID NO:3) и фиг. 20А-С (SEQ ID NO:22), или 5'- и 3'-фланкирующим последовательностям кодирующих последовательностей или интронным последовательностям геномной ДНК. В частности, изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей по крайней мере около 10 нуклеотидов, при том что последовательность молекулы нуклеиновой кислоты соответствует нуклеотидной последовательности из того же количества нуклеотидов в нуклеотидных последовательностях, представленных на фиг. 1А-Е (SEQ ID NO:1), фиг. 2А и В (SEQ ID NO:3) и фиг. 20А-С (SEQ ID NO:22) или последовательности, комплементарной указанным. Более предпочтительно, последовательность молекулы нуклеиновой кислоты имеет по крайней мере 15 нуклеотидов. Наиболее предпочтительно, последовательность нуклеиновой кислоты имеет по крайней мере 20 нуклеотидов. В одном варианте осуществления изобретения, когда олигонуклеотид используется в качестве пробы, он содержит выявляемую метку, например радионуклидную (такую, как 32P) или ферментную.

Далее изобретение относится к клонирующему вектору, содержащему заявленные нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид ob, а также к вектору экспрессии, активному в клетках бактерий, насекомых или млекопитающих, содержащему заявленные нуклеиновые кислоты, а также к вектору экспрессии, активному в клетках бактерий, насекомых или млекопитающих, содержащему заявленные нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид ob, функционально связанные с последовательностью, контролирующей экспрессию. Соответственно изобретение относится к клетке-хозяину, например бактериальной, дрожжевой, клетке насекомых или млекопитающих, трансфицированной или трансформированной подходящим вектором экспрессии, а также к применению указанных выше конструктов для получения модуляторов согласно изобретению.

Изобретение также относится к антителам, которые связываются с полипептидом ob. Такие антитела могут быть получены к полипептиду полной длины или его антигенным фрагментам. В одном случае такие антитела ингибируют функциональную активность полипептида ob. В другом случае антитела могут использоваться для определения уровня циркулирующего полипептида ob в плазме крови или сыворотке. Кроме того, антитела, специфичные по отношению к какому-либо участку полипептида ОВ, в частности моноклональные антитела, могут использоваться в качестве «структурных» проб данного полипептида.

Все описанные выше соединения могут рассматриваться как модуляторы веса тела и содержания жира и, таким образом, могут использоваться различным образом, как указано выше. В частности, изобретение может найти диагностические и терапевтические применения, а также использоваться в сельском хозяйстве. В основе таких применений лежит использование описанных выше модуляторов, в том числе молекул нуклеиновых кислот и пептидов. Более того, модуляция веса тела подразумевает применение специфических терапевтических подходов таким образом, что ожирение или, наоборот, кахексия, отражающие нежелательные в организме нарушения, могут быть скорригированы применением одного или более модуляторов, полученных согласно настоящему изобретению.

Таким образом, изобретение относится к способу модулирования веса тела млекопитающих, включающему контролирование экспрессии белка, кодируемого нуклеиновой кислотой, имеющей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей последовательность, приведенную на фиг. 1А-Е (SEQ ID NO:1), фиг. 2А и В (SEQ ID NO:3), а также их аллельные варианты и варианты, полученные на основе вырожденности генетического кода. Такой контроль может оказаться эффективным путем введения заявленных нуклеотидов при генной терапии в жировые клетки больного или какого-либо хозяина для контроля или редукции ожирения. В противоположность этому, получение и применение антагонистов данных нуклеотидов, например антисмысловых молекул, может оказаться полезным для устранения нарушений, включающих избыточную потерю веса, например, нервозной анорексии, рака или СПИДа, в отношении которых проводится лечение. Указанные антагонисты могут быть введены сходным образом с нуклеотидами непосредственно в жировые клетки для достижения заданных изменений.

Соответственно белки, определенные с помощью фиг. 1А-Е, 3, 5 и 6 (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6), их консервативные варианты, активные фрагменты и родственные небольшие молекулы могут быть получены для непосредственного применения с терапевтическими целями для редукции или контроля избытка жира или веса тела. Антитела и другие антагонисты указанных белков, например, их фрагментов, могут быть получены и сходным образом применены для достижения обратного эффекта. В связи с этим изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим заявленный полипептид ОВ или, альтернативно, его антагонист в смеси с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем.

Кроме того, полученный согласно изобретению полипептид ОВ может быть использован для обеспечения косметических эффектов, например улучшения внешнего вида тела за счет редукции жировых отложений. Полипептид ОВ может использоваться независимо или в комплексе с другими косметическими методиками, например хирургическими, для достижения желаемых результатов.

Диагностические применения указанных нуклеотидов и соответствующих пептидов также подразумевают использование нуклеиновых кислот для идентификации возможных мутаций или аллельных вариантов указанных соединений с целью расширения набора активных нуклеотидных молекул, полезных в диагностике и терапии. В частности, гомозиготные и гетерозиготные мутации нуклеотидов могут быть идентифицированы в количественном отношении и более точно свидетельствовать о каком-либо нарушении, выявляя возможную степень риска индивидуумов, связанную с ожирением. Более точно, гетерозиготные мутации в настоящее время рассматриваются как ассоциированные со слабой или средней степенью ожирения, в то время как гомозиготные мутации ассоциированы с более выраженным и тяжелым ожирением. Соответствующее ДНК-тестирование может быть осуществлено при использовании вышеуказанных соединений в качестве маркеров уровня для получения точного долговременного прогноза определенных тенденций, так чтобы оказались возможным предсказать изменения в питании и других индивидуальных привычках индивидуума или характер непосредственного терапевтического вмешательства для устранения заданных нарушений.

Диагностическое применение настоящего изобретения включает способы определения присутствия и уровня заявленных модуляторов в клеточных образцах или биологических экстрактах (или образцах), полученных от соответствующих индивидуумов, так что может быть установлено содержание в таких тестируемых образцах нуклеиновых кислот (геномной ДНК или мРНК) и/или белка. Принимая во внимание, что увеличенная активность нуклеиновой кислоты и наличие соответствующего белка отражает способность организма ингибировать ожирение, врач, анализирующий полученные результаты такого рода исследований больного, страдающего ожирением, будет иметь возможность заключить, что причиной ожирения скорее является дисфункция, а не наличие или повышенная активность нуклеиновой кислоты, полученной согласно данному изобретению. В противоположность этому, пониженные уровни нуклеиновой кислоты и/или экспрессируемого белка позволяют предположить, что такие уровни могут быть повышены для лечения данного типа ожирения, и необходимо применить соответствующую терапевтическую систему.

Кроме того, нуклеотиды, представленные на Фиг.1А-Е и 2А и В, относятся к кДНК, которая, как вкратце указано выше, используется для определения соответствующей РНК. Сходным образом, рекомбинантные белки, соответствующие полипептидам на Фиг.1А-Е и 3, получают и надлежащим образом метят для использования, например, в радиоиммунологических анализах с целью определения содержания полипептида ОВ в плазме крови или же с целью определения содержания уровня ОВ-рецептора в тканях, скажем, в тканях гипоталамуса. Далее, изобретение относится не только к идентификации нуклеотидов и соответствующих белков, но и к выявлению рецепторов данных соединений. В данном контексте, полипептиды, представленные на Фиг.1А-Е, 3, 5 и/или 6, могут быть получены и использованы для скрининга соответствующей экспрессионной библиотеки для выделения активных рецепторов. Затем рецепторы могут быть клонированы и сами по себе или в комплексе с лигандом использованы для отбора небольших молекул, способных проявлять сходную активность по отношению к модуляторам.

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим некоторые из указанных модуляторов, предпочтительно полипептиды с последовательностями, представленными SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6, а также соответствующие антитела, небольшие молекулы агонистов и антагонистов или активные фрагменты, находящиеся в форме, пригодной для различных способов введения при необходимой терапии. Такие рецепторы могут включать фармацевтически приемлемые носители или другие адъюванты и быть использованы в эффективной дозе, которая определяется специалистом в каждом конкретном случае.

В соответствии с изложенным, наиболее важным объектом настоящего изобретения являются модуляторы веса тела, полученные в очищенной форме, которые обладают определенными характеристиками и свойствами, позволяющими контролировать и наменять степень ожирения и содержания жира у млекопитающих.

Другие объекты настоящего изобретения относятся к способам определения и выявления модуляторов контроля веса, как здесь указано, с целью эффективной диагностики и мониторинга патологических состояний, когда вариации в уровне таких модуляторов являются или могут быть прогнозом на будущее.

Объектом изобретения также являются способ и соответствующая аналитическая система для скрининга соединений, например лекарственных препаратов, реагентов и т.д., которые обладают потенциальной возможностью имитировать или ингибировать активность модуляторов, полученных согласно данному изобретению, у млекопитающих.

Еще одним объектом изобретения является способ воздействия на млекопитающих для контроля веса тела и содержания жира и/или способ лечения некоторых патофизиологических состояний, для которых аномальный вес тела (повышенный или пониженный) является характерным признаком.

Объектом изобретения также являются генетические конструкции для использования в генно-терапевтических методиках и/или фармацевтические композиции для соответствующих терапевтических методик, которые содержат или основаны на одном или более модуляторе, связывающем агенте или реагенте, способном контролировать образование модуляторов или же имитировать или противодействовать их активности.

Другие объекты и преимущества настоящего изобретения для специалиста в данной области исследований очевидным образом следуют из приведенного описания, которое подкрепляется ссылками на соответствующие фигуры.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1 (А-Е). Приведена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:1) и выведенная на ее основе аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2), соответствующая кДНК ОВ мыши. 39 оснований лидерной последовательности на 5'-концевом участке соединены с предсказанными 167 аминокислотами открытой рамки считывания и примерно 3,7 к-нетранслируемой последовательностью на 3'-концевом участке. (В предварительно поданной заявке серии №08/347563 от 30.11.94 и заявке серии №08/438, 431 от 10.05.95 дополнительные 58 оснований 5'-некодирующей последовательности были определены как артефакт клонирования. Данный артефакт не затрагивал кодирующий район, 39 оснований 5'-некодирующего участка, показанного здесь на фиг. 1, и 3'-некодирующий участка гена). Показано в целом около 2500 оснований 3'-нетранслируемой последовательности. Анализ предсказанной белковой последовательности при использовании компьютерной программы SigSeq выявляет присутствие сигнальной последовательности (подчеркнута). Микрогетерогеннось кДНК проявляется таким образом, что примерно 70% кДНК имеет глутаминовый кодон в положении 49 и 30% кДНК не имеет такого колона (см. фиг.5 и 6, ниже). Эта аминокислота подчеркнута, поскольку представляет собой аргининовый кодон, подвергшийся мутации у ob/ob мышей C57BL/GJ (1J мыши).

Фиг. 2. (А и В). Показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:3) кДНК ОВ человека. Нуклеотиды пронумерованы с 1 до 701 со стартовым участком в нуклеотидном положении 46 и терминаторным нуклеотидом в положении 550.

Фиг. 3. Показана полная предсказанная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:4) гена ОВ человека, соответствующая нуклеотидной последовательности Фиг.2А и В. Аминокислоты пронумерованы с 1 до 167. Сайт отщепления сигнальной последовательности расположен после аминокислоты 21 (Ala) так, что зрелый белок представлен аминокислотами 22 (Val)-167 (Cys).

Фиг. 4. Сравниваются предсказанные аминокислотные последовательности мыши (SEQ ID NO:2) и человека (SEQ ID NO:4). Предсказанная аминокислотная последовательность ОВ человека обладает высокой гомологией с мышиной. Консервативные участки обозначены пунктиром, а неконсервативные - звездочкой. Вариабельный глутаминовый кодон подчеркнут, это положение нонсенс-мутации в последовательности мышей линии C57BL/6J ob/ob (1J). На аминокислотном уровне отмечается 83%-ная идентичность, несмотря на то что только 8 замещений обнаружено между валином в положении кодона 22 («немедленное» положение downstream по отношению к сигнальной последовательности) и цистеином в положении 117.

Фиг. 5. Показана полноразмерная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:5), соответствующая гену ОВ мыши, показанному на Фиг.3, но утратившая глутамин в положении 49. Аминокислоты пронумерованы с 1 до 166. Сайт отщепления сигнальной последовательности расположен после аминокислоты 21 (Ala) (и, следовательно, до делетированного глутамина в положении 49) так, что зрелый белок представлен аминокислотами 22 (Val)-166 (Cys).

Фиг. 6. Показана полноразмерная предсказанная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:6), соответствующая гену ОВ человека, показанному на Фиг.4, но утратившая глутамин в положении 49. Аминокислоты пронумерованы с 1 до 166. Сайт отщепления сигнальной последовательности расположен после аминокислоты 21 (Ala) (и, следовательно, до делетированного глутамина в положении 49) так, что зрелый белок представлен аминокислотой 22 (Val)-166 (Cys).

Фиг. 7. (А). Физическая карта расположения ob в хромосоме мыши и YAC- и Р1-клонируюшие карты. «М» и «N» означают рестрикционные сайты для эндонуклеаз Mul I и Not I. Цифры соответствуют индивидуальным животным, рекомбинантным по области ob при подсчете 1606 мейозов. Met, Pax-4, D6R ck 39, D6R ck 13 и Сра обозначают положения области ob, которые связываются с ДНК-пробами. YACs изолировали с помощью D6R ck 13 и Рах-4 в качестве проб и концы восстанавливали при использовании PCR (vectorette PCR) и/или плазмиды «спасения» концов и в свою очередь использовали для выделения новых YACs. (В). Результирующий набор YAC. Одна из YACs, a именно Y902A0925, является химерной. Каждая из проб, которая использовалась для генотипирования рекомбинантных животных, заключена в скобки. (6) соответствует YAC 107; (5) соответствует М16(+) (или М16(р LUS)); (4) соответствует adu(+); (3) соответствует aad(p ICL); (2) соответствует 53(р ICL); и (1) соответствует 53(+). (С). P1-набор из бактериофаговых клонов Р1 изолировали с помощью селективных проб на основе концов YAC. Ген ob изолировали из Р1-клона с помощью дистальной концевой пробы YAC YB6S2F12 (концевая проба (4)) (альтернативно здесь обозначается как adu(+)).

Фиг. 8. Показана фотография, полученная при окрашивании бромистым этидием 192 независимых изолятов в эксперименте по «захвату» четвертого экзона, который был амплифицирован с помощью PCR и охарактеризован.

Фиг. 9. Показана фотография, полученная при окрашивании бромистым этидием PCR-амплифицированных клонов, предположительно несущих ob. Каждый из 7 клонов, в которых не обнаруживалось артефакта, повторно амплифицировали с помощью PCR и подвергали электрофорезу в геле 1%-ной агарозы в ТВЕ и окрашивали бромистым этидием. Маркеры размера (не обозначенная номером самая левая линия) является коммерчески доступными («шаг» составляет 1 kb). Линия 1-клон 1D12, содержащий «последовательность HIV». Линия 2-клон 1F1, клон за пределами ob-участка. Линия 3-клон 1Н3. Линия 4-клон 2В2, который идентичен 1F1. Линия 5-клон 2G7, который содержит ob экзон. Линия 6-клон 2G11, который идентичен 1F1. Линия 7-клон 2Н1, который не содержит вставки.

Фиг. 10. Показана последовательность клона 2G7 (SEQ ID NO:7), которая содержит экзон, кодирующий участок гена OB. Последовательности праймеров, которые использовались для амплификации данного экзона, на фигуре обведены в рамки (SEQ ID NO:8 и 9).

Фиг. 11. (А). Обратно-транскрипционный PCR-анализ мРНК различных тканей той же самой мыши с праймерами 2G7 и актиновыми праймерами. PT-PCR-реакции проводили при использовании 100 нг тотальной РНК, которую транскрибировали для образования первой цепи кДНК с помощью праймера oligo dT. PCR-амплификацию проводили в течение 35 циклов. В каждом цикле осуществляли денатурацию при 94°С в течение 1 сек; гибридизацию при 55°С в течение 1 сек; удлинение цепи при 72°С в течение 2 сек и самоудлинение при 72°С в течение 1 сек. RT-PCR-продукты разгоняли в 2%-ном геле низкоплавкой агарозы в буфере 1xTBE. (В). Нозерн-блот мРНК из различных органов мыши, полученный с помощью пробы 2G7, меченной в PCR. Десять мкг обшей РНК из каждой ткани подвергали электрофорезу в агарозном геле с формальдегидом. Пробу гибридизовали при 65°С в системе Rapid Hybe (Amersham). Авторалиографические сигналы явно выявлялись через 1 час экспонирования; показаны результаты эксперимента через 24 ч после экспонирования.

Фиг. 12. (А). Приведены результаты окрашивания бромистым этидием РНК из жировых клеток (белая жировая ткань) каждой из указанных линий мышей, подвергнутой RT-PCR-реакции. Общую РНК (100 нг) для каждого образца подвергали обратной транскрипции с помощью олиго dT и обратной транскриптазы и полученные одноцепочечные кДНК амплифицировали в PCR с праймерами 2G7 (нижние полосы) или актиновыми праймерами (верхние полосы). Как 2G7, так и активные праймеры включали в одну и ту же реакцию PCR. Продукты разгоняли в 1%-ном геле агарозы в ТВЕ. (В). Нозерн-анализ, соответствующий (А). Десять мкг РНК жировых клеток (белая жировая ткань) каждой линии животных обрабатывали меченной в PCR пробой 2G7, как на Фиг.11 В (см. выше). Обнаруживали явное примерно 20-кратное увеличение уровня 2G7 мРНК во фракции РНК из белой жировой ткани мышей C57BL/6J ob/ob (линия 1J) по сравнению с изученными животными. В RT-PCR и Нозерн-экспериментах не выявлялось сигнала в 2G7 РНК из клеток мышей SM/CKc-+Dacob21/ob21 (2J) даже после 2-недельной экспозиции. Показаны результаты 24-часовой экспозиции. Тот же самый фильтр гибридизовали с актиновой пробой (нижний участок панели).

Фиг. 13. Нозерн-анализ дополнительных 2J животных и контрольных животных, который свидетельствует об отсутствии ob мРНК у 2J-животных. Нозерн-анализ показан на Фиг.11 и 12. В этом случае контрольная РНК представляет собой ар 2, специфический транскрипт жировых клеток. Не обнаруживалось существенных различий в плотности ар 2-полос.

Фиг. 14. Сравниваются ДНК-последовательность C57BL/6J (норма) и C57BL/6J ob/ob (1J) мышей в области точечной мутации, приводящей к встраиванию стоп-кодона незрелой последовательности (нонсенс-мутация) в кДНК мутантной линии. Ob/ob мыши имеют СТ-мутацию, которая «заменяет» аргининовый остаток в положении 105. Показана данная замена, как следует из результатов автоматического секвенирования ДНК. RT-PCR осуществляют при использовании РНК жировых клеток обеих линий мышей (+/-+ и ob/ob) с помощью праймеров 5' и 3'-нетранслируемых участков. Продукты PCR-реакции очищали гель-электрофорезом и непосредственным образом секвенировали вручную и с помощью автоматического секвенсера Applied Biosystems, Inc. 373A при использовании праймеров, соответствующих обеим цепям кодирующей последовательности.

Фиг. 15. (А). Саузерн-блот геномной ДНК каждой указанной линии мышей. Примерно 5 мкг ДНК (геномной ДНК печени, почек или селезенки) расщепляли указанными ферментами рестрикции. Затем ДНК подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле в ТВЕ и обрабатывали меченной в PCR пробой 2G7. Рестрикционное расщепление Bgl II связано с увеличением размера примерно до 9 kb (наибольший размер) Bgl II-фрагмента ДНК SM/Ckc-+Dacob21/ob21 (2J). RFLPs не выявляются ни с какими рестрикционным ферментом. Предварительное рестрикционное картирование геномной ДНК показывает, что полиморфный Bgl II-сайт расположен в положении upstream (примерно 7 kb) по отношению к транскрипционному начальному сайту. Ни один из других исследованных ферментов не «выходил за рамки» стартового сайта мРНК. (В). Сегрегация Bgl II полиморфизма в линии SM/Ckc-+Dacob21/ob21. Шесть мышей с ожирением и пять не страдающих ожирением, потомков одной и той же генерации коизогенных животных SM/Ckc-+Dacob21/ob21 (2J), генотипировали путем подсчета Bgl II полиморфизма, как показано на Фиг.(А). Все животные с фенотипическим ожирением были гомозиготными по булыпей аллели полиморфного Bgl П-фрагмента. ДНК в контрольной «линии» получали из неродственной мыши SM/Ckc-+Dac+/+, отдельно полученной из колонии SM/Ckc-+Dacob21/ob21.

Фиг. 16. Саузерн-блот расщепленной EcoRl геномной ДНК перечисленных линий животных при использовании кДНК OB в качестве пробы (т.е. zoo-блот). Гибридизационные сигналы выявлялись в каждом образце, полученном от позвоночного, даже после гибридизации в умеренно сильных условиях. ДНК кошки в данном эксперименте была слабо деградированной. Рестрикцированную ДНК разгоняли в геле 1%-ной агарозы в ТВЕ и переносили на мембрану для взаимодействия с пробами. Фильтр гибридизуют при 65°С и дважды отмывают 2xSSC/0.2% SDS при 65°С в течение двадцати минут и экспонируют 3 дня с пленкой (Kodak/Rochester, N. Y.) X-ОМАТ.

Фиг. 17. Показан участок клонирующего вектора экспрессии рЕТ-15b (Novagen) (SEQ ID NO:11 и 12).

Фиг. 18. Показаны результаты исследования элюата с Ni- колонки (His-связываюшая смола) для рекомбинантного зрелого ob мыши, слитого с His-меткой (А) и зрелого OB человека, слитого с His-меткой (В). Бактерии трансформировали векторами рЕТМ9 и рЕТН14 соответственно. При индукции 1 мМ IPTG в оптимальных условиях трансформированные бактерии способны продуцировать 100-300 мкг/мл слитого белка OB, в первую очередь в тельцах включения. Тельца включения солюбилизировали 6М гуанидин-HCl или мочевиной, и белок слияния (содержащийся в супернатанте) наслаивали на His-связываюшую смолу Ni-колонки в 10 мл 1х связывающего буфера с мочевиной. Колонку элюировали ступенчато 5-мл аликвотами 20 mM, 60 mM и 300 mM имидазола и окончательно очищающим буфером. Затем аликвоты анализировали на присутствие полипептида слияния OB в 15%-ном акриламидном геле. Каждая линия содержит эквивалент 100 мкл бактериального экстракта.

Фиг. 19. (A). In vitro трансляция РНК OB. кДНК OB человека субклонировали в векторе pGEM. Плазмиду линеаризовали и синтезировали (+) цепь РНК с помощью Sр6-полимеразы. Синтезированную in vitro РНК транслировали в присутствии или в отсутствие микросомальных мембран поджелудочной железы собаки. После in vitro трансляции обнаруживали примерно 18 кДа-первичный трансляционный продукт. Добавление микросомальных мембран в реакционную смесь приводило к появлению второго продукта трансляции примерно на 2 кДа меньше, чем первый продукт трансляции. Размер трансляционного продукта РНК интерлейкина 1 а, утратившей кодирующую область сигнальной последовательности, не изменялся при добавлении микросомальных мембран. Эти данные свидетельствуют о наличии функциональной сигнальной последовательности. (В). In vitro трансляция в присутствии и в отсутствие протеиназы К. Обработка протеиназой приводит к полному протеолизу 18-кДа первого продукта трансляции, в то время как на 16-кДа процессированную форму протеиназа не действует. Пермеабилизация микросом 0.1%-ным ТРИТОНОМ-Х100 придает данной форме чувствительность к протеиназе. Приведенные результаты свидетельствуют о том, что продукт транслировался в просвете микросомы.

Фиг. 20. (А-Е). Последовательность гена OB человека (SEQ ID NO:22 и 24). (F). Схематическое строение гена OB мыши. (G). Схематическое строение гена ОВ человека. На Фиг.(F) и (G) подчеркнуты стартовые и стоп-кодоны. Нет свидетельства в пользу гомологии первого интрона гена мыши и первого интрона гена человека, однако это не исключается.

Фиг. 21. Схематическое изображение одной из методик клонирования для достижения рекомбинантной экспрессии ОВ в дрожжах Pichia. (А). Экспрессионный вектор ОВ с сигнальной последовательностью а-спаривающего фактора. (В). Схематическое изображение структуры рекомбинантного белка слияния, включающего аминокисллотную последовательность SEQ ID NO:26 с показанными Xho I-сайтом и предполагаемыми сайтами расщепления КЕХ-2 и STE-13 и N-концевыми добавочными аминокислотами, расположенными после КЕХ-2 (SEQ ID NO: 27). (С). Альтернативная стратегия для получения зрелого ОВ включает получение конструкта с аминокислотной последовательностью, соответствующей сайту расщепления Xho I и сайту расщепления КЕХ-2, в положении немедленного upstream по сравнению с последовательностью зрелого полипептида (SEQ ID NO:28).

Фиг. 22. Альтернативная экспрессионная стратегия при использовании Pichia. (А). Вектор экспрессии слитого ОВ с His-меткой, заимствованный из экспрессионной системы рЕТ, под контролем сигнальной последовательности а-спаривания фактора (SEQ ID NO:33). (В). Схематическое изображение структуры рекомбинантного белка слияния ОВ, содержащего His-метку, который включает сигнальную последовательность последовательности а-спариваюшего фактора, предполагаемые сайты расщепления КЕХ-2 и STE-13, His-метку и сайт расщепления тромбином, который приводит к получению ОВ с тремя дополнительными N-концевыми аминокислотными остатками.

Фиг. 23. (А). Анализ с помощью PAGE экспрессии ОВ мыши (в микрогетерогенной форме, т.е. содержащего и несодержащего Gln 49) в трансформированных клетках дрожжей Pichia. Ожидаемая полоса размером около 16 кДа визуализируется в культуральной жидкости трансформированных дрожжевых клеток (вторая и третья линии), но не в культуральной жидкости нетрансформированных дрожжевых клеток (первая линия). (В). PAGE-анализ частично очищенного (на карбоксильной целлюлозе) полипептида ОВ (слабая ионообменная колонка). На фракциях 3 и 4, полученных с колонки, хорошо видна полоса размером около 16 кДа. Фракции элюируют 250мМ NaCl. Линия 1-нанесенный образец; линия 2-прохождсние потока; линии 3-5-фракции, элюированные 250 мМ NaCl.

Фиг. 24. Показана циркуляция белка ОВ в плазме крови мыши. (А). Иммунопреципитаты из крови мыши 0.5 мл плазмы крови мыши предварительно осветляли на неконъюгированной сефарозе и инкубировали в течение ночи с иммуноочищенными анти-ОВ антителами, конъюгирванными с гранулами сефарозы 4В. Иммунопреципитат разделяли в 15%-ном SDS-PAGE-геле, переносили и подвергали Вестерн-блоттингу с анти-ОВ антителами. Белок мигрировал в области мол. массы около 16 кДа, так же, как и зрелый белок ob мыши, экспрессированный в дрожжевых клетках. Белок отсутствовал в плазме крови мышей C57BL/6J ob/ob и обнаруживался в десятикратном количестве в плазме крови мышей C57BLB/Ks db/db по сравнению с животными дикого типа. Предполагается, что db мыши отличаются сверхпродукцией белка OB, обладая вторичной устойчивостью к его эффектам. (В). Увеличенные уровни OB у ожиревших крыс. Крысы ожирели вследствие рецессивной мутации в хромосоме 5. Генетические данные позволяют предположить наличие дефекта в том же самом гене, который мутировал у db мышей. Плазму крови ожиревших крыс и не страдающих ожирением одного помета иммунопреципитировали и исследовали в Вестерн-блоттинге. У мутантных животных выявляли двадцатикратное увеличение циркулирующего уровня полипептида OB. (С). Количество OB белка в плазме крови мыши. Увеличенное количество рекомбинантного мышиного белка добавляли к 100 1 плазмы мышей ob и иммунопреципитировали. Интенсивность сигнала на Вестерн-блотах сравнивали с таковой в 100 1 плазмы мышей дикого типа. Линейное увеличение интенсивности сигнала наблюдалось с увеличением количества рекомбинантного белка, показывая, что иммунопреиипитация осуществлялась в условиях избытка антител. Сходные сигналы наблюдались в образце плазмы от животных дикого типа и в образце с 2 нг рекомбинантного белка, выявляя циркулирующий уровень в плазме крови мыши в размере около 20 нг/мл. (D). ОВ белок в экстрактах жировой ткани. Цитоплазматические экстракты жировой ткани мышей получали от животных db и дикого типа. Вестерн-блоты показывают увеличенные уровни белка 16 кДа в экстрактах, полученных от мышей db.

Фиг. 25. Показаны вариации уровней циркулирующего белка ОВ в плазме крови человека. (А). Вестерн-блоты плазмы крови человека. Образцы плазмы получали от шести добровольцев, не страдающих ожирением. Иммунопреципитация и Вестерн-блоттинг выявляли наличие иммунореактивного белка 16 кДа, идентичного по размеру рекомбинантному белку человека в 146 аминокислот, который экспрессируется в клетках дрожжей. В каждом из шести образцов выявляются различные уровни белка. (В). ELISA (иммуноанализ со связанным ферментом) ob человека. Панели для микротитрования покрывали иммуноочищенными антителами к ОВ человека. Известные количества рекомбинантного белка добавляли к панелям и выявляли с помощью иммуноочищенных биотинилированных антител к ob. Для получения стандартной кривой откладывали поглощение при 414 нм против известных концентраций OB. Полученная стандартная кривая показывает, что метод способен выявить 1 нг/мл или более белка OB человека. (С). Количество OB белка в плазме крови человека. ELISA осуществляли при использовании 100 1 плазмы крови от шести добровольцев, не страдающих ожирением, и стандартов, применяемых при исследовании панели В. Уровни OB белка варьировали от 2 нг/мл в НР1 до 15 нг/мл в НР6. Указанные данные коррелируют с результатами Вестерн-блоттинга панели А.

Фиг. 26. Показано образование внутримолекулярных и межмолекулярных дисульфидных связей в белке ОВ. (А). Вестерн-блоттинг в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Вестерн-блоттинг плазмы крови человека и мыши повторно осуществляли с добавлением и без добавления восстанавливающих агентов к образцу буфера. Когда b-меркаптоэтанол исключали из образца буфера, иммунопреципитаты из плазмы крови db мигрировали в области явно выраженной мол. массы 16 кДа и 32 кДа. Добавление b-меркаптоэтанола к буферу приводило к исчезновению подвижности в области 32 кДа (см. Фиг.24). Указанный результат воспроизводился, когда белок мыши экспрессировался в клетках дрожжей Pichia pastoris. В этом случае белок мыши мигрировал в положении димера. В восстанавливаюших условиях очищенный рекомбинантный белок мыши мигрировал в области явной мол. массы 16 кДа, свидетельствуя о том, что молекулярная форма 32 кДа образуется в результате формирования одной или двух межмолекулярных дисульфидных связей. Белок человека, экспрессируемый in vivo и в клетках дрожжей Pichia pastoris, мигрирует в области мол. массы 16 кДа как в восстанавливающих, так и в невосстанавливаюших условиях (результаты не показаны). (В). Белок человека, экспрессированный в дрожжах, содержит межмолекулярную дисульфидную связь. Секретируемые белки, в целом, принимают необходимую конформацию, когда экспрессируются в системе дрожжевых клеток Pichia pastoris. Зрелый белок человека размером в 146 аминокисолот экспрессируют в клетках Pichia pastoris и очищают из культуральной среды двухстадийным методом, включающим IMAC и гель-фильтрацию. Очищенный рекомбинантный белок подвергают масс-спектрометрии до и после расщепления бромцианом. Бромциан расщепляет белок по карбоксильному концевому участку остатка метионина. Молекулярная масса рекомбинантного «дрожжевого» белка составляет 16.024±3 Да (вычисленная мол. масса составляет 16.024 Да). Бромциан действует на три метиониновых остатка в белковой последовательности в положениях 75, 89 и 157. Полученные фрагменты с измеренной массой 8435.6 Да соответствуют аминокислотам 90-157 и 158-167, соединенным дисульфидной связью между cys-117 и cys-167 (вычисленная мол. масса составляет 8434.5 Да). N. D. означает «не определялось».

Фиг. 27. Показано получение биологически активного рекомбинантного белка. Нуклеотидную последовательность, соответствующую 145-аминокислотной последовательности зрелого белка ОВ мыши, клонировали в векторе экспрессии рЕТ 15Ь. рЕТ вектор содержит вставку из полигистидиновой последовательности (His-метка) в положении «upstream» по отношению к клонированной последовательности, позволяющую осуществлять эффективную очистку с помощью Аффинной Хроматографии с Иммобилизованным Металлом (IMAC). Рекомбинантный бактериальный белок первоначально выделяли из нерастворимой мембранной фракции после лизиса бактерий. Мембранную фракцию солюбилизировали с помощью гуанидинхлорида и наслаивали на IMAC-колонку. Белок элюировали ступенчато увеличивающимися концентрациями имидазола (как показано на Фигуре). Восстанавливали структуру элюированного белка и обрабатывали тромбином для удаления His-tag, как описано ниже. Конечный выход растворимого белка составлял 45 нг/мл бактериальной культуры.

Фиг. 28. Показано биологическое действие белка ОВ. Временной курс потребления пищи (панели А-С) и параметры веса тела (панели D-F). Группы из десяти животных получали ежедневные перитонеальные инъекции белка ОВ в дозе 5 мг/кг/день (закрашенные квадраты), ежедневные инъекции PBS (закрашенные кружки) или не получали инъекций (закрашенные треугольники). «Обработанные» группы включали мышей C57Bl/6J ob/ob (панели А и D), мышей db/db C57Bl/Ks (панели В и Е) и мышей CBA/J+/+ (панели С и F). Потребление пищи регистрировали ежедневно, а вес тела определяли с интервалом в 3-4 дня. (Шкала веса тела мышей дикого типа в граммах отличается от таковой мышей ob и db). Потребление пищи мышами ob, получавшими белок, уменьшалось после первой инъекции и стабилизировалось после четвертого дня на уровне около 40%, как видно на схеме, соответствующей данной группе (получавшей инъекции) (р<0.001). Вес тела этих животных уменьшался в среднем на 13 г/день и стабилизировался после трех недель до уровня, соответствующего примерно 60% от первоначального (р<0.0001). Не проявлялось действие белка у db мышей. Небольшой, но важный эффект на вес тела наблюдался у мышей CBA/J в двух более ранних временных точках (р<0.02). Стандартная ошибка каждого измерения показана стрелкой и статистическая значимость результатов приведена в Таблице 1.

Фиг. 29. Приведены результаты эксперимента «парного кормления» мышей. (А). Группе из четырех мышей C57Bl/6J ob/ob скармливали количество пищи, эквивалентное тому, которое потребляла группа мышей ob, получающих рекомбинантный белок. Потерю веса животных обеих групп определяли после пяти, восьми и двенадцати дней. Ограниченные в пище мыши меньше теряли (пунктирные стрелки) в весе, чем мыши ob, получавшие белок (сплошная стрелка) (р<0.02). Полученные результаты свидетельствуют о том, что снижающее вес действие белка ОВ зависит как от потребляемого количества пищи, так и от расхода энергии. (В). Фотография «обработанной» ob мыши. Показаны две C57Bl/6J ob/ob мыши. Левая мышь получала PBS и весит 65г, т.е. имеет первоначальный вес. Правая мышь получала ежедневные инъекции рекомбинантного белка OB. Начальный вес этого животного также составлял 65г, а после трехнедельного введения белка уменьшился до 38г. (С). Печень «обработанных» и «необработанных» ob мышей (C57Bl/6J ob/ob мышей). Печень животного, получавшего PBS, имеет явный вид печени животного, страдающего ожирением, и весит 5.04г. Печень мыши, получавшей рекомбинантный белок ob, имеет «нормальный» вид и весит 2.23г.

Фиг. 30. Показана гибридизация in situ жировой ткани мышей ob. Смысловую и антисмысловую РНК ob метили in vitro с помощью Sp6- и Т7-полимеразы и дигоксигенина. Меченную РНК гибридизовали с заключенными в парафин срезами жировой ткани из жировых комков придатка яичка восьминедельных мышей C57Bl/Ks (дикий тип) и C57BL/Ks db/db мышей (мыши db). На фигуре жировые капли видны как неокрашенные вакуоли внутри клеток. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка по периферии клеток и неотличима от клеточной мембраны. Гибридизацию со всеми адипоцитами в поле зрения выявляли в срезах ткани от животных дикого типа только с помощью антисмысловой пробы, и существенно увеличенные уровни можно видеть на тканевых срезах db/db животных.

Фиг. 31. Показано, что РНК ОВ экспрессируется в адипоцитах in vivo и in vitro.Общую фракцию РНК (10 мкг) из нескольких различных источников подвергают электрофорезу и блоттингу и гибридизуют с пробой ob. В первую очередь, различия в плавучести клеток после обработки коллагеназой используют для очистки адипоцитов. Ob РНК обнаруживается только во фракции адипоцитов. Линия S обозначает стромоваскулярную фракцию, линия А - фракцию адипоцитов. Более того, OB РНК не экспрессируется в недифференцированных преадипоцитах 3Т3-442 (линия U). Дифференцированные адипоциты той же самой клеточной линии экспрессируют явным образом выявляемые уровни мРНК OB (линия D).

Фиг. 32. Показано, что РНК OB экспрессируются во всех депо жировой ткани, которые тестировались на экспрессию РНК ob. В паховых жировых клетках РНК экспрессируется на несколько более низком уровне, несмотря на то что обнаруживается вариабельность в уровне сигналов в различных экспериментах (Фигура 31А). Линии (1) (2) (3) (4) обозначают соответственно жировые комки придатков яичка и паховой области, а также абдоминальный и параметриальный жировые комки. В бурой жировой ткани также экспрессируется низкий уровень OB РНК (Фигура 31В). Уровень экспрессии OB в коричневой жировой ткани не изменяется при содержании жировых в течение недели при 4°С, в то время как экспрессия специфической для бурой жировой ткани UCP РНК (известно, что ее экспрессия индуцируется холодом) увеличивается в пять раз.

Фиг. 33. Показана экспрессия OB РНК у db/db и «обработанных» золотой тиоглюкозой мышей. Общую фракцию РНК из параметриалъных жировых комков «обработанных» золотой тиоглюкозой (GTG) и db/db мышей подвергали электрофорезу и Нозерн-блоттингу. Известно, что введение GTG в однократной дозе вызывает ожирение путем специфических гипоталамических повреждений. (А). Самкам мышей СВА одномесячного возраста вводили GTG (0.2 мг/кг) с результирующим увеличением до более 20 г у «обработанных» животных в сравнении с контролем (<5 г). (В). Гибридизация OB пробы-РНК db/db и GTG-обработанных мышей выявляет двадцатикратное увеличение содержание ob РНК по отношению к контрольной РНК (актин или GAPDH).

Фиг. 34. Результаты Нозерн-блоттинга РНК человека. Нозерн-блоты, содержащие 10 мг общей РНК из жировой ткани человека (FAT, панель А) и 2 мг полиА+РНК из других тканей человека (панель В) гибридизовали с пробами на основе ob человека или -актина человека, как показано. При использовании обшей РНК жировой ткани интенсивной сигнал выявлялся в области, соответствующей примерно 4.5 kb. Гибридизация полиА+РНК дает выявляемые сигналы в ткани сердца (НЕ) и плаценты (PL), в то время как ОВ РНК не обнаруживается в мозге (BR), легких (LU), печени (LI), скелетных мышах (SK), почке (KI) и поджелудочной железе (РА). В каждом случае указано время авторадиографической экспозиции. Неизвестно происхождение низкомолекулярных цепей во фракции плацентарной РНК (альтернативный сплайсинг, деградация РНК и т.д.).

Фиг. 35. Показан набор (контиг) YAC, содержащий ген ОВ человека и 8 микросателлитных маркеров. Показана основанная на YAC содержащая STS карта участка хромосомы 7, включающей ген OB человека, как предсказано с помощью SEGMAP/Version 3.29 (Green et al., PCR Methods Applic., 1: 77-90 (1991)). В верхней части показаны 19 уникально расположенных STSs (см. Табл. 3). Восемь микросателлит-специфических STSs отмечены звездочками (см. Табл. 4). Также показаны STSs, соответствующие генам Pax 4 и OB, так же, как и предсказанные положения центромеры (CEN) и 7q-теломеры (TEL) по отношению к контигу. Каждый из 43 клонов YAC отмечен горизонтальной стрелкой, их обозначения приведены слева, а установленный размер YAC (в kb, определенный с помощью пульс-электрофореза в геле) заключен в скобки. Наличие STS в YAC отмечено сплошным кружком в соответствующем положении. Когда STS соответствует концевой вставке YAC, нужный кружок заключают в квадрат; и квадрат, и кружок располагают сверху (около обозначения STS) и в концевой области YAC, из которой получен данный STS. Для 5 YACs в нижней части схемы (ниже горизонтальной пунктирной линии) не выявляется наличие предполагаемых на основании установленного порядка STS одного или более STSs (как показано тестированием индивидуальных YACs с помощью соответствующего STS-специфического PCR-анализа, осуществляемого по крайней мере дважды). Указанные YACs отмечены незакрашенными кружками в соответствующих положениях. Большинство YACs выделили из гибридной клеточной библиотеки человек/хомяк (Green et al., Genomics, 25: 170-183 (1995)); приведены оригинальные обозначения данных YACs. Остальные YACs изолировали из общей геномной библиотеки человека, их первоначальное положение в библиотеке приведено в Табл. 3. Прямоугольниками обведены обозначения трех YACs (yWSS691, yWSS999, yWSS2935), которые с помощью FISH-анализа картированы на 7q31.3. Контиг представлен в «невычисленной» форме, когда размеры YAC не использовались для оценки перекрывания клонов или пространственного расположения STS, и все STSs поэтому показаны расположенными на одинаковом расстоянии друг от друга. В «вычисленной» форме, когда размеры YACs использовались для оценки относительного расстояния, разделяющего каждую пару соседних STSs, так же, как и для степени перекрывания клонов, общий контиг YACs, по видимому, составляет около 2 Mb.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к открытию белка, названного полипептидом ob или лептином, нуклеиновых кислот, кодирующих белок, в том числе их вариантов, основанных на вырожденности генетического кода, например, включающих оптимальные кодоны для экспрессии полипептида в заданной системе, причем данный полипептид обладает способностью участвовать в контролировании веса тела млекопитающих. Нуклеиновые кислоты имеют последовательности, соответствующие полипептиду ОВ человека и мыши, который играет основную роль в регуляции веса тела и ожирения. Приведенные здесь сведения показывают, что полипептидный продукт заявленной нуклеиновой кислоты секретируется экспрессирующими его клетками, и полипептид функционирует как гормон. Дополнительные экспериментальные данные свидетельствуют, что полипептид OB чрезвычайно эффективен в лечении ожирения у мышей, имеющих мутацию в гене ob. Кроме того, высокие разовые или средние постоянные дозы полипептида ОВ уменьшают вес нормальных (дикий тип) мышей.

Более того, приведенные здесь Примеры показывают, что полипептид ОВ, называемый также лептином, циркулирует в крови мышей, крыс и человека. Лептин не обнаруживается в плазме крови мышей ob/ob и выявляется более чем в десятикратной концентрации в плазме крови мышей db/db и более чем в двадцатикратной концентрации у крыс fa/fa. Ежедневные инъекции рекомбинантного лептина существенным образом снижают вес тела мышей ob/ob, значительно влияют на вес тела мышей дикого типа и не оказывают воздействия на мышей db/db.

Полипептид ОВ какого-либо вида животного активен в отношении других видов. В частности, полипептид ОВ активен в организме мышей.

В первую очередь, изобретение направлено на идентификацию соединений, которые функционируют как модуляторы веса тела млекопитающих. В частности, изобретение относится к выделению, очистке и секвенированию некоторых нуклеиновых кислот, соответствующих гену ОВ человека и мыши или его кодирующей области, так же, как и к полипептидам, которые кодируются данными нуклеиновыми кислотами. Таким образом, изобретение включает обнаружение нуклеиновых кислот, имеющих нуклеотидные последовательности, представленные на Фиг.1А-Е (SEQ ID NO: 1) и Фиг.2А-В (SEQ ID NO:3), а также их вариантов, полученных на основе вырожденности генетического кода, аллелей и фрагментов, обладающих способностью модулировать вес тела и ожирение. Соответствие нуклеиновых кислот гену ОВ указывает на их существенный вклад в развитие состояний, например, ожирения, так же, как и других дисфункций и нарушений, для которых отклонения в весе тела имеют определенное значение. Изобретение также относится к белку, экспрессированному с помощью данных нуклеиновых кислот, и в частности к белкам, приведенным на Фиг.1А-Е (SEQ ID NO:2), Фиг.3 (SEQ ID NO:4), Фиг.5 (SEQ ID NO:5) и Фиг.6 (SEQ ID NO:6), так же, как к их консервативным вариантам, активным фрагментам и родственным небольшим молекулам.

Как отмечалось ранее, модулирующие вес тела пептиды или связывающие их партнеры или другие лиганды или агенты, проявляющие антагонистические свойства, имитирующие активность указанных модуляторов или контролирующие их образование, могут быть включены в фармакологические композиции, содержащие подходящий носитель, в эффективном количестве для введения различным образом больному, имеющему отклонения от нормального веса тела или страдающему ожирением как таковым или же вследствие других нарушений, например СПИДа и рака, с целью лечения. Могут быть использованы различные методики введения, например оральная, назальная или другие формы введения через слизистые оболочки, парентеральная (подкожная, внутривенная и интраперитонеальная), применение катетеров и др. Средние дозы вводимых факторов и их субъединиц могут варьировать и, в частности, основываться на рекомендациях и предписаниях квалифицированных врачей и ветеринаров.

В соответствии с указанным могут быть получены системы анализа для скрининга потенциальных лекарственных препаратов, эффективных для имитирования или противодействия активности модуляторов веса. Модулятор веса может быть введен в тест-систему, а тестируемый препарат может быть введен в культуральную среду, и культуральная среда затем исследуется на какие-либо изменения в активности клеток, обусловленные как добавлением собственно лекарственного препарата, так и количественных доз известного модулятора веса.

Как отмечалось ранее, молекулярное клонирование гена ОВ привело к идентификации определенного класса соединений, которые функционируют на молекулярном уровне, модулируя вес тела млекопитающих. Обнаружение модуляторов, согласно данному изобретению, имеет важное значение для диагностики и лечения заболевании, связанных с нарушениями в питании, например ожирения, потери веса, ассоциированной с раком, и лечения заболеваний, ассоциированных с ожирением, скажем, болезней сердца, гипертензии и диабета типа II. Кроме того, могут иметь место потенциальные сельскохозяйственные применения генного продукта в тех случаях, когда следует модулировать вес тела домашних животных. И наконец, поскольку один или более модуляторов, заявленных согласно настоящему изобретению, являются секретируемыми молекулами, они могут быть использованы в биологических целях для выделения соответствующего рецептора на основе методики экспрессионного клонирования. Обсуждение, касающееся гена ОВ, подтверждает возможность использования целого класса модуляторов, составляющих часть настоящего изобретения, и допускает существование различных интерпретаций в объеме изобретения.

Как отмечалось выше, функциональная активность полипептида ОВ может быть оценена с помощью получения экспериментальной модели трансгенных животных. Ген ob используется в исследованиях по комплементации на трансгенных мышах. Трансгенные векторы, в том числе вирусные векторы или космидные клоны (или фаговые клоны), соответствующие локусу «гена-кандидата» дикого типа, могут быть сконструированы при использовании ob гена. Космиды могут быть введены в трансгенных мышей с помощью известных методик (Jaenisch, Science, 240:1468-1474 (1988)). Конструкты также вводят в оплодотворенные яйцеклетки, полученные при скрещивании между собой животных F1, полученных от скрещивания мышей C57BL/6J ob/ob и DBA. Данные скрещивания требуют использования трансплантатов яичников животных C57BL/6J ob/ob для получения поколения F1. Мыши DBA/2J используются в качестве «партнера», поскольку имеют окраску «не агути», что важно при применении трансплантатов яичников. Генотипирование локуса ob в космидных трансгенных животных может быть проведено путем типирования животных с жесткосвязанными RFLPs или микросателлитами, которые полиморфны у исходных линий мышей. Комплементация будет проявляться, когда определенный конструкт сообщает генетически ожиревшим животным F2 (как выявляется RFLP-анализом) «неожирение» и «недиабетичность». В этих условиях окончательное доказательство комплементации будет требовать, чтобы животные фенотипа ob/ob или db/db, несущие трансген, скрещивались с животными ob/ob или db/db, несущими трансплантаты яичников. В этом скрещивании все N2-животные, которые не имеют трансгена, будут страдать ожирением и инсулин-независимым диабетом, в то время как животные, несущие трансген, будут нормальной массы с обычной концентрацией глюкозы и инсулина в плазме крови. С генетической точки зрения трансген функционирует в качестве супрессора мутации. Альтернативно, гены OB могут быть тестированы путем изучения соответствующих фенотипических эффектов, когда данные гены экспрессируются в антисмысловой ориентации у животных дикого типа. В этом случае экспрессия аллеля дикого типа супрессируется, что приводит к мутантному фенотипу. Образование дуплекса РНК·РНК (антисмысловая/смысловая) предотвращает нормальное функционирование мРНК, приводя к частичной или полной элиминации эффекта гена дикого типа. Данная технология использовалась для ингибирования синтеза ТК в тканевой культуре и получение фенотипа Kruppel мутации у Drosophila и Shivever мутации у мышей (Izant et al., Cell, 36: 1007-1015 (1984); Green et al., Annu. Rev. Biochem., 55: 569-597 (1986); Katsuki et al., Science, 241: 593-595 (1988)). Важное преимущество указанного подхода заключается в том, что необходим только небольшой участок гена для проявления эффективного ингибирования экспрессии всей мРНК. Антисмысловой трансген помещают под контроль собственного промотора или другого промотора, экспрессируемого в клетках соответствующего типа и расположенного в положении «upstream» полиА-сайта SV40. Указанный трансген используется для получения трансгенных мышей. Трансгенным мышам могут быть привиты трансплантаты яичников для определения, являются ли ob гетерозиготы более чувствительными к эффектам антисмыслового конструкта.

Выяснение биологической функции генного продукта OB (полипептид или белок OB) имеет важное значение для идентификации небольших молекул агонистов и антагонистов, влияющих на его активность.

Ниже приведены примеры некоторых определений, которые используются в данном описании.

Понятие «модулятор веса тела», «модулятор», «модуляторы» и какие-либо варианты данных понятий, специально не перечисленные здесь, могут использоваться как взаимозаменяемые, и в настоящем описании и формуле обозначают, в первую очередь, нуклеотиды и белковые соединения. К последним относятся однородные и сложные белки. Более точно, приведенные выше понятия относятся к нуклеотидам и ДНК, имеющим описанные здесь последовательности, приведенные на Фиг.1А-Е (SEQ ID NO:1) и Фиг.2А и В (SEQ ID NO:3). Кроме того, указанные понятия включают белки с описанной здесь аминокислотной последовательностью, приведенной на Фиг.1А-Е (SEQ ID NO:2) и Фиг.3 (SEQ ID NO:4), как обладающие активностью соединений, указанных в описании и формуле. В соответствии с этим, данные понятия включают нуклеотиды, обладающие по существу эквивалентной или измененной активностью, в том числе гомологичные аналоги и аллельные варианты. Далее, данные понятия относятся к белкам, обладающим по существу эквивалентной или измененной активностью, в частности, белки, модифицированные сайт-направленным мутагенезом или подвергшиеся неожиданным мутациям в организмах-хозяевах, продуцирующих модуляторы.

Композиция, содержащая «А» (где «А»-однородный белок, ДНК-молекула, вектор, рекомбинантная клетка-хозяин и т.д.) практически свободна от «В» (где «В» включает один или более контаминирующих белков, ДНК-молекулы, векторы и т.д., но не относится к рацемическим формам А), когда по крайней мере около 75% по весу белков, ДНК, векторов (в зависимости от типа соединений, к которым принадлежит А и В) в составе композиции представляет собой А. Предпочтительно «А» содержит по крайней мере около 90% по весу от А+В в составе композиции, наиболее предпочтительно по крайней мере 99% по весу. Также желательно, чтобы композиция, которая практически свободна от контаминирующих примесей, содержала только соединения определенной массы, имеющие активность или свойства представляющих интерес соединений.

Полипептиды ОВ

Понятия «белок» (природный полипептид) и «полипептид» используются здесь как взаимозаменяемые в отношении продукта гена ob и его вариантов. Понятия «зрелый белок» или «зрелый полипептид» относятся к продукту гена OB с удаленными сигнальной последовательностью или белком слияния.

Как отмечалось выше, специфические ob полипептиды, заявленные согласно настоящему изобретению, включают соединения, имеющие аминокислотные последовательности, которые приведены здесь, например аминокислотные последовательности SEQ ID NO:2, 4, 5, б и т.д. Заявленные полипетиды ob также включают модифицированные аминокислотными заменами биологически активные фрагменты, аналоги и производные полипептидов. Понятие «биологически активный» означает, что полипептид проявляет специфическое действие, которое включает (но не обязательно ограничивается указанными) специфическое связывание, например, с рецептором, антителом или другой молекулой распознавания; активацию сигнальных путей трансдукции на молекулярном уровне и/или индукцию (или ингибирование посредством антагонистов) физиологических эффектов, опосредованных нативным полипептидом ob in vivo. Полипетиды ОВ, в том числе фрагменты, аналоги и производные, могут быть получены синтетическим путем, например, с помощью хорошо известных методик твердофазного и жидкофазного пептидного синтеза. Предпочтительно использование твердофазных методик. Альтернативно, заявленные полипептиды ОВ могут быть получены с помощью хорошо известных методик генной инженерии, как описано ниже. Кроме того, OB полипептиды могут быть очищены, например, иммуноаффинным способом, из биологической жидкости, такой как (без ограничений указанными) плазма, сыворотка, моча, предпочтительно плазма, сыворотка или моча человека и более предпочтительно индивидуума, в организме которого обнаруживается сверхэкспрессия полипептида, например, страдающего ожирением человека, которое развилось вследствие мутации ОВ рецептора или мутации, приводящей к накоплению избытка жира.

Фрагменты полипептида OB

При определенном варианте осуществления изобретения важное значение могут иметь природные фрагменты полипептида OB. В полипептидной последовательности имеются многочисленные сайты, которые являются участками протеолитического расщепления, например остатки аргинина. Возможно, что полноразмерный полипептид может быть расщеплен по одному или более указанным сайтам с образованием биологически активных фрагментов. Такие биологически активные фрагменты могут быть агонистами или антагонистами функциональной активности полипептида OB для редукции веса тела.

Аналоги ОВ полипептида

Настоящее изобретение относится к получению аналогов пептида ОВ, которые характеризуются биологической активностью полипептида ОВ, например, связыванием со специфическим связывающим партнером ob пептида, например, ОВ-рецептором. В одном случае, аналог является агонистом ОВ-активности, т.е. его функции сходны с функциями ob полипептида. Предпочтительно, чтобы OB агонист был более эффективен, чем нативный белок. Например, агонист-аналог ОВ может связывать ОВ рецептор с более высокой аффинностью или обладать более длинным периодом полужизни in vivo или проявлять оба указанных свойства. Однако в объем настоящего изобретения включены агонисты-аналоги пептида OB, которые обладают меньшей эффективностью, чем нативный белок. В другом случае, аналог является антагонистом OB активности. Например, аналог OB, который связывает ОВ рецептор, но не индуцирует сигнальной трансдукции, способен конкурентно ингибировать связывание нативного ОВ с рецептором, тем самым уменьшая активность ОВ in vivo. Такой антагонист-аналог ОВ может также проявлять свойства, отличные от пептида ob, например обладать более продолжительным (более коротким) периодом полужизни in vivo, более сильной (или менее сильной) связывающей аффинностью по отношению к рецептору ОВ или обладать обоими указанными свойствами.

В одном варианте осуществления изобретения аналог пептида OB представляет собой пептид ОВ, модифицированный замещениями аминокислот в положениях, которые не являются необходимыми для структуры и функции. Например, поскольку известно, что пептид OB биологически активен в организме мышей, замещение дивергентных аминокислотных остатков в последовательности человека по сравнению с аминокислотной последовательностью мыши приведет к получению полезных аналогов ОВ пептида. Например, сериновый остаток в положении 53 или 98 или в обоих положениях (см. непроцессированную пептидную последовательность на Фиг.4) последовательности человека могут быть замещены, например глицином, аланином, валином, цистеином, метионином или треонином. Сходным образом, аргининовый остаток в положении 92 (Фиг.4) может быть замещен, например, аспарагином, лизином, гистидином, глутамином, глутаминовой кислотой, аспарагиновой кислотой, серином, треонином, метионином или цистеином. В соответствии с Фиг.4 другими аминокислотами в пептиде ОВ человека, которые, по-видимому, могут быть замещены, являются следующие: гистидин в положении 118, триптофан в положении 121, аланин в положении 122, глутаминовая кислота в положении 126, треонин в положении 127, лейцин в положении 128, глицин в положении 132, глицин в положении 139, триптофан в положении 159 и глицин в положении 166. В другом случае возможно замещение одного или более остатков в положениях 121-128 (как показано на Фиг.4), например, на глициновые или аланиновые или некоторых из указанных остатков, за исключением серина в положении 123 или лейцина в положении 125. Кроме того, аналогом ОВ полипептида, предпочтительно полипептида человека, является усеченная форма полипептида. Например, показано, что глутамин в положении 49 не является необходимым и может быть делетирован. Сходным образом, можно делетировать некоторые или все дивергентные аминокислотные остатки в положениях 121-128. Изобретение также относится к аналогу ОВ, имеющему минимальную аминокислотную последовательность, необходимую для осуществления биологической активности. Это может быть легко определено, например, путем тестирования активности фрагментов ОВ на способность связываться со специфическими по отношению к ОВ антителам, ингибировать активность нативного ОВ полипептида или выступать агонистами активности нативного ОВ пептида. Кроме того, изобретение относится к усеченному полипептиду ОВ, имеющему структуру петли, образованную дисульфидной связью, которая образуется между остатками цистеина в положениях 117 и 167 (как показано на Фиг.4). Усеченный аналог может соответствовать аминокислотам в положениях от 22 (возможный сайт отщепления сигнальной последовательности от пептида) до 53 (аминокислотный остаток, непосредственно предшествующий участку подвижной петли, выявленному методом ограниченного протеолиза с последующей масс-спектрометрией ОВ полипептида; см. Cohen et al., Protein Science, 4: 1088 (1995)). В ином случае усеченный аналог соответствует аминокислотам в положениях от 61 (остаток, непосредственно следующий за участком подвижной петли, как определено методом ограниченного протеолиза/масс-спектрометрического анализа полипептида ОВ) до 116 (остаток, непосредственно предшествующий первому остатку цистеина). В другом варианте осуществления изобретения усеченный аналог соответствует аминокислотам в положениях 61-167.

Далее, могут быть замещены один или более остатков предполагаемой подвижной петли в положениях 54-60. Например, один или более остатков могут быть замещены лизином, глутаминовой кислотой или цистеином (предпочтительно лизином) для перекрестного связывания, например, с полимером, поскольку подвижная петлевая структура является предпочтительным сайтом модификации белка. Альтернативно, остатки в положениях на подвижной петле могут быть замещены на аминокислотные остатки, которые более устойчивы к протеолизу, но не позволяют существовать подвижной структуре, например, на один или более пролинов. Изобретение также относится к аналогам полипептида ОВ, в которых могут быть осуществлены дальнейшие аминокислотные замены, придающие модифицированным полипептидам большую устойчивость к деградации, например протеолитическому расщеплению.

Специалисту в данной области исследований ясно, что указанные выше размеры фрагментов приблизительны и могут быть добавлены или делетированы от одной до пяти аминокислот на каждом или обоих концевых участках или во внутренней области полипептида или фрагмента указанных усеченных аналогов за тем исключением, что в связанной дисульфидной связью петле остатки цистеина должны быть сохранены.

Обнаружено, что пептид ОВ мыши содержит 50% -спиралей, а полипептид ОВ человека содержит около 60% -спиралей (метод кругового дихроизма рекомбинантных пептидов в сходных условиях). Соответственно в другом варианте осуществления изобретения аминокислотные остатки могут быть замещены с образованием аналогов ОВ полипептида, обладающего усиленной способностью к формированию, например, более стабильных -спиральных структур. Например, предпочтительна -спиральная структура, когда в качестве заместителей аминокислотных остатков нативного ОВ полипептида используются Glu, Ala, Leu, His и Trp. Предпочтительно также использование консервативных аминокислотных замен, например, аспарагиновой кислоты в положениях 29, 30, 44, 61, 76, 100 и/или 106 ( как показано на Фиг.4) на глутаминовую кислоту (Glu); замещение изолейцина на лейцин; замещение глицина или валина или какой-либо дивергентной аминокислоты на аланин (например, серин в положении 53 полипептида ОВ человека замещается на аланин); замещение аргинина или лизина на гистидин и замещение тирозина и/или фенилаланина на триптофан. Увеличение стабильности -спиральной структуры может способствовать получению ОВ аналога, обладающего более высокой активностью, увеличенной связывающей способностью или более продолжительным временем полужизни. В одном варианте осуществления изобретения увеличивается способность к образованию спиралей участка пептида ОВ, соответствующего аминокислотным остаткам 22-53. В другом случае увеличивается способность к образованию спиралей или стабильность участка пептида, соответствующего аминокислотам 61-116. В еще одном варианте осуществления изобретения увеличивается способность к образованию спиралей петлевой структуры с дисульфидной связью, соответствующей аминокислотам 117-167. Изобретение также относится к аналогам ОВ, обладающим повышенной способностью к образованию -спиралей или стабильностью, что характеризует более чем один из указанных выше доменов. Кроме того, получены усеченные полипептидные аналоги ОВ, содержащие аминокислотные остатки, образующие структуры, например спирали, чтобы компенсировать способность полипептидных фрагментов утрачивать стабильную структуру.

Аналоги, например фрагменты, могут быть получены при расщеплении пептидных модуляторов пепсином. Другие аналоги, скажем, мутеины, могут быть получены стандартным сайт-направленным мутаганезом последовательностей, кодирующих пептидные модуляторы веса. Аналоги, проявляющие активность модуляторов веса, такие как небольшие молекулы, функционирующие в качестве промоторов или ингибиторов, могут быть идентифицированы известными методами in vivo и/или in vitro.

Небольшие молекулы-аналоги и пептидомиметики полипептида ОВ

Структура ob полипептида, предпочтительно полипептида ОВ человека, может быть изучена различными методами, известными из уровня техники. Белковая последовательность может быть охарактеризована методом гидрофильности (см., например, Норр et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 3824(1981)). Профиль гидрофильности может быть использован для идентификации гидрофильных и гидрофобных участков ОВ полипептида, по которым можно выявить области, направленные во внешнюю среду. Кроме того, может быть осуществлен анализ вторичной структуры {см., например, Chou et al., Biochem., 13: 222 (1974)) для идентификации участков OB полипептида, имеющих специфическую вторичную структуру. Манипуляции с предсказанной или определенной структурой, в том числе предсказанной вторичной структурой, могут проводиться при использовании известных программ на гибких дисках.

Признавая существование многочисленных источников рекомбинантного ОВ полипептида, настоящее изобретение позволяет количественно охарактеризовать структуру полипептида. В частности, имеется достаточное количество материала для осуществления ядерного магнитного резонанса (NMR), инфракрасного (IR), рамановского и ультрафиолетового (UV), спектроскопического анализа, в особенности основанного на круговом дихроизме (CD). Анализ на основе NMR является очень эффективным структурным анализом молекул в растворе, т.е. в среде, максимально приближенной к природному окружению молекул (Marion et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 113: 967-974 (1983); Bar et al., J. Magn. Reson., 65: 335-360 (1983); Kimura et ai, Natl. Acad. Sci. USA, 77: 1681-1685 (1980)). Могут быть использованы другие методы структурного анализа. Они включают, например, кристаллографию с помощью рентгеновских лучей, но не ограничиваются указанными (Engston, Biochem. Exp. Bid., 11: 7-13 (1974)).

В еще одном варианте осуществления изобретения аналог полипептида OB может быть тестирован на способность перекрестно взаимодействовать с антителом, специфичным к нативному OB полипептиду или его фрагментам. Степень перекрестной реактивности позволяет судить о структурной гомологии или сходстве белков или о доступности участков, соответствующих областям полипептида, которые обусловливают образование антител, специфичных к фрагментам.

Скрининг аналогов ОВ

Известны многочисленные методы скрининга аналогов полипептидов. Доступны различные библиотеки химических соединений. Соответственно настоящее изобретение относится к скринингу таких библиотек, например библиотек синтетических соединений, полученных за годы исследований, библиотек природных соединений и смешанных библиотек, как детально описано ниже, для выявления аналогов полипептида ОВ. В одном случае изобретение включает скрининг таких библиотек для отбора соединений, связывающих антитела к ОВ полипептиду, предпочтительно антитела к ob полипептиду человека. В другом случае, поскольку идентифицирован ОВ-рецептор (см. ниже), любой известный способ скрининга может быть использован для выявления агонистов или антагонистов рецептора OB. Изобретение относится также к скринингу небольших молекул лигандов, или аналогов лигандов, или миметиков, так же, как и к скринингу природных лигандов, связывающих ОВ рецептор in vivo, или представляющих собой его агонисты или антагонисты.

Знание первичной последовательности рецептора и степени сходства данной последовательности с белками известной функции может сыграть решающее значение в выявлении агонистов или антагонистов белка. Идентификация и скрининг антагонистов может дополняться изучением структурных свойств белка, например, с помощью рентгеновской кристаллографии, нейтронной дифракции, спектрометрии на основе ядерного магнитного резонанса и других методик исследования структуры белков. Указанные методики обеспечивают рациональное конструирование или идентификацию агонистов или антагонистов.

Другой подход использует рекомбинантные бактериофаги для получения больших библиотек. С помощью «фагового метода» (Scott et al., Science, 249: 386-390 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378-6382 (1990); Devlin et al., Science, 249: 404-406 (1990)) могут быть получены большие библиотеки (106-108 химических «сущностей»). Можно использовать прямые химические методы, примерами которых могут служить метод Гейзена (Geysen et al., Molecular Immunology, 23: 709-715 (1986); Geysen et al., J. Immunologic Method, 102: 259-274 (1987)) и недавно разработанный метод Фодора (Fodor et al., Science, 251: 767-733 (1991)). Описаны многочисленные методы получения смеси пептидов, которые могут быть тестированы как агонисты или антагонисты (Furka et al., 14ый Международный Конгресс Биохимии, Том 5, Реферат FR: 013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res., 37: 487-493 (1991); Houghton (Патент США №4631211, выданный в декабре 1986); и Rutter et al., (Патент США №5010175, выданный 23 апреля 1991)).

Еще один вариант осуществления изобретения включает использование синтетических библиотек, которые скринируют на присутствие лигандов рецептора ОВ в соответствии с данным изобретением (Needeles et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10700-10704 (1993); Lam et al., Опубликованная заявка РСТ 92/00252; все источники информации приведены здесь в качестве ссылок). С помощью указанных библиотек могут быть выявлены антагонисты рецепторов при использовании клеток, экспрессирующих рецептор, без непосредственного клонирования ОВ рецептора.

Альтернативно, может быть осуществлено исследование связывания растворимого лиганда с клетками, экспрессирующими рекомбинантные формы связывающего лиганд домена ОВ рецептора. Растворимые лиганды могут быть получены известными методами, как рекомбинантный или синтетический ОВ полипептид.

Скрининг может быть проведен с помощью рекомбинантных клеток, которые экспрессируют ОВ рецептор или, альтернативно, при использовании очищенного рецепторного белка, например полученного рекомбинантным путем, как описано выше. Например, способность меченого, растворимого или солюбилизированного ОВ рецептора, включающего лиганд-связывающий участок молекулы, связывать лиганд может быть использована для скрининга библиотек, как описано в приведенных выше ссылках.

Производные ОВ полипептидов

В целом, белок (здесь термин «белок» охватывает понятие «полипептид», если не указано иное) может быть модифицирован прикреплением одной или более химических групп. Химически модифицированные производные могут применяться интраартериальным, интраперитонеальным, внутримышечным, подкожным, внутривенным, оральным, назальным, ректальным, подъязычным, пульмонарным, внутрикожным способом, а также в виде аппликаций и др. образом. Обнаружено, что химическая модификация биологически активных белков сообщает им дополнительные преимущества в определенных условиях, например увеличение стабильности и времени циркуляции терапевтически активного белка и увеличение его иммуногенности. См. Патент США №4179337, Davis et al., выданный 18 декабря 1979. В качестве обзора см. Abuchowski et al., «Растворимые производные полимер/фермент» в кн. Ферменты как Лекарства, стр. 367-383, под. ред. Хольценберга и Робертса, Wiley-Interscience, New York, NY, (1981). Обзорная статья, посвященная белкам слияния и модифицированным белкам, опубликована Francis, Focus on Growth Factors, 3:4-10 (1992).

Химические группы для модификации

Химические группы (соединения), используемые для модификации белков, могут включать водорастворимые полимеры. Выбранный полимер должен быть водорастворимым, так чтобы белок, к которому он прикреплен, не преципитировал в водной среде, например физиологической. Предпочтительно, чтобы в случае терапевтического использования конечного продукта полимер был фармацевтически приемлемым. Специалист в данной области исследований может выбрать полимер с учетом возможности использования конъюгата полимер/белок в терапевтических целях в зависимости от вводимой дозы, времени циркуляции, устойчивости к протеолизу и других факторов. Для заявленых белков и полипептидов могут быть использованы описанные здесь методы.

Молекулы полимеров

Водорастворимый полимер может быть выбран из группы, включающей, например, полиэтиленгликоль, сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1, 3, 6-триоксан сополимер этилена/малеимового ангидрида, полиаминокислоты (гомополимеры или выборочные сополимеры), полипропиленгликолевые гомополимеры декстрана или поли (n-винилпирролидон) полиэтиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы и поливиниловый спирт. Пропиональдегид полиэтиленгликоля может иметь определенные преимущества, поскольку стабилен в воде.

Полимер может иметь любой молекулярный вес и быть как разветвленным, так и неразветвленным. Для полиэтиленгликоля предпочтительный молекулярный вес составляет около 2-100 кДа (понятие «около» означает, что мол. вес некоторых молекул в препаратах полиэтиленгликоля может быть больше или несколько меньше, чем указанный). Может быть использовано соединение другого мол. веса в зависимости от желаемых терапевтических целей (например, продолжительности периода выведения, характера действия, если известна биологическая активность, легкости манипулирования, степени наличия или утраты антигенности и других известных эффектов полиэтиленгликоля на терапевтически активный белок или его аналог).

Отношение полимер/белок

Количество присоединяемых молекул полимера может варьировать, и специалист в данной области исследований может установить взаимосвязь эффекта и функции. Можно получить моно-, да-, три-, тетра-производные или производные другого порядка на основе одного и того же или различных химических соединений (например, полимеров, таких как полиэтиленгликоль различной мол. массы). Соотношение молекул полимера и белка (или пептида) может варьировать, так же, как и их концентрация в реакционной смеси. В целом, оптимальное соотношение (с точки зрения эффективности реакции, когда не образуется избытка непрореагировавшего белка или полимера) может быть определено в зависимости от таких фактов, как желаемая степень дериватизации (например, моно-, ли-, три- и т.д.), мол. массы выбранного полимера, разветвленный он или линейный, и условий реакции.

Прикрепление химических групп к белку

Полиэтиленгликолевые молекулы (или другие химические группы) следует присоединять к белку без существенного изменения функциональных или антигенных доменов белка. Специалистам известны способы присоединения различных молекул к белкам (см., например, ЕР №0401384 (связывание ПЭГа с G-CSF); Malik et al., Exp. Hematol., 20: 1028-1035 (1992) (ПЭГирование GM-CSF с помощью трезилхлорида)). Источники информации приведены здесь в качестве ссылки. Например, полиэтиленгликоль может быть ковалентно связан с аминокислотными остатками посредством реакционноспособной группы, такой как свободная амино или карбоксильная группа. Реакционноспособные группы должны связывать активированную молекулу полиэтиленгликоля. Аминокислотные остатки, имеющие свободную аминогруппу, включают остатки лизина и N-концевые аминокислотные остатки, а имеющие свободную карбоксильную группу включают остатки аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и С-концевой аминокислотный остаток. В качестве реакционноспособной группы для прикрепления молекул полиэтиленгликоля могут быть использованы сульфгидрильные группы. Предпочтительным для терапевтических целей является прикрепление к аминогруппе, например, N-концевой или лизиновой группе. Прикрепление к аминокислотным остатками, важным для связывания рецептора, может оказаться нежелательным, если предполагается рецепторное связывание.

Химически модифицированные на N-концевом участке белки

Может оказаться желательным получение химически модифицированного белка на N-концевом участке. При использовании в качестве примера полиэтиленгликоля можно выбрать различные полиэтиленгликолевые молекулы (исходя из мол. массы ПЭГа, степени ветвления и т.д.), соотношение молекул ПЭГа и молекул белка (или пептида) в реакционной смеси, тип реакции ПЭГирования и способ получения заданного модифицированного по N-концевому участку белка. Способ получения ПЭГированного по N-концевому участку соединения (т.е. выделение этого типа молекул из смеси с другими моноПЭГированными молекулами, если это необходимо) может заключаться в очистке N-терминального ПЭГированного вещества из смеси ПЭГированных белков их молекул. Избирательная химическая модификация по N-концевому участку может осуществляться путем восстановительного алкилирования, основанного на различной реакционной способности различных типов первичных аминогрупп (лизин в противоположность N-терминальным аминокислотам), способных опосредовать модификацию определенного белка. В подходящих реакционных условиях достигается практически избирательная модификация белка по N-терминальному участку с помощью полимера, включающего карбонильную группу. Например, можно избирательно ПЭГировать белок по N-концевому участку, проводя реакцию при определенном значении рН, обеспечивающем различия в рК между эпсилон-аминогруппами остатков лизина и -аминогруппой N-концевого участка белка. За счет такого избирательного модифицирования присоединение водорастворимого полимера к белку контролируется: конъюгация с полимером происходит преимущественно по N-концевому участку белка и не происходит существенной модификации других реакционноспособных групп, таких как лизиновые аминогруппы боковой цепи. При использовании восстановительного алкилирования водорастворимый полимер может быть указанного выше типа и содержать одну реакционноспособную альдегидную группу для соединения белком. Может быть использован пропионовый альдегид полиэтиленгликоля, содержащий одну реакционноспособную альдегидную группу.

Нуклеиновые кислоты, связанные с полипептидом ОВ

Как указывалось выше, настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим ob полипептиды, в том числе некодирующим последовательностям 5', 3' и интронным последовательностям ОВ гена. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, могут быть использованы известные методики молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантных ДНК. Такие методики подробно описаны в литературе. См., например, Sambrook et al., Молекулярное клонирование: Лабораторное руководство, 2ое издание. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Glover ed, Клонирование ДНК: Практическое руководство. Том I и II, Олигонуклеотидный синтез, Oxford University Press (1984); Hames et al., eds., Гибридизация нуклеиновых кислот, Springer-Veriag (1985); Hames et al., eds., Транскрипция и Трансляция, Oxford University Press (1984); Freshney ed., Культура животной ткани, Oxford University Press (1984); Иммобилизованные клетки и ферменты, IRL Press (1986); Perbai, Практическое руководство по молекулярному клонированию, Wiley, New York (1984). Определенное отношение к настоящему изобретению имеют методики изолирования, клонирования, секвенирования, анализа и описания гена или нуклеиновой кислоты на основе хорошо известной полимеразной цепной реакции.

«Репликон» означает какой-либо генетический элемент (например, плазмиду, хромосому, вирус), который функционирует как автономная единица репликации ДНК in vivo, т.е. способен к репликации под своим собственным контролем.

«Вектор» представляет собой репликон, такой как плазмида, фаг или космида, который содержит чужеродный фрагмент ДНК, способный реплицироваться в составе вектора.

«Кассета» означает фрагмент ДНК, который может быть встроен в вектор по специфическим рестрикционным сайтам. Фрагмент ДНК кодирует заданный полилептид, а кассета и рестрикционный сайты конструируются таким образом, чтобы обеспечить встраивание кассеты в подходящую открытую рамку считывания для транскрипции и трансляции.

«Гетерологичная» ДНК относится к ДНК, которая изначально не присутствует в клетке, или хромосомальном участке клетки. Предпочтительно, гетерологичная ДНК включает чужеродный для клетки ген:

Клетка «трансфицирована» экзогенной или гетерологичной ДНК, когда такая ДНК введена в клетку. Клетка «трансформирована» экзогенной или гетерологичной ДНК, когда воздействие такой ДНК изменяет фенотип клетки. Предпочтительно, чтобы трансформирующая ДНК была интегрирована (ковалентно связана) с хромосомальной ДНК в составе генома клетки.

«Клон» означает популяцию клеток, образовавшихся из одной клетки или общего предшественника в результате митоза.

«Молекула нуклеиновой кислоты» означает спиралевидную полимерную форму фосфатного эфира рибонуклеозидов (аденозина, гуанозина, урилина или цитидина для РНК-молекул) или дезоксирибонуклеозидов (дезоксиаденозина, дезоксигуанозина, дизокситимидина или дезоксицитидина для молекул ДНК) как одноцепочечную, так и двухцепочечную. Возможно образование спиралей двухцепочечных ДНК-ДНК, ДНК-РНК и РНК-РНК. Понятие «молекула нуклеиновой кислоты», в частности молекула ДНК или РНК, относится только к первичной или вторичной структуре молекулы и не включает какую-либо третичную или четвертичную форму. Таким образом, данное понятие означает двухцепочечную ДНК, inter alia, линейные или кольцевые молекулы ДНК (например, рестрикционные фрагменты), плазмиды и хромосомы. При обсуждении структуры определенных двухцепочечных ДНК-молекул последовательности могут быть описаны в соответствии со стандартными требованиями указания последовательностей только в направлении 5'-3' вдоль нетранскрибируемой цепи ДНК (т.е. цепи, имеющей гомологичную последовательность по отношению к мРНК). «Рекомбинантная ДНК-молекула» означает ДНК-молекулу, которая была подвергнута молекулярно-биологическим манипуляциям.

Молекула нуклеиновой кислоты является «гибридизуемой» с другой молекулой нуклеиновой кислоты, например, кДНК, геномной ДНК или РНК, когда одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты способна к отжигу с другой молекулой нуклеиновой кислоты в подходящих условиях, т.е. при определенных значениях температуры и ионной силы раствора (см. Sambrook et al., 1989, supra). Условия температуры и ионной силы определяют «жесткость» («строгость») гибридизации. Для предварительного скрининга гомологичных нуклеиновых кислот могут быть использованы условия низкой строгости, соответствующие Тm 55°С, например, 5х SSC, 0.1% SDS, 0.25%-ное молоко и отсутствие формамида; или 30%-ный формамид, 5х SSC, 0.5% SDS. Гибридизационные условия средней строгости соответствуют более высокой Тm, например, 40%-ный формамид с 5х или 6xSSC. Условия гибридизации высокой жесткости соответствует наивысшей Тm, например, 50%-ный формамид, 5х или 6х SSC. Для гибридизации необходимо, чтобы две молекулы нуклеиновой кислоты содержали комплементарные последовательности, и несмотря на жесткость условий гибридизации обеспечивалась возможность совпадения нуклеотидов. Подходящие условия гибридизации нуклеиновых кислот зависят от длины нуклеиновых кислот и степени комплементарности, что хорошо известно из уровня техники. Большая степень сходства или гомологии между двумя нуклеотидными последовательностями требуют и более жестких условий гибридизации (значения Тm). Относительная стабильность (в соответствии с увеличением Тm) гибридов нуклеиновых кислот увеличивается в следующем порядке: РНК: РНК, ДНК: РНК, ДНК:ДНК. Для гибридов, имеющих в длину более 100 нуклеотидов, должно быть получено правильное соотношение Тm (см. Sambrook et al., 1989, supra, 9.50-0.51). Для гибридизации более коротких нуклеиновых кислот, т.е. олигонуклеотидов, положение совпадающих нуклеотидов становится более важным и длина олигонуклеотида определяет его специфичность (см. Sambrook et al., 1989, supra, 11.7-11.8). Предпочтительная минимальная длина нуклеиновой кислоты для гибридизации составляет по крайней мере около 10 нуклеотидов, более предпочтительно по крайней мере около 15 нуклеотидов, еще более предпочтительно по крайней мере около 20 нуклеотидов.

«Гомологичная рекомбинация» означает встраивание чужеродной ДНК-последовательности вектора в хромосому. Предпочтительно, чтобы вектор имел специфический хромосомный сайт для гомологичной рекомбинации. Для специфической гомологичной рекомбинации вектор должен содержать достаточно протяженные участки гомологии с последовательностями хромосомы для обеспечения комплементарного связывания и встраивания вектора в хромосому. Более протяженные участки гомологии и большая степень сходства последовательностей способны увеличить эффективность гомологичной рекомбинации.

ДНК «кодирующая последовательность» представляет собой двухцепочечную последовательность ДНК, которая транскрибируется и транслируется с образованием полипептида в клетке in vitro или in vivo, находясь под контролем соответствующей регулярной последовательности. Границы кодирующей последовательности определяются стартовым кодоном на 5'(амино)-концевом участке и стоп-кодоном на 3'(карбокси)-концевом участке. Кодирующая последовательность может представлять собой (без ограничений указанными) прокариотические последовательности, кДНК эукариотической мРНК, геномные ДНК-последовательности эукариотической ДНК (например, млекопитающих) и даже синтетические ДНК-последовательности. Если кодирующая последовательность предназначена для экспрессии в эукариотической клетки, необходимо, чтобы на 3'-концевом участке был локализован сигнал полиаденилирования и транскрипции.

Выделение кодирующих ОВ и фланкирующих последовательностей

Нуклеиновые кислоты, заявленные согласно настоящему изобретению, кроме того, кодируют пептиды, представленные на фиг. 1A-D (SEQ ID NO:2), фиг. 3 (SEQ ID NO:4), фиг. 5 (SEQ ID NO:5), фиг. 6 (SEQ ID NO:6). Соответственно поскольку выделена и секвенирована специфическая ДНК, относящаяся к гену ob, любая животная клетка может служить потенциальным источником нуклеиновой кислоты для молекулярного клонирования гена, кодирующего пептиды, полученные согласно настоящему изобретению. ДНК может быть получена известными методами из клонированной ДНК (например, ДНК-библиотеки), путем химического синтеза, путем клонирования кДНК, путем клонирования геномной ДНК или ее фрагментов или очисткой из соответствующей клетки (См, например, Sambrook et al., 1989, supra; Glover, 1985, supra). Клоны, полученные из геномной ДНК, могут содержать интронные и регуляторные ДНК-участки в дополнение к кодирующим областям; полученные из кДНК, не содержат интронных последовательностей. Независимо от источника получения ген следует клонировать в подходящем векторе для «накопления» в достаточном количестве.

При молекулярном клонировании гена из геномной ДНК геномную ДНК следует амплифицировать с помощью праймеров, выбранных из кДНК-последовательностей. Альтернативно, получают ДНК-фрагменты, некоторые из которых кодируют нужный ген. ДНК может быть расщеплена по специфическим сайтам с помощью различных ферментов рестрикции. Кроме того, можно использовать ДНКазу совместно с марганцем для фрагментирования ДНК, или же ДНК может быть разрушена физическими методами, например с помощью ультразвука. Линейные ДНК-фрагменты затем могут быть разделены по размеру известными методами, включая (но не ограничиваясь указанными) электрофорез в агарозном и полиакриламидном геле и хроматографию на колонке.

После получения ДНК-фрагментов идентификацию специфического ДНК-фрагмента, содержащего необходимый ген ob или ob-подобный ген, можно осуществить многочисленными способами. Например, если ob-ген или ob-подобный ген или специфическая РНК или ее фрагмент доступны в таком количестве, что могут быть очищены и связаны с меткой, ДНК-фрагменты могут быть скринированы путем гибридизации нуклеиновых кислот с меченой пробой (Benton et al., Science, 196: 180 (1977); Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 72: 3961 (1975)). Настоящее изобретение обеспечивает доступность таких нуклеиновых проб, которые могут быть получены соответствующим образом на основе описанных здесь специфических последовательностей, например может быть получена гибридизуемая проба, имеющая нуклеотидную последовательность, соответствующую по крайней мере 10, предпочтительно 15 нуклеотидам последовательностей, представленных на Фиг.1А-Е (SEQ ID NO:1) или Фиг.2А и В (SEQ ID NO:3). Предпочтительно, чтобы отбирался фрагмент, являющийся уникальным пептидным модулятором согласно данному изобретению. ДНК-фрагменты, по существу гомологичные пробе, будут с ней гибридизоваться. Как отмечалось выше, чем выше степень гомологии, тем более жесткие условия гибридизации требуются. В одном случае условия гибридизации слабой строгости используются для идентификации гомологичного модуляторного пептида. Однако, предпочтительно, и как экспериментально показано авторами изобретения, нуклеиновая кислота, кодирующая модуляторный пептид согласно настоящему изобретению, будет гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, имеющей нуклеотидную последовательность, такую как представлена на Фиг.1А-Е (SEQ ID NO:1) или Фиг.2А и В (SEQ ID NO:3), или с ее фрагментом в условиях средней строгости. Более предпочтительно, чтобы такая нуклеиновая кислота гибридизовалась в условиях высокой строгости.

Альтернативно, наличие гена может быть определено методами, основанными на физических, химических или иммунологических свойствах экспрессируемого продукта. Например, среди кДНК-клонов или ДНК-клонов, которые селективно гибридизуются с соответствующими мРНК, могут быть отобраны такие, которые продуцируют нужный белок, например имеющий сходную или идентичную электрофоретическую подвижность, параметры изоэлектрического фокусирования, карту протеолитического расщепления, тирозинфосфатазную активность или антигенные свойства, характерные для модуляторных пептидов. Например, антитела, полученные согласно настоящему изобретению, могут использоваться для скрининга гомологов модуляторных пептидов из других источников.

Ген, кодирующий модуляторный пептид согласно изобретению, может быть также идентифицирован путем селекции мРНК, т.е. гибридизацией нуклеиновых кислот после трансляции in vitro. В этом случае фрагменты используются для выделения комплементарных мРНК путем гибридизации. Такие ДНК-фрагменты могут соответствовать доступной очищенной ДНК модулятора. Для идентификации мРНК и, следовательно, комплементарных ДНК-фрагментов, содержащих нужные последовательности, используется иммунопреципитационный анализ или функциональный анализ (например, определение тирозинфосфатной активности) in vitro транслированных продуктов изолированных мРНК. Кроме того, специфические мРНК могут быть отобраны путем адсорбции полисом, выделенных из клеток, с помощью иммобилизованных антител, специфически связывающихся с модуляторным пептидом.

Радиоактивно меченная кДНК модуляторного пептида может быть синтезирована с помощью отобранной мРНК (при адсорбции полисом) в качестве матрицы. Радиоактивно меченная мРНК или кДНК может быть также использована как проба для идентификации гомологичных ДНК-фрагментов модуляторного пептида среди других геномных ДНК-фрагментов.

Как отмечалось выше, ДНК-последовательности, кодирующие пептиды модулятора веса, могут быть получены синтетическим путем, а не клонированы. ДНК-последовательность может быть сконструирована при использовании соответствующих кодонов аминокислотных последовательностей пептидных модуляторов веса. В целом, можно выбрать предпочтительные кодоны, если последовательность будет использоваться для экспрессии. Полная последовательность конструируется при использовании перекрывающихся олигонуклеотидов, полученных стандартными методами и объединенных в полную кодирующую последовательность. См., например, Edge, Nature, 292: 756 (1981); Nambair et al., Science, 223: 1299 (1984); Jay et al., J. Biol. Chem., 259: 6311 (1984).

Синтетические ДНК-последовательности могут быть использованы для соответствующего конструирования генов, которые будут экспрессировать аналоги модуляторов веса, как описано выше. Альтернативно, ДНК-кодирующие аналоги могут быть получены путем сайт-направленного мутагенеза нативных ОВ генов или кДНК, и такие аналоги могут непосредственным образом быть использованы для соответствующего синтеза полипептидов.

Основной способ сайт-направленного включения неприродных аминокислот в белки описан Noren et al., Science, 244: 182-188 (1989). Данный способ может быть использован для получения аналогов полипептида ob, содержащих неприродные аминокислоты.

Некодирующие нуклеиновые кислоты

Настоящее изобретение относится к получению антисмысловых нуклеотидов и рибозимов, которые могут быть использованы для регуляции экспрессии белковых модуляторов веса на уровне трансляции. Данный подход подразумевает применение антисмысловой нуклеиновой кислоты и рибозимов для блокирования трансляции специфической мРНК как за счет «маскировки» такой мРНК антисмысловой нуклеиновой кислотой, так и за счет расщепления ее рибозимом.

Антисмысловые нуклеиновые кислоты представляют собой ДНК- или РНК-молекулы, которые комплементарны по крайней мере участку специфической мРНК-молекулы (См., Weintraub, Sci. Am., 262: 40-46 (1990); Marcus-Sekura, Anal. Biochem., 172: 289-295 (1988)). В клетке они гибридизуются с мРНК, образуя двухцепочечную молекулу. Клетка не может осуществлять трансляцию мРНК в двухцепочечной форме. Таким образом, антисмысловые нуклеиновые кислоты препятствуют экспрессии мРНК с образованием белка. Олигомеры длиной около пятнадцати нуклеотидов и молекулы, которые гибридизуются с кодоном инициации AUG, особенно эффективны, поскольку легко синтезируются и, скорее всего, вызывают меньше проблем, чем более крупные молекулы, при введении в клетки, продуцирующие пептидные модуляторы веса. Антисмысловые молекулы использовались для ингибирования экспрессии многих генов in vitro (Marcus-Sekura, 1988, supra; Hambor et al., Y. Exp. Med., 168: 1237-1245 (1988)).

Рибозимы представляют собой РНК-молекулы, обладающие способностью специфически расщеплять другие одноцепочечные РНК-молекулы аналогично рестрикционым ДНК-эндонуклеазам. Рибозимы были открыты на основании наблюдения, что некоторые мРНК способны вырезать свои собственные интроны. Модифицируя нуклеотидную последовательность таких РНК, исследователи смогли сконструировать молекулы, распознающие специфические нуклеотидные последовательности в РНК-молекуле и расщеплять их (Cech, J. Am. Med. Assoc., 260: 3030-3034 (1988)). Поскольку такие молекулы являются специфическими в отношении определенных последовательностей, инактивируются только мРНК, содержащие данные специфические последовательности. Исследователи идентифицировали два типа рибозимов: тип Tetrahynema и тип «головка молотка». Рибозимы типа Tetrahynema распознают последовательности из четырех оснований, а рибозимы типа «головка молотка» распознают последовательности из 11-18 оснований. Более длинные распознаваемые последовательности с наибольшей вероятностью присутствуют в мРНК-мишенях. Поэтому рибозимы типа «головка молотка» имеют предпочтение перед рибозимами типа Tetrahynema для инактивации специфических мРНК, а распознаваемые последовательности из 18 оснований имеют преимущество перед более короткими последовательностями распознавания.

Описанные здесь ДНК-последовательности, таким образом, могут быть использованы для получения антисмысловых молекул и рибозимов применительно к мРНК белковых модуляторов веса и их лигандов, тем самым обеспечивая ингибирование экспрессии ob гена и приводя к увеличению веса и ожирению.

В другом случае согласно изобретению могут быть получены короткие олигонуклеотилы, комплементарные кодирующим и комплементарным цепям (нуклеиновой кислоты ОВ, или некодирующим 5', 3' участкам гена ОВ, или внутренним/интронным) участкам кодирующей области. Такие нуклеиновые кислоты могут быть использованы в качестве проб, например, как непосредственным образом меченные олигонуклеотидные пробы, или как праймеры для полимеразной цепной реакции, для оценки наличия мутаций в гене ob или уровне экспрессии мРНК OB. Предпочтительно, чтобы полученные согласно настоящему изобретению некодируюшие нуклеиновые аминокислоты происходили из гена OB человека.

При осуществлении другого варианта изобретения некодирующие нуклеиновые кислоты используются для гомологичной рекомбинации с целью интеграции амплифицируемого гена и/или других регуляторных последовательностей в непосредственной близости от гена ОВ, например, для получения более высокой степени экспрессии полипептида ОВ или «перекрывания» мутации в регуляторных последовательностях гена ob, которая препятствует заданным уровням экспрессии полипептида ОВ (См. заявку WO 91/06666, опубликованную 16 мая 1991 г. Skoultchi; заявку WO 91/09955, опубликованную 11 июля 1991 г. Chappel; см. также заявку WO 90/14092, опубликованную 29 ноября 1990г. Kucherlapat: and Campbell).

Получение OB полипептида: экспрессия и синтез

Последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию, представляют собой регуляторные ДНК-последовательности, такие как промоторы, энхансеры, терминаторы и подобные им, которые обеспечивают экспрессию кодирующей последовательности в клетке-хозяине. В эукариотических клетках контролирующими последовательностями являются сигналы полиаденилирования.

Кодирующая последовательность находится «под контролем» транскрипционных или трансляционных контролирующих последовательностей в клетке, когда РНК-полимераза транскрибирует кодирующую последовательность с образованием мРНК, которая затем сплайсируется и транслируется с образованием белка, кодируемого данной последовательностью.

«Сигнальная последовательность» включается в начальную область кодирующей последовательности белка, который должен быть экспрессирован на поверхности клетки. Данная последовательность кодирует сигнальный пептид, N-концевой по отношению к зрелому полипептиду, который направляет перемещение полипептида в клетке-хозяине. Понятие «сигнальная последовательность транслокации» также используется здесь для обозначения сигнальной последовательности данного типа. Сигнальные последовательности транслокации могут быть обнаружены в комплексе с различными нативными белками эукариот и прокариот и часто функционально активны в обоих указанных классах организмов. ДНК-последовательность «функционально связана» с контролирующей последовательностью экспрессии, когда данная последовательность контролирует и регулирует транскрипцию и трансляцию ДНК-последовательности. Понятие «функционально связанный» подразумевает наличие подходящего стартового сигнала (например, кодона ATG) перед ДНК-последовательностью, которая должна быть экспрессирована, и возможность «поддержания» открытой рамки считывания для экспрессии ДНК-последовательности под контролем соответствующей последовательности и образования нужного продукта, кодируемого ДНК-последовательностью. Если ген, подлежащий встраиванию в рекомбинантную молекулу ДНК, не содержит подходящего стартового сигнала, такой стартовый сигнал может быть встроен в ген в положение «5'-upstream»» по отношению к открытой рамке считывания.

«Промоторная последовательность» представляет собой регуляторный участок ДНК, способный связывать РНК-полимеразу в клетке и инициировать транскрипцию в направлении «downstream» по отношению к кодирующей последовательности (3'-направление). Для целей настоящего изобретения промоторная последовательность связана на своем 3'-конце с сайтом инициации транскрипции и простирается в направлении «upstream» (5'-направление) и включает минимальное количество оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровнях, превышающих фоновое значение. В пределах промоторной последовательности расположен сайт инициации транскрипции (соответствующим образом выявленный, например, с помощью картирования нуклеазой S1) и белок-связывающие домены (консенсусные последовательности), ответственные за связывание РНК-полимеразы.

Другой аспект настоящего изобретения заключается в экспрессии ДНК-последовательностей, описанных в настоящем изобретении. Как хорошо известно из уровня техники, ДНК-последовательности могут экспрессироваться путем их функционального связывания с последовательностью, контролирующей экспрессию, в составе подходящего вектора экспрессии и его использования для трансформации соответствующего одноклеточного хозяина.

Такое функциональное связывание полученной согласно настоящему изобретению ДНК-последовательности с контролирующей последовательностью экспрессии, конечно, подразумевает включение инициаторного кодона ATG (если он уже не является частью последовательности) в положении «upstream» по отношению к открытой рамке считывания в указанную ДНК-последовательность.

Для экспрессии ДНК-последовательности, заявленной согласно настоящему изобретению, может быть использован широкий спектр комбинаций хозяин-вектор экспрессии. Полезные векторы экспрессии, например, могут состоять из хромосомных сегментов, нехромосомальных и синтетических ДНК-последовательностей. Подходяшие векторы включают производные SV 40 и известные бактериальные плазмиды, например плазмиды Е. coli colE1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC или производные плазмиды pUC, например, векторы pGEX, векторы рЕТ, pmal-c, pFLAG и др., производные плазмид Е. coli, такие плазмиды, как RP4, фаговые ДНК, например многочисленные производные фага , например NM989, и другие фаговые ДНК, например М13, и нитчатые одноцепочечные фаговые ДНК, дрожжевые плазмиды, такие как 2-плазмида или ее производные, векторы эукариотических клеток, такие как векторы, клеток насекомых и млекопитающих, векторы, полученные объединением плазмидных и фаговых ДНК, такие как плазмиды, содержащие фаговую ДНК или другие контролирующие экспрессию последовательности и т.д. В предпочтительном варианте осуществления изобретения экспрессия ob достигается в метилотрофных дрожжах, например Pichia pastoris (см., международную заявку WO 90/03431, опубликованную 5 апреля 1990. Brierly et al.; международную заявку WO 90/10697, опубликованную 20 сентября 1990. Siegel et al.). При специфическом варианте осуществления изобретения (см. ниже) экспрессированный вектор конструируют для экспрессии ob под контролем сигнальной последовательности -фактора спаривания.

В указанных векторах для экспрессии заявленных ДНК-последовательностей используется какая-либо из широко известных последовательностей, контролирующих экспрессию, которая осуществляет свою функцию, если с ней функционально связана заданная последовательность ДНК. Такие последовательности, контролирующие экспрессию, включают, например, ранние или поздние промоторы SV40, CMV, вируса вакцины, вируса полиомы или аденовируса, lac-систему, trp-систему, ТАС-систему, TRC-систему, LTR-систему, основной операторный и промоторный участки фага , контролирующие участки белка оболочки fd, промотор 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислой фосфатазы (например, Pho 5), АОХ1 промотор метилотрофных дрожжей, промоторы -спаривающих факторов дрожжей и другие последовательности, которые, как известно, способны контролировать экспрессию генов прокариотических или эукариотических клеток или вирусов или различные комбинации указанных промоторов.

Для экспрессии ДНК-последовательностей, полученных согласно настоящему изобретению, используются различные одноклеточные клетки-хозяева. К таким хозяевам относятся эукариотические и прокариотические организмы, например, штаммы Е. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces; грибы, в частности, дрожжи {Saccharomyces и метилотрофные дрожжи, такие как Pichia, Candida, Hansenula и Torulopsis); клетки животных, такие как СНО, R1-1, B-W и LM, клетки почки африканской зеленой мартышки (например, cos1, cos7, BSC1, BSC40 и ВМТ10), клетки насекомых (например, Sf9) и клетки человека и растений в тканевой культуре.

Необходимо понимать, что не все векторы, последовательности, контролирующие экспрессию, и организмы-хозяева будут с одинаковой эффективностью обеспечивать экспрессию полученных согласно изобретению ДНК-последовательностей. Кроме того, не все организмы в одинаковой степени пригодны для применения к ним одной и той же системы экспрессии. Однако специалист в данной области исследований способен выбрать подходящие векторы, последовательности, контролирующие экспрессию, и организмы-хозяева для обеспечения необходимой экспрессии, не выходя за рамки объема изобретений. Например, при выборе вектора необходимо учитывать свойства организма-хозяина, поскольку вектор должен функционировать в его клетках. Также необходимо принимать во внимание число копий вектора, способность контролировать указанное число копий и возможность экспрессии каких-либо других белков, кодируемых вектором, например, маркерных антибиотиков.

При выборе последовательности, контролирующей экспрессию, в норме необходимо учитывать различные факторы. К ним относится, например, относительная длина последовательности, эффективность ее действия, совместимость с определенной ДНК-последовательностью или геном, которые подлежат экспрессии, в особенности с учетом возможной вторичной структуры. Подходящие одноклеточные организмы-хозяева выбирают с учетом их совместимости с выбранным вектором, секреторной активности, способности надлежащим образом «скручивать» белки, ферментативной активности, токсичности для хозяина продукта, кодируемого подлежащей экспрессии ДНК-последовательности, и легкостью очистки продуктов экспрессии.

С учетом приведенных и других факторов специалист в данной области знаний способен сконструировать различные системы «вектор/последовательность, контролирующая экспрессию, организм-хозяин», с помощью которых будет обеспечиваться экспрессия заданных ДНК-последовательностей, полученных согласно настоящему изобретению, в ферментационной или крупномасштабной культуре животной ткани.

При особом варианте осуществления изобретения может быть экспрессирован белок слияния ОВ. Данный белок содержит по крайней мере функционально активный участок не ОВ белка, соединенный посредством пептидной связи по крайней мере с функционально активным участком полипептида ОВ. Последовательности не ob могут быть присоединены с амино-концевого или карбокси-концевого участка последовательностей OB. Более предпочтительно, когда с целью обеспечения стабильной экспрессии протеолитически неактивного белка слияния не ОВ соединяют посредством пептидной связи с амино-концевым участком белка ОВ. Рекомбинантная ДНК-молекула, кодирующая такой белок слияния, включает последовательность, кодирующую по крайней мере функционально активный участок не OB белка, соединенный в рамке считывания с ОВ-кодирующей последовательностью, и предпочтительно кодирующую сайт расщепления специфической протеазой, например тромбином или фактором Ха, предпочтительно в месте соединения ОВ - не ОВ. Белок слияния может быть экспрессирован в Escherichia coli или Р. pastoris.

При осуществлении специфического варианта изобретения (см. ниже) получают векторы для экспрессии ob генов человека и мыши (содержащие или не содержащие кодон для gln-49) в бактериальной или дрожжевой системе экспрессии (Pichia) с образованием белков слияния. Ген ob получают с помощью PCR и новых праймеров. Желательно использовать методику PCR, поскольку вероятность включения точечной мутации в этом случае увеличивается. Используют плазмиду, содержащую гистидиновую метку (His-tag) и сайт протеолитического расщепления. Наличие гистидина позволяет избирательно выделять рекомбинантные белки на Ni-хелатирующей колонке или путем аффинной очистки. Сайт протеолитического расщепления, см. выше, а именно сайт расщепления тромбином, конструируют таким образом, чтобы обработка протеазой, например тромбином, высвобождала полноразмерный зрелый (т.е. утративший сигнальную последовательность) полипептид OB.

В другом случае может быть получен вектор pGEX (Smith et ai, Gene 67: 31-40 (1988)). В состав данного вектора входит кДНК глутатион S-трансферазы Schistosoma japonicum, соединенная с заданной последовательностью. Бактериальные белки собирают, и рекомбинантные белки могут быть быстро очищены аффинной хроматографией на восстанавливающей глутатионовой колонке. Носитель GST затем удаляют из белков слияния путем расщепления сайт-специфическими протеазами. После расщепления носитель и непереваренный белок слияния могут быть удалены абсорбцией на глутатионовой агарозе. При использовании указанной системы возникают затруднения, когда белок нерастворим в водной среде.

Экспрессия рекомбинантных белков в бактериальных системах может приводить к неправильному скручиванию экспрессированного белка, что требует восстановления его структуры. Рекомбинантный белок может быть «перекручен» либо до, либо после расщепления с образованием функционально активного полипептида OB. Полипептид OB может быть восстановлен при осуществлении следующих стадий: (1) инкубации белка в денатурирующем буфере, содержащем восстанавливающий агент, и (2) инкубации белка в буфере, содержащем окисляющий агент и предпочтительно содержащем стабилизирующий белок агент или хаотропный агент либо оба указанные соединения. Может быть использована пара, состоящая из окисляющего и восстанавливающего агентов, которая включает (но не ограничивается указанным) восстановленный глутанион/глутанион дисульфид, цистин/цистеин, цистеамин/цистеамин и 2-меркаптоэтонол/2-гипроксиэтилдисульфид. В частном случае белок слияния может быть солюбилизирован в денатуранте, например мочевине, до помещения в восстанавливающий буфер. В предпочтительном случае белок также очищают, например, ионообменной или Ni-хелатируюшей хроматографией до помещения в восстанавливающий буфер. Денатурирующие агенты включают (но не ограничиваются указанными) мочевину и гуанидин - HCl. Рекомбинантный белок затем разводят по крайней мере в 10 раз, более предпочтительно в 100 раз, в окисляющем буфере, содержащем окисляющий агент, такой как (однако без ограничений указанными) 0.1 М Трис-HCl, рН 8.0, 1мМ ЭДТА, 0.15 М NaCl, 0.3 М окисленный глутатион. Белок слияния затем инкубируют в интервале около 1-24 ч, предпочтительно в интервале около 2-16 ч при комнатной температуре в окисляющем буфере. Окисляющий буфер может содержать белок-стабилизирующий агент, например, сахар, спирт или сульфат аммония. Окисляющий буфер может также содержать хаотропный агент в низкой концентрации для дестабилизации «неправильных» межмолекулярных взаимодействий и таким образом способствовать «правильному» скручиванию. Подходящие хаотропные агенты включают (но не ограничиваются указанными) детергент, полиол, -аргинин, гуанидин-HCl и полиэтиленгликоль (ПЭГ). Важно использовать достаточно низкую концентрацию хаотропного агента для избежания денатурации белка. Белок с восстановленной структурой может быть сконцентрирован по крайней мере в 10 раз, более предпочтительно до того количества, в котором он вносится в окисляющий буфер.

Бактериальные ферментационные процессы могут приводить к тому, что в препаратах рекомбинантного белка содержатся нежелательные уровни эндотоксинов. Изобретение обеспечивает удаление таких эндотоксинов, например, при использовании эндотоксин-специфических антител или других веществ, связывающих эндотоксин. Присутствие эндотоксина выявляют стандартными методами, например, при использовании Е-ТОХАТЕ реагентов (Sigma, St. Louis, Missouri) или с помощью биологического анализа.

Помимо указанного авторы изобретения предлагают использовать для экспрессии ob белка системы на основе бакуловируса, клеток млекопитающих или дрожжей. Например, в бакуловирусной системе экспрессии используются следующие векторы: векторы переноса без слияния (не ограничиваются указанными) pVL 941 (Bam HI - клонирующий сайт; Summers), pVL 1393 (Bam HI, Sma I, Xba I, Not I, Xma III, Bgl I и Pst I- клонирующие сайты; Invitrogen), pVL 1392 (Bgl II, Pst II, Not I, Xma III, EcoR I, Xba I, Sma I и Bam III-клонирующие сайты; Summers and Invitrogen) и pBlue Вас III (Bam HI, Bgl II, Pst I, Nco I и Hind III- клонирующие сайты с возможным скринингом рекомбинант «белый/голубой»; Invitrogen) и векторы переноса со слиянием (не ограничиваются указанными) рАс 700 (Bam HI и Kpn I - клонирующие сайты, в которых сайт распознавания Bam HI начинается с инициаторного кодона; Summers), рАс 701 и рАс 702 (аналогичный рАс 700 с различными рамками считывания), рАс 360 (Ват HI - клонирующей сайт из 360 пар оснований, расположенный в положении «downstream» по отношению к инициаторному кодону полиэдрина; Invitrogen (195)) и pBlueBacHis А, В, С (три различные рамки основания с Bam HI, Bgl II, Pst I, Nco I и Hind III- клонирующими сайтами, N-концевой пептид для ProBond - очистки и возможным скрингом рекомбинантных бляшек «белый/голубой»; Invitrogen (220)).

Векторы экспрессии в клетках млекопитающих, согласно настоящему изобретению, включают векторы с индуцибельными промоторами, такими как промотор дигидрофолатредуктазы (DHFR), например, какой-либо экспрессионный вектор в сочетании с DHFR -экспрессионным вектором или DHFR/метотрексат коамплификационный вектор, такой как pED (Pst I, Sal I, Sba I, Sma I и Eco RI - клонирующие сайты в сочетании вектором, экспрессирующим клонированный ген и DHFR; см., Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991)). Альтернативно, может быть использован глутамин синтетаза/метионин сульфоксимин коамплификационный вектор, например, рЕЕ14 (Hind III, Xba I, Sma I, Sba I, Eco RI и Bcl I- клонирующие сайты с экспрессией клонированного гена и глутаминсинтазы; Celltech). В другом случае может быть использован вектор, направляющий эписомальную экспрессию под контролем вируса Эпштейна-Барр (EBV), например pREP4 (Bam HI, Sfi I, Xho I, Not I, Nhe I, Hind III, Nhe I, Pvu II и Kpn I - клонирующий сайты, конститутивный RSV-LTR промотор, селективный маркер гигромицина; Invitrogen), рСЕР4 (Bam HI, Sfi I, Xho I, Not, Nhe I, Hind III, Nhe I, Hind III, Nhe I, Pvu II и Kpn I- клонирующие сайты, конститутивный немедленно ранний ген hCMV, селективный меркер гигромицина; Invitrogen), pMEP4 (Kpn I, Pvu I, Nhe I, Hind III, Not I, Xho I, Sfi I, Bam HI- клонирующие сайты, индуцибельный промотор гена металлотионеина II, селективный маркер гигромицина; Invitrogen), pREPS (Bam HI, Xho I, Not I, Hind III, Nhe I и Kpn I- клонирующие сайты, RSV-LTR промотор, селективный маркер гистилинола; Invitrogen), pREP9 (Kpn I, Nhe I, Hind III, Not I, Xho I, Sfi I и Bam HI - клонирующие сайты, RSV-LTR-промотор, G418 селективный маркер, Invitrogen) и pEBVHis (RSV-LTR-промотор, селективный маркер гигромицина, N-концевой пептид для очистки на смоле ProBond и расщепления энтерокиназой; Invitrogen). Отобранные для экспрессии белков в клетках млекопитающих при осуществлении данного изобретения векторы включают pRc/CMV (Hind III, Bst XI, Not I, Sba I и Ара I - клонирующие сайты, селективный маркер G418; Invitrogen), pRc/RCV (Hind III, Spe I, Bst I, Xba I - клонирующие сайты, селективный маркер G418; Invitrogen) и др. Векторы экспрессии на основе вируса вакцины (Kaufman, 1991, см. выше) для осуществления настоящего изобретения включают (без ограничений указанными) pSC11 (Sma I -клонирующий сайт, ТК- и -gal селективные маркеры), рМ J601 (Sal I, Sma I, Alf I, Nar I, Bsp MII, Bam HI, Ара I, Nhe I, Sac II, Kpn I и Hind III - клонирующие сайты; ТК- и -gal селективные маркеры) и pTKgpt F1S (Eco RI, Pst I, Sal I, Acc I, Hind II, Sba I, Bam HI и Hpa - клонирующие сайты, селективные маркеры ТК или XPRT).

В соответствии с изобретением для экспрессии полипептида ОВ могут быть использованы дрожжевые системы. Например, вектор без слияния pYES2 (Xba I, Sph I, Not I, Gst XI, Eco RI, Bst XI, Bam HI, Sac I, Kpn I и Hind III -клонирующие сайты; Invitrogen) или вектор со слиянием pYESHis А, В, С (Xba I, Sph I, Sho I, Not I, Bst XI, Eco RI, Bam I, Sac I, Kpm I и Hind III - клонирующие сайты, N-концевой пептид для очистки на смоле ProBond и расщепление энтерокиназой; Invitrogen) или оба указанных вектора.

Следует отметить, что пептидные аналоги модулятора веса могут быть получены при использовании нуклеиновых последовательностей, входящих в объем настоящего изобретения.

Помимо рекомбинантной экспрессии полипептида ОВ настоящее изобретение относится к получению ОВ полипептида и его фрагментов с помощью хорошо известных и высокоразвитых методик твердофазного пептидного синтеза. При этом используются стратегии защитных групп Boc и Fmos, так же, как и другие. Различные методики «перекручивания» и окисления цистеиновых боковых цепей с образованием дисульфидной связи хорошо известны из уровня техники.

Антитела к полипептиду ОВ

В соответствии с изобретением полипептид ОВ полученный рекомбинантным путем или с помощью химического синтеза, его фрагменты, аналоги или другие производные, в том числе слитые белки, могут использоваться в качестве иммуногена для получения антител, распознающих ОВ полипептиз. Такие антитела включают (без ограничения указанными) поликлональные, моноклональные, химерные, одноцепочечные антитела, Fab-фрагменты и Fab-экспрессируюшие библиотеки.

Молекула является «антигенной», если она способна к специфическому взаимодействию с антиген-распознающей молекулой имунной системы, такой как иммуноглобулин (антитело) или Т-клеточный антигенный рецептор. Антигенный полипептид содержит по крайней мере около 5 и предпочтительно, по крайней мере, около 10 аминокислот. Антигенный участок молекулы может быть той областью, которая иммунодоминантна для антитела или Т-клеточного рецептора распознавания, или той областью, которая используется для генерации антител к молекуле путем соединения антигенного участка с молекулой-носителем для иммунизации. Антигенная молекула необязательно должна быть иммуногенной сама по себе, т.е. способной вызывать иммунный ответ без связывания с носителем.

«Антитело» представляет собой какой-либо иммуноглобулин, который связывается со специфическим эпитопом. Указанное понятие относится к поликлональным, моноклональным и химерным антителам (последние подробно описаны в Патентах США 4816397 и 4816567), а также к антигенсвязываюшим фрагментам антител, включая Fab, F(ab')2 и Fv (в том числе к одноцепочечным антителам). В соответствии с изложенным понятие «молекула антитела» относится здесь как к интактной иммуноглобулиновой молекуле, так и к иммунологически активной области молекулы иммуноглобулина, содержащий сайт связывание антитела. Сайт связывания антитела представляет собой структурный участок молекулы антитела, состоящий из вариабельных и гипервариабельных областей легких и тяжелых цепей, который специфически связывает антиген. Примерами иммуноглобулиновых молекул являются молекулы интактного иммуноглобулина, молекулы по существу интактного иммуноглобулина и участки молекул иммуноглобулина, содержащие паратоп, включая такие известные из уровня техники структуры, как Fab, Fab', F(ab'')2 и F(v), которые предпочтительным образом используются в терапевтических методах, описанных здесь.

Fab и F(ab')2 - участки молекул антител получают путем протеолитического расщепления папаином и пепсином соответственно практически интактных антител хорошо известными методами. См., например, Патент США №4342566, Theofilopolous et al. Fab'- участки антител также хорошо известны и образуются из F(ab')2 - участков после восстановления дисульфидных связей, соединяющих две области тяжелой цепи, меркаптоэтанолом и после алкилирования полученного меркаптанового белка с химическим реагентом, например, иодацетамидом. Предпочтительно использование интактных молекул антител.

Понятие «моноклональное антитело» означает антитело с антигенсвязывающей областью только одного типа, способное взаимодействовать с определенным антигеном. Таким образом, моноклональное антитело обычно проявляет определенную аффинность к какому-либо антигену, с которым оно взаимодействует. Моноклональное антитело может содержать более одного антигенсвязываюшего участка, каждый из которых иммуноспецифичен к определенному антигену (примером может служить биспецифическое (химерное) моноклональное антитело).

Понятие «адъювант» означает соединение или смесь соединений, которые усиливают иммунный ответ на антиген. Адъювант может служить тканевым депо, которое медленно высвобождает антиген, и активатором лимфоидной системы, неспецифически усиливающим иммунный ответ (Hood et al., in. Immunology, p.384, Second Ed., Benjamin/Cummings, Menlo Park, California (1984)). Часто праймирование одним антигеном без адъюванта может не обеспечить генерации гуморального или клеточного иммунного ответа. К адъювантам относятся (но не ограничиваются указанными) полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, сапонин, минеральные гели, например гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, например лизолетицин, полиолы фтора, полианионы, пептилы, масла или гидрокарбоновые эмульсии, гемоцианин моллюска фиссуреллы, динитрофенол и адъюванты на основе микобактерий, например BCG (бациллы Calmette-Guerin) и Corynebacterium parvum. Предпочтительно, чтобы адъювант был фармацевтически приемлемым.

Для получения поликлональных антител к ОВ полипептиду, его фрагменту, аналогу или производному используются различные хорошо известные методы. Для получения антител иммунизируют путем инъекции ОВ полипептида или его производного (например, фрагмента или белка слияния) различных животных, в том числе (без ограничений указанными) кроликов, мышей, крыс, овец, коз и т.д. В одном случае ОВ полипептид или фрагмент может быть конъюгирован с иммуногенным носителем, например бычьим сывороточным альбумином (BSA) или гемоцианином моллюска фиссуреллы (KLH). Для усиления иммунологического ответа в зависимости от животного-хозяина, могут быть использованы различные адъюванты, к которым относятся (без ограничений указанными) адъюванты Фрейнда, минеральные гели, например гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, например лизолецитин, полиолы фтора, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин моллюска фиссуреллы, динитрофенол и адъюванты на основе микобактерий, например, BCG (бациллы Calmette-Guerin) и Corynebacterium parvum.

Для получения моноклональных антител, направленных к ОВ полипептиду или производному, могут быть использованы любые методики, связанные с культивированием бессмертных клеточных линий. К указанным методикам относятся (без ограничений указанными) гибридомная технология, первоначально разработанная Kohler et al.), Nature, 256; 495-497 (1975), триомная технология, гибридомная технология на основе В-клеток человека (Kozbor et al., Immunology Today, 4: 72 (1983)) и гибридомная технология получения моноклональных антител человека на основе вируса Эпштейна-Барр (Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., (1985)). Бессмертные антителопродуцирующие клетки могут быть получены не только слиянием, а например, непосредственной трансформацией В-лимфоцитов онкогенной ДНК или трансфекцией вирусом Эпштейна-Барр. См., например, М. Schreier et al., «Hybridoma Techniques» (1980); Hammerling et al., «Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas» (1981); Kennet et al., «Monoclonal Antibodies» (1980); см. также патенты США №4451570; 4466917; 4472500; 4491632 и 4493890.

Кроме того, моноклональные антитела могут быть получены при использовании стерильных животных (недавно разработанная технология; PCT/US 90/02545). В соответствии с изобретением, могут быть использованы человеческие антитела, которые получают с помощью гибридом человека (Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2026-2030 (1983)) или в результате трансформации В-клеток человека вирусом Эпштейна-Барр in vitro (Cole et al., 1985, см. выше). В действительности, в соответствии с изобретением, может быть использована разработанная для получения «химерных антител» методика (Morrison et al., J. Bacteriol. 159-870 (1984); Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984); Takeda et al., Nature, 314: 452-454 (1985)). Она предусматривает сплайсинг генов антитела мыши, специфичного к ob полипептиду, совместно с генами антитела человека, обладающего нужным видом биологической активности. Такие антитела также включены в объем настоящего изобретения. Такие человеческие или «гуманизированные» химерные антитела предпочтительны для использования в целях терапии заболеваний человека или каких-либо нарушений (описанных выше), поскольку антитела человека или «гуманизированные» антитела в значительно меньшей степени, чем ксеногенные антитела вызывают аллергический иммунный ответ.

В соответствии с изобретением, методики, используемые для получения одноцепочечных антител (Патент США №4946778), могут быть применены для получения одноцепочечных антител, специфичных к ОВ-полипептиду. В дополнительном варианте осуществления изобретения могут быть использованы методики, применяемые для получения Fab-экспрессионных библиотек (Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989)), для быстрой и качественной идентификации моноклональных Fab-фрагментов заданной специфичности к ob полипептиду, а также их производных или аналогов.

С помощью известных методик могут быть получены фрагменты антител, содержащие идиотип молекулы антитела. Например, такие фрагменты включают (но не ограничиваются указанными) F(ab')2- фрагменты, которые получаются при расщеплении молекулы антитела пепсином; Fab'- фрагменты, которые могут быть получены путем восстановления дисульфидных мостиков F(ab')2- фрагмента, и Fab- фрагменты, которые могут быть получены путем обработки молекулы антитела папаином и восстанавливающим агентом.

При получении антител скрининг антител нужной специфичности может быть осуществлен с помощью какой-либо из известных методик, например путем радиоиммунологического анализа, ELISA (фермент-связанный иммуносорбентный анализ), «сэндвич»-иммуноанализа, иммунорадиометрического анализа, реакцией диффузной преципитации в геле, иммунодиффузионного анализа, иммуноанализа in situ (при использовании, например, коллоидного золота, ферментных или радиоизотопных меток), Вестерн-блоттинга, реакцией преципитации, агглютинационного анализа (например, анализа агглютинации в геле, гемагглютинационного анализа), реакции связывания комплемента, иммунофлуоресцентного анализа, анализа при использовании белка А, иммуноэлектрофоретического анализа и т.д. В одном случае, связывание антитела выявляют путем детекции метки на первом антителе. В другом случае первое антитело выявляют по связыванию со вторым антителом или каким-либо реагентом. Более того, можно связать с меткой второе антитело. Для выявления связывания в иммунологическом анализе известны многочисленные методики, которые включены в объем настоящего изобретения. Например, для отбора антител, распознающих специфический эпитоп на ОВ полипептиде, можно получить гибридомы к продукту, который связывается с фрагментом ОВ полипептида, содержащего данный эпитоп. Для селекции антитела, специфичного к ОВ полипептиду и полученного от определенного вида животного, можно использовать результаты положительного связывания с ОВ полипептидом, экспрессированным клетками того же самого вида животного или выделенным из данных клеток.

Описанные выше антитела могут быть использованы в способах, позволяющих выявить активность или установить локализацию ОВ полипептида, например, в Вестерн-блотгинге, исследовании ОВ полипептида in situ, определении его уровня в соответствующих биологических образцах и т.д. В специфическом варианте осуществления изобретения могут быть получены антитела, являющиеся агонистами или антагонистами ОВ активности. Такие антитела могут быть тестированы с помощью методов, описанных выше для идентификации лигандов.

В еще одном варианте изобретения антитела получают иммунизацией кроликов синтетическими пептидами с последовательностью, предсказанной на основе пептидного секвенирования, или рекомбинантными белками, полученными с помощью бактериальных векторов экспрессии. Выбор синтетических пептидов осуществляют после тщательного анализа предсказанной структуры белка, как описано выше. В частности, выбирают пептидные последовательности между возможными сайтами расщепления. Синтетические пептиды конъюгируют с носителем, таким как гемоцианин моллюска фиссуреллы (KLH) или БСА, посредством карбодиимида, и используют для иммунизации кроликов совместно с адъювантом Фрейнда. Для получения рекомбинантного белка для экспрессии полипептида может быть использован pGEX-вектор (Smith et al., 1988, см. выше). Альтернативно, для получения белка слияния можно использовать только гидрофильные домены. Экспрессированный белок получают в определенном количестве и используют для иммунизации кроликов в адъюванте Фрейнда.

В другом варианте осуществления изобретения рекомбинантный ОВ полипептид используют для иммунизации цыплят, и антитела к ОВ полипептиду выделяют из яичного желтка, например, аффинной очисткой на ОВ-колонке. Предпочтительно, чтобы цыплята, используемые для иммунизации, имели статус «свободных от специфических паразитов» (SPF).

В другом случае антитела к лептину получают в ob/ob мышах, которые утратили циркулирующий ОВ белок, и ожидается, что они способны к генерации антительного ответа на ОВ полипептид, поскольку не толерантны к нему, а также в мышах дикого типа. Клетки селезенки указанных животных сливают с клетками миеломы для получения гибридом и моноклональных антител.

Рекомбинантный ОВ полипептид может использоваться для иммунизации кроликов, и поликлональные антитела перед дальнейшим использованием очищают с помощью иммунологических методов иммунной очистки. Очищенные антитела особенно полезны для полуколичественного анализа, в частности для выявления наличия циркулирующего ОВ полипептида в сыворотке или плазме.

Панели моноклональных антител, полученных к модуляторным пептидам, могут быть скринированы на различные свойства, т.е. изотипические, эпитоп-специфические, аффинные и т.д. Особый интерес вызывают моноклональные антитела, которые нейтрализуют активность модуляторных пептидов. Такие антитела могут быть легко идентифицированы в исследованиях активности модуляторов веса. Высокоаффинные антитела также используются для иммуноаффинной очистки нативного или рекомбинантного модулятора.

Предпочтительно, чтобы антимодуляторное антитело, используемое в диагностических или терапевтических методах согласно настоящему изобретению, представляло собой аффинно-очищенное поликлональное антитело. Более предпочтительно, чтобы антитело было моноклональным (mAb). Кроме того, предпочтительно, чтобы молекулы антитела к модулятору использовались в виде Fab-, Fab'-,F(ab')2- или F(v) -фрагментов целых молекул антител.

Диагностическое применение

Настоящее изобретение относится также к различным формам диагностического применения, включая способы определения условий и/или стимулов, которые влияют на развитие нарушений веса тела или ожирения, путем определения их способности влиять на активность, опосредованную заявленными модуляторами веса. Как отмечалось ранее, пептидные модуляторы веса могут быть использованы для получения к ним антител с помощью различных известных методов, и такие антитела затем могут быть выделены и использованы в тестах по выявлению транскрипционной активности в ожидаемых клетках-мишенях. Альтернативно, полученные согласно настоящему изобретению нуклеиновые кислоты могут быть использованы в диагностике.

Диагностика, основанная на антителах

Как предполагалось выше, диагностический метод, заявленный согласно настоящему изобретению, включает анализ клеточного образца или среды в исследовании, подразумевающем использование эффективного количества антагониста модуляторного белка, такого как антимодуляторное антитело, предпочтительно, аффинно-очищенное поликлональное антитело и более предпочтительно mAb. Кроме того, предпочтительно, чтобы используемые антимодуляторные антительные молекулы представляли собой Fab, Fab', F(ab')2 или F(v)-фрагменты целых антительных молекул. Как обсуждалось выше, больные, по отношению к которым может быть успешно применен данный метод, страдают от рака, СПИДа, ожирения или других нарушений, когда отклоняющийся от нормы вес тела является характерным фактором. Способы выделения модулятора и индукции антимодуляторных антител для анализа клеток-мишеней хорошо известны из уровня техники. Кроме того, антитела (поликлональные и моноклональные) и лекарственные препараты, модулирующие образование или активность модуляторов контроля веса и других распознаваемых факторов и/или их субъединиц, могут использоваться в различных диагностических методах и, например, применяться для определения и/или оценки условий, когда развиваются нарушения веса тела или вероятна возможность их развития. Модуляторные пептиды или их активные фрагменты могут использоваться для получения к ним поликлональных и моноклональных антител в различных клеточных средах известными методами, такими как гибридомная технология на основе слияния лимфоцитов селезенки мыши и клеток миеломы. Эти методики детально описаны ниже. Подобно этому небольшие молекулы, которые имитируют или являются антагонистами активности распознаваемых рецептором факторов, полученных согласно данному изобретению, могут быть обнаружены или синтезированы и применены в диагностических и/или терапевтических методах. Присутствие модуляторов веса в клетках может быть определено с помощью обычных иммунологичных процедур, используемых для таких определений. Известно большое число указанных методик. Особенно целесообразно использовать три такие методики, в которых применяются фактор распознавания рецептором, меченный выявляемой меткой, антитело Ab1, меченное выявляемой меткой, или антитело Ab2, меченное выявляемой меткой. Методики могут быть суммарно представлены в виде нижеследующих уравнений, где звездочки указывают на метку, a «WM» означает модулятор веса:

a. WM*+Ab1= WM*Ab1

в. WM+Ab1*= WMAb1*

С. WM+Ab1+ Ab2*= Ab1WMAb2*

Используемые здесь методики и их применение аналогичны известным из уровня техники и соответственно могут быть использованы в объеме настоящего изобретения. «Конкурентная» методика, Методика А, описана в Патентах США №3654090 и 3850752. Методика В соответствует хорошо известному конкурентному анализу. Методика С, «сэндвич»-методика, описана в Патенте США RE 31006 и 4016043. Известны также другие подходы, такие как метод «двойных» антител («DASP»-методика).

В каждом случае модуляторы веса образуют комплексы с одним или более антителом или связывающими партнерами, при этом один из компонентов комплекса связан с выявляемой меткой. Образование комплекса и при необходимости его количество может быть установлено известными методами, предусматривающими выявление меток.

Как можно видеть из указанного выше, характерным свойством Ab2 является его способность взаимодействовать с Ab1. Это обусловлено тем, что Ab1, полученное от одного вида млекопитающих, использовалось как антиген по отношению к другому виду для получения Ab2. Например, Ab2 может быть получено от козы при использовании в качестве антигена кроличьих антител. Поэтому Ab2 является антителом козы, направленным против антител кролика. Для целей описания и формулы Ab1 может использоваться как первое антитело или антитело, направленное к модулятору веса, а Ab2 является вторым или анти- Ab1 антителом.

Метки, которые наиболее часто используются в указанных методах, являются радиоактивными элементами, ферментами, химическими веществами, которые флуоресцируют при экспозиции в ультрафиолетовом свете и т.д.

В качестве меток могут быть использованы известные флуоресцирующие соединения. К ним относятся, например, флуоресцеин, родамин и аирамин. Наиболее часто используются антикроличьи антитела козы, конъюгированные с флуоресцеином посредством изотиопианата.

Модуляторы веса или связывающие их реагенты могут также быть помечены радиоактивным элементом или ферментом. Радиоактивная метка может быть выявлена какой-либо количественной методикой. Изотоп может быть выбран из группы, включающей 3H, 14С, 32Р, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Со, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I и 186Re.

Могут использоваться также ферментные метки, которые выявляются колориметрическим, спектрофотометрическим, флуороспектрофотометрическим, амперометрическим или газометрическим способом. Фермент конъюгируют с выбранной молекулой посредством реакции со связывающими молекулами, такими как карбодиимиды, диизоцианаты, глутаральдегид и т.д. В указанной реакции могут быть использованы многие известные ферменты. Предпочтительно использовать пероксидазу, -глюкуронидазу, -D-глюкозидазу, -D-галактозидазу, уреазу, глюкозооксидазу в комплексе с пероксидазой и щелочную фосфатазу. Альтернативные меченые реагенты и способы описаны, например, в Патентах США 3654090, 3850752 и 4016043.

В другом варианте осуществления изобретения могут быть получены диагностические наборы для использования врачами с целью определения наличия или отсутствия предопределенной транскрипционной активности или предопределенной активности в ожидаемых клетках-мишенях. В соответствии с описанными выше методиками тестирования один тип наборов содержит по крайней мере меченный модулятор веса или связывающий его реагент, например, специфичное к нему антитело, и инструкции, которые зависят от выбранного метода, например «конкурентного», «сэндвичевого», «DASP» и т.д. Наборы могут также содержать дополнительные реагенты, например, буферы, стабилизаторы и т.д.

Соответственно может быть получен диагностический набор для обнаружения транскрипционной активности в клетках или способности клеток к предопределенной транскрипционной активности, который содержит:

(a) предопределенное количество по крайней мере одного меченного иммунохимически - реакционноспособного компонента, полученного путем непосредственно или опосредованного прикрепления модулятора веса тела или связывающего его специфического агента (партнера) к выявляемой метке;

(b) другие реагенты;

(c) инструкции по использования данного набора.

Диагностический набор может также содержать:

(a) известное количество модулятора веса, как описано выше (или связывающего реагента, партнера), связанного с твердой фазой с образованием иммуносорбента или, альтернативно, связанного с подходящей меткой, или многочисленные такие конечные продукты и т.д. (или их связывающие партнеры);

(b) если необходимо, другие реагенты;

(c) инструкции для использования указанного диагностического набора.

В еще одном варианте диагностический набор может быть получен и использован в указанных выше целях в соответствии с предписанной методикой (например, «конкурентной», «сэндвичевой», «двойных антител» и т.д.) и содержит:

(а) меченый компонент, который получен путем соединения модулятора веса с выявляемой меткой;

(b) один или более дополнительных иммунохимических реагентов, из которых по крайней мере один реагент представляет собой лиганд или иммобилизованый лиганд, причем лиганд выбран из группы, включающей:

(i) лиганд, способный связываться с меченым компонентом (а);

(ii) лиганд, способный связываться со связывающим партнером меченого компонента;

(in) лиганд, способный к связыванию по крайней мере с одним компонентом (компонентами) для того, чтобы быть выявленным;

(iv) лиганд, способный к связыванию по крайней мере с одним связывающим партнером по крайней мере одного из компонентов, чтобы быть выявленным,

и

(а) инструкции по использованию методики для определения и/или выявления одного или более компонентов иммунологической реакции между модулятором веса и его специфическим связывающим партнером.

Диагностика на основе нуклеиновых кислот

Как показано ниже в примерах, полученные согласно настоящему изобретению нуклеиновые кислоты могут быть использованы для выявления нарушений, ассоциированных с дефектами ОВ полипептида, которые приводят к фенотипическому ожирению. Например, пробы на основе нуклеиновых кислот (скажем, в Нозерн-блоттинге или RT-PCR-анализе) могут быть использованы для выявления, ассоциирован ли фенотип ожирения с утратой экспрессии мРНК ОВ, или экспрессией нефункциональной мРНК ОВ, например, как у db/db мышей (когда дефицит является следствием утраты OB рецептора) или когда мутации приводят к нетранскрибируемой мРНК. Более того, диагностические методики, заявленные согласно настоящему изобретению и основанные на использовании нуклеиновых кислот, могут быть использованы в комплексе с методиками, основанными на использовании антител, для лучшего понимания молекулярных механизмов развития фенотипов ожирения и анорексии.

Как описано здесь, кДНК-клоны, которые выделены недавно, секвенированы. Это позволяет определить полную последовательность гена человека (см. Фиг.20А-С; SEQ ID NO:22). Получены ДНК-последовательности интронов гена ОВ человека (Фиг.20), и они использовались для получения PCR-праймеров с целью амплификации кодирующей последовательности OS-гена, из геномной ДНК человека, так чтобы идентифицировать мутации или аллельные варианты гена ОВ. Все процедуры осуществлялись в соответствии с методиками, подробно описанными выше. Специфические PCR-праймеры для амплификации геномной ДНК ОВ человека описаны в соответствующем примере ниже.

Современная гипотеза заключается в том, что гетерозиготные мутации в гене ob могут быть ассоциированы со слабой/средней степенью ожирения, в то время как гомозиготные мутации могут быть ассоциированы с различными диагностическими тестами на ожирение, основанными на ДНК-последовательностях. Если это так, то можно будет выявлять людей с риском развития ожирения и применять лекарственные препараты и/или изменять образ жизни таких людей до того, как вес тела существенно увеличится.

Альтернативно, наличие микросателлитов, которые сегрегируют с мутантными формами гена OB человека, может быть полезным для постановки диагноза. Различные PCR-праймеры, включая и те, которые основаны на нуклеотидной последовательности, приведенной на Фиг.20А-С, могут быть также использованы в указанных целях.

Ген OB может быть также использован для определения кодируемой им РНК и белка при нарушениях питания. Очень важно знать при выявлении определенного случая таких нарушений, являются ли РНК OB и/или кодируемый ею белок нерегулируемыми или подвергнутыми нисходящими регуляции. Таким образом, если у человека с ожирением выявляются повышенные уровни OB, скорее всего, проблема заключается в снижающей регуляции OB. Когда же OB редуцируется, скорее всего неадекватно низкие уровни OB могут привести к ожирению (независимо от того, имеется ли дефект в OB гене). В противоположность указанному, если больной раком или СПИДом, потерявший вес, имеет повышенные уровни OB, можно заключить, что неадекватно высокая экспрессия OB ответственна за потерю веса.

Клонированная кДНК человека может использоваться для определения уровней РНК OB человека. Кроме того, рекомбинантный белок человека может быть получен и использован для иммунологического анализа с целью определения содержания жира и, возможно, уровней ОВ белка в плазме крови.

Терапевтическое применение

Полученные согласно изобретению полипептиды, нуклеиновые кислоты и антитела имеют значительный терапевтический потенциал. Предпочтительно, терапевтически эффективное количество такого агента применяется совместно с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.

Понятие «фармацевтически приемлемый» относится к соединениям и композициям, которые физиологически инертны и обычно не вызывают аллергических и сходных с ними нежелательных реакций, например нарушений деятельности желудка, головокружений и т.д. при введении человеку. Предпочтительно, используемое здесь понятие «фармацевтически приемлемый» соответствует тому, которое утверждено официальным агентством федерального правительства или правительства штата или приведено в Фармакопее США или другой официально зарегистрированной Фармакопее, с целью использования применительно к животным и, более предпочтительно, к человеку. Понятие «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, наполнителю или «переносчику», совместно с которым применяется нужное соединение. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масло, в том числе нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, например соевое масло, минеральное масло, сезамовое масло, арахисовое масло и т.д. Вода или растворители солевых растворов, водная декстроза и растворы глицерина предпочтительно используются как носители, в частности для инъецируемых растворов. Подходящие фармацевтические носители описаны Martin, Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, (1990).

Понятие «терапевтически эффективное количество», используемое здесь, означает количество, достаточное для снижения по крайней мере около 15%, предпочтительно по крайней мере 50%, более предпочтительно по крайней мере 90% и наиболее предпочтительно для предотвращения клинически значимого дефицита активности, функционирования и ответа в организме-хозяине. Альтернативно, терапевтически эффективное количество достаточно для улучшения клинически значимого состояния. Введение рекомбинантного ОВ полипептида приводит к потере веса, в частности, уменьшению жировой ткани. ОВ полипептид может быть получен с помощью стандартных бактериальных векторов экспрессии и/или векторов экспрессии в клетках млекопитающих, синтетическим путем или очищен из плазмы или сыворотки, как описано ниже. Альтернативно, увеличенная экспрессия нативного ОВ полипептида может быть индуцирована путем гомологичной рекомбинации, как описано выше.

Снижение активности ОВ полипептида (при использовании антагонистов, ингибиторов, нейтрализующих антител или антисмысловых молекул) должно приводить к увеличению веса, что может быть желательно для коррекции потери веса, ассоциированной с раком, СПИДом или нервозной анорексией. Модуляция ОВ активности может оказаться полезной для снижения веса тела (путем увеличения активности ОВ) или увеличения веса тела (путем уменьшения активности ОВ).

Терапевтическое применение, основанное на полипептидах

В простейшем случае ген ОВ определяет вес тела млекопитающих, в частности, человека и мыши. Продукт гена ОВ и соответственно родственные молекулы, по видимому, являются частью сигнального пути, посредством которого жировая ткань взаимодействует с мозгом и другими органами. Полагают, что полипептид ОВ представляет собой сигнальную молекулу, т.е. гормон.

Полипептид ОВ ген его функционально активный фрагмент или антагонист могут быть применены орально или парентерально, предпочтительно парентерально. Поскольку метаболический гомеостаз - это постоянный процесс, предпочтительно, чтобы контролировалось высвобождение соответствующего модулятора. Например, полипептид может быть применен путем внутривенной инфузии, имплантируемого осмотического насоса, с помощью липосом, трансдермальным путем или другим способом. В одном случае может быть использован насос (Langer et al., eds., Medical Application of Controlled Release, CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery, 88: 507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321: 575 (1989)). В другом случае могут быть использованы полимерные материалы (Langer, 1974, см. выше; Sefton, 1987, см. выше; Smolen et al., eds., Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Wiley, New York (1984); Ranger et al., Macromol. Sci Rev. Macromol. Chem., 23: 61 (1983); см. также Levy et al., Science, 228: 190 (1985); During et al., Ann Neurol., 25: 351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg, 71: 105 (1989)). Кроме того, контролирующая высвобождение препарата система может быть помещена в непосредственной близости от терапевтической мишени, т.е. мозга, так, чтобы регулировать только системную дозу (см., например, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2 pp. 115-138 (1984)). Другие контролирующие высвобождение системы обсуждаются в обзоре Langer, Science, 249: 1527-1533 (1990). В другом случае терапевтическое соединение может применяться в капсуле (везикуле), в частности, липосоме (см. Langer, 1990, выше; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopes-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, там же, pp. 317-327; см. там же). В еще одном варианте осуществления изобретения рекомбинантные клетки, которые трансформированы геном ОВ и экспрессируют высокие уровни полипептида, могут быть трансплантированы субъекту, который нуждается в ob полипептиде. Предпочтительно, трансплантируют аутологические клетки, которые трансформированы OB, для того чтобы избежать отторжения; альтернативно, методика может быть использована для экранирования неаутологических клеток, которые продуцируют растворимые факторы, с помощью полимерного матрикса, который предотвращает иммунное распознавание и отторжение.

Полипептид ОВ может быть применен внутривенным, внутриартериальным, интраперитонеальным, внутримышечным или подкожным путем. Альтернативно, OB полипептид, должным образом дозированный, может быть введен назальным или оральным путем. Постоянное поддержание ОВ может обеспечиваться за счет введения терапевтически эффективной дозы (т.е. дозы, эффективной для индуцирования у субъекта метаболических изменений) в необходимые интервалы времени, например ежедневно, каждые 12 ч и т.д. Эти параметры зависят от тяжести заболевания, которое подлежит лечению, других факторов, например модификаций применяемой диеты, веса больного, возраста, пола и т.д., что определяется в соответствии с обычной медицинской практикой специалистом в данной области.

Фармацевтические композиции

Еще один аспект изобретения относится к фармацевтическим композициям. Такие фармацевтические композиции могут быть введены путем инъекции, оральным путем, пульмонарным, назальным или каким-либо другим. В целом, обеспечиваемые изобретением фармацевтические композиции содержат эффективные количества белка или его производных, полученных согласно изобретению, в комплексе с фармацевтически приемлемыми разбавителями, консервантами, солюбилизаторами, эмульгаторами, адъювантами и/или носителями. Такие композиции включают разбавители на основе различных буферов (например, Трис-HCl, ацетатного, фосфатного), рН и ионной силы, добавки, такие как детергенты и солюбилизируюшие агенты (например, Твин 80, Полисорбат 80), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метабисульфат натрия), консерванты (например, Тимерсол, бензольный спирт) и наполнители (например, лактоза, маннитол). В отдельных случаях фармацевтические композиции включают в полимерные материалы, такие как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и т.д., или в липосомы. Может быть использована гиалуроновая кислота. Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость клиренса in vivo заявленных белков и их производных. См., например, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), стр. 1435-1712. Работа приведена здесь в качестве ссылки. Композиции могут быть приготовлены в жидкой форме, в виде сухого порошка, например, в лиофилизированной форме.

Оральное применение

Настоящее изобретение обеспечивает применение композиций, приготовленных в дозированной и расфасованной форме, оральным путем, который в целом описан в кн. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), глава 89, которая приведена здесь в качестве ссылки. Дозированные твердые формы включают таблетки, капсулы, пилюли, леденцы, гранулы, шарики и т.д. Кроме того, для расфасовки и дозировки композиции может быть применено протеиноидное или липосомальное инкапсулирование (например, в Патенте США №4925673 описаны протеиноидные микросферы). Может быть использовано липосомальное инкапсулирование, и липосомы конструируют с помощью различных полимеров(см., например, Патент США №5013556). Описание возможных твердых дозированных форм для терапевтического использования дано Marshall в кн. Modern Pharmaceutics, Chapter 10, Banker and Phodes ed., (1979); указанная книга приведена здесь в качестве ссылки. В целом, рецептура препарата может включать белок (или химически модифицированный белок) и инертные ингредиенты, которые защищают действующее начало препарата от воздействия микросреды желудка и обеспечивают высвобождение биологически активного материала тонком кишечнике.

При особом варианте осуществления изобретения получают дозированные формы описанных выше белковых производных для орального применения. Белок может быть химически модифицирован, так что оральное применение производного было эффективно. В целом, химическое модифицирование включает прикрепление по крайней мере одной группы к белковой или пептидной молекуле, когда указанная группа обеспечивает ингибирование протеолиза и поступление препарата в кровяное русло из желудка или кишечника. Кроме того, желательно, чтобы имели место повышенная стабильность белка и увеличенное время циркуляции в организме. Примеры таких групп включают полиэтиленгликоль, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и полипролин. Abuchowski et ai, 1981, см. выше; Newmark et al., J. Appl. Biochem., 4: 185-189 (1982). К другим полимерам, которые могут быть использованы, относятся поли-1,3-диоксолан и поли-1, 3, 6-тиоксокан. Как отмечалось выше, для терапевтического применения предпочтительно использование полиэтиленгликоля. Для белка (или его производного) областью высвобождения может быть желудок, тонкий кишечник (двенадцатиперстная кишка, тощая кишка, подвздошная кишка) или толстый кишечник. Специалист в данной области знаний может подобрать форму препарата, которая не будет растворяться в желудке, а препарат будет высвобождаться в двенадцатиперстной кишке или в другом отделе кишечника. Предпочтительно, чтобы высвобождение не сопровождалось нежелательными воздействиями микросреды желудка, что достигается защитой белка (или его производного) или обеспечением высвобождения биологически активного материала «за пределами» желудка, скажем, в тонком кишечнике.

Для обеспечения полной устойчивости к микросреде желудка необходимо наличие нерастворимого, по крайней мере при рН 5.0, покрытия. Примерами наиболее распространенных инертных ингредиентов, которые используются для энтерического покрытия, могут служить тримеллитат ацетата целлюлозы (CAT), фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМСР), НРМСР 50, НРМСР 55, фталат поливинилацетата (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, фталат ацетатцеллюлозы (CAP), Eudragit S и Shellac. Указанные покрытия могут быть использованы как смешанные пленки.

Покрытие или смесь покрытий могут быть использованы при изготовлении таблеток, которые не предназначены быть защищенными от воздействий среды желудка. Это могут быть сахарные покрытия или покрытия, обеспечивающие более легкое проглатывание. Капсулы могут иметь твердую оболочку (например, желатиновую) для доставки сухой формы препарата, т.е. порошка; в случае жидкой формы может быть использована мягкая желатиновая оболочка. Оболочка таблеток может состоять из густого крахмала или других «пищевых» материалов. Для пилюлей, леденцов, формованных таблеток или порошков могут быть применены «увлажняющие» технологии.

Терапевтические препараты могут быть включены в расфасовку в форме гранул или пилюлей с размером частицы около 1 мм. Препарат для введения с помощью капсул может быть использован в виде порошка, слабо спрессованных тампонов. Лекарство может быть получено прессованием. В состав лекарственных форм могут быть включены цветовые, вкусовые и обеспечивающие различный запах добавки. Например, белок (или его производное) может быть расфасован (например, в составе липосом или путем включения в микросферы) и затем введен в состав пищевого продукта, скажем, охлаждающего напитка, содержащего носители цвета, запаха и вкуса. Можно увеличить или уменьшить объем вводимого препарата с помощью инертного материала. Такие разбавители могут содержать углеводы, особенно маннитол, -лактозу, безводную лактозу, сахарозу, модифицированные декстраны и крахмал. В качестве наполнителей могут быть включены некоторые неорганические соли, включая трифосфат кальция, карбонат магния и хлорид натрия. Известны коммерческие растворители, такие как Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress и Avicell.

В препараты, дозированные в твердой форме, могут быть включены дезинтеграторы. В качестве дезинтеграторов могут быть использованы (без ограничений указанными) крахмал, в том числе коммерческий дезинтегратор на основе крахмала, Explotab, а также натриевый гликолат крахмала, Амберлит, натриевая карбоксиметилцеллюлоза, ультрамилопектин, натриевый альгинат, желатин, апельсиновая кожура, кислая карбоксилметилцеллюлоза, природная губка и бентонит. К дезинтеграторам также относятся нерастворимые катионообменные смолы. Порошкообразные клейкие вещества могут применяться в качестве дезинтеграторов и связующих соединений, к которым относятся агар, карайя и трагакан. Альгининовая кислота и ее соль также могут быть использованы как дезинтеграторы. Связывающие соединения могут быть использованы для комплектования терапевтического агента в форме твердой таблетки и включают в себя материалы, полученные из природных продуктов, таких как трагакан, крахмал и желатин. К другим связывающим компонентам относятся метилцеллюлоза (МС), этилцеллюлоза (ЭС) и карбоксиметилцеллюлоза (CMC). Для гранулирования терапевтических препаратов могут использоваться спиртовые растворы поливинилпирролидона (PVP) и гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМС).

Для предотвращения разрушения терапевтического препарата в процессе формовки в его состав могут быть включены соединения, препятствующие трению. В составе слоя между терапевтическим началом и инертной оболочкой могут быть использованы любриканты, которые включают (без ограничений указанными) стеариновую кислоту, в том числе ее кальциевую и магниевую соль, политетрафторэтилен (PTFE), жидкий парафин, растительные масла и воска. Могут использоваться и растворимые любриканты, такие как лаурилсульфат натрия, лаурилсульфат магния, полиэтиленгликоль различной мол. массы и Carbowax 4000 и 6000.

Для улучшения текучести лекарственного препарата в процессе фасовки и с целью облегчения компрессии используются специальные соединения. К ним относятся крахмал, тальк, пирогенный кремнезем и гидратиторованный силикоалюминат.

Для обеспечения растворимости терапевтического препарата в водной среде в качестве «увлажняющего» агента могут быть использованы сурфактанты. К сурфактантам относятся анионные детергенты, такие как лаурисульфат натрия, диоктилсульфосукцинат натрия и диоктил сульфонат натрия, и катионные детергенты, такие, как хлорид бензалкония или хлорид бензетолия. Перечень возможных неионных детергентов, которые могут входить в состав терапевтического препарата в качестве сурфактантов, включает лауромакрогол 400, стеарат полиоксила 40, гидрогенированное полиоксиэтиленовое касторовое масло 10, 50 и 60, глицерол моностеарат, полисорбат 40, 60, 65 и 80, эфир жирной кислоты сахарозы, метилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу. Указанные сурфактанты могут быть включены в состав препарата на основе белка или его производного как по отдельности, так и в смеси в различных соотношениях.

Для облегчения захвата белка (или его производного) могут быть использованы добавки, например жирные кислоты, в частности, олеиновая, линолиновая.

Желательно контролировать высвобождение препарата. Лекарственный препарат может быть включен в инертный матрикс, который обеспечивает высвобождение за счет механизмов диффузии и выщелачивания, т.е. смолу. В препарат могут быть включены медленно распадающиеся матрицы. Другая форма контролируемого высвобождения терапевтического средства основана на терапевтической системе Oros (Alza Corp.)., т.е. лекарство заключают в полупроницаемую мембрану, которая позволяет воде поступать внутрь и «выдавливать» лекарство через определенное небольшое отверстие, образовавшееся за счет осмотических эффектов. Некоторые энтерические покрытия также обеспечивают эффект высвобождения. В процессе получения готовой формы препарата могут быть использованы и другие покрытия. К ним относятся различные сахара, которые могут быть приготовлены в специальной форме. Терапевтическое лекарство можно применять в виде покрытой пленкой таблетки; материалы, используемые в этом случае, подразделяются на две группы. К первой относятся неэнергетические материалы, которые включают метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, метилгидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, натриевую карбоксиметилцеллюлозу, провидон и полиэтиленгликоли. Вторая группа включает энтерические материалы, к которым относятся широко известные эфиры фталевой кислоты.

Для обеспечения оптимальной покрывающей пленки может быть использована смесь материалов. Такая пленка может быть получена с помощью специальной формы, в виде сжатой или жидкостной оболочки.

Легочное применение

Изобретение обеспечивает легочное применение заявленного белка (или его производных). Белок (или его производное) проникает в легкие млекопитающих при вдыхании и прохождении легочного эпителия, выстилающего кровоток. Этой проблеме посвящены многие работы. Например, Adjei et al., Pharmaceutical Research, 7(6): 565-569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics, 63: 135-144 (1990) (ацетат леупролида); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (suppl. 5): 143-146 (1989) (эндотелин-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine, 3(3): 206-212 (1989) (1-антитрипсин); Smith et al., J. Clin. Invest., 84: 1145-1146 (1989) (1-протеиназа); Oswein et al., «Аэрозолирование белков». Достижение второго симпозиума по применению лекарств через легкие. Keystone, Colorado, (March 1990) (рекомбинантный гормон роста человека); Debs et al., J. Immunol., 140: 3482-3488 (1988) and Platz et al., Патент США №5284656 (гранулоцитатный колониестимулирующий фактор). В объем настоящего изобретения включены различные механические устройства для легочного применения терапевтических продуктов, включая распылители, приборы со счетчиками вдыхаемых доз, приборы для вдыхания порошкообразных препаратов, которые сходны с известными из уровня техники. Некоторые коммерчески доступные приборы, подходящие для практического осуществления изобретения, включают распылитель Ultravent, произведенный Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; распылитель Acorn II произведенный Marquest Medical Product, Englewood, Colorado; прибор со счетчиком вдыхаемых доз, произведенный Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Colorado и прибор для вдыхания порошкообразных препаратов, произведенный Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Все подобные устройства требуют использования определенных типов препаратов, подходящих для введения белка (или его производного). Обычно каждый тип препарата соответствует используемому устройству и может включать подходящий «выталкивающий» материал в дополнение к обычным разбавителям, адъювантам и/или носителям, применяемым в терапии. Кроме того, возможно использование липосом, микрокапсул или микросфер, комплексов включения или других типов носителей. В зависимости от способа химической модификации или вида устройства химически модифицированный белок может быть приготовлен в различной фармакологической форме.

Фармакологические формы для использования в распылителе, как струйном, так и ультразвуковом, обычно включают белок (или его производное), растворенный в воде в концентрации 0.1-25 мг биологически активного белка в 1 мл раствора. Фармакологическая форма может также включать буфер и простой сахар (например, для стабилизации белка и регуляции осмотического давления), а для использования в распылителе также сурфактант с целью уменьшения или предотвращения индуцированной поверхностной агрегации белка, вызываемой атомизацией раствора при образовании аэрозоли.

Фармакологические формы для использования в приборах со счетчиком вдыхаемых доз в принципе содержат дозированный порошок, включающий белок (или его производное), суспендированный в «выталкивающем» материале с добавлением сурфактанта. «Выталкивающий» материал в принципе может быть любым подходящим для этой цели, таким как хлорфторуглерод, гидрохлорфторуглерод, гидрофторкарбон или гидроуглерод, в том числе трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол и 1, 1, 1, 2-тетрафторэтан или их комбинации. К подходящим сурфактантам относятся сорбитан триолеат и соевый лецитин. Может быть использована в качестве сурфактанта и олеиновая кислота.

Фармакологические формы для распределения из устройства для вдыхания порошка содержат дозированный сухой порошок, включающий белок (или его производное), и могут содержать наполняющий агент, такой как лактоза, сорбитол, сахароза или маннитол в количествах, обеспечивающих выбрасывание порошка из устройства, например, 50-90% (по весу) от общего веса препарата. Наиболее предпочтительно, чтобы белок (или его производное) был приготовлен в форме частиц со средними размерами менее 10 мкм (микрон), наиболее предпочтительно, 0.5-5 мкм для наиболее эффективной «доставки» в дистальные отделы легких.

Назальное применение

Назальное применение белка (или его производного) также охватывается настоящим изобретением. Назальное применение обеспечивает проникновение белка в кровоток непосредственно после введения терапевтического продукта в нос без необходимости депонирования продукта в легких. Фармакологические формы для назальной доставки препарата включают такие, которые содержат декстран или циклодекстран.

Способы лечения, способы получения медикамента

Еще один аспект изобретения относится к способам лечения и получению медикамента. Состояния, модулируемые или облегчаемые введением заявленных соединений, указаны выше.

Дозирование

Для всех указанных выше молекул приведенную информацию следует рассматривать с учетом соответствующих доз для лечения различных состояний у разного рода больных, и специалист в данной области знаний в зависимости от медицинских показаний, возраста и состояния здоровья больного способен подобрать нужную дозу. В целом для инъекции или инфузии доза составляет 0.01 мкг - 10 мг биологически активного белка по отношению к 1 кг веса тела (расчет производится на массу белка как такового без химической модификации). Доза может варьировать в зависимости от времени полужизни в циркулирующем кровотоке белка или его производного, вводится ли полипептид однократной дозой или постоянной инфузией, а также от фармакологической дозы.

Применение с другими соединениями

Для терапии ожирения заявленный белок (или его производное) может быть применен в комплексе с одной или более фармацевтическими препаратами, используемыми для лечения других клинических нарушений, сопровождающих ожирение, такими как применяемыми для лечения диабета (инсулин), высокого кровяного давления, повышенного уровня холестерина и других неблагоприятных состояний, связанных с ожирением. Кроме того, могут быть применены препараты, подавляющие аппетит, т.е. амфетамины. Применение может быть одновременным (например, введение смеси заявленного белка и инсулина) или может быть in seriatim.

Лечение, основанное на нуклеиновых кислотах

Ген ОВ может быть введен в жировые клетки человека при генной терапии ожирения. Такая терапия, как ожидается, направлена на уменьшение веса тела. В противоположность этому, введение антисмысловых конструкций в жировые клетки человека должно уменьшать уровень активного ОВ полипептида и увеличивать степень ожирения.

В одном случае ген, кодирующий ОВ полипептид, вводят in vivo в вирусный вектор. Такие векторы включают аттенуированые или дефектные ДНК-вирусы, такие как (но без ограничений указанными) вирус простого герпеса (HSV), папилломавирус, вирус Эпштейна Барр (EBV), аденовирус, аденоассоциированный вирус (AAV) и подобные им. Дефектные вирусы, которые полностью или практически утратили вирусные гены, предпочтительны. Дефектные вирусы не инфекционны после введения в клетку. Использование дефектных вирусов сопровождается их введением в специфическую, особую зону клетки, при этом вирус не инфицирует другие клетки. Жировая ткань представляет собой особую мишень. Примерами определенных векторов могут служить (без ограничений указанными) вектор на основе дефектного герпесвируса 1 (HSV1) (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci., 1: 320-330 (1991)), аттенуированный аденовирусный вектор, такой, как вектор, описанный Stratford- Perricaudet et al., J. Clin. Invest., 90: 626-630 (1992) и вектор на основе дефектного аденоассоциированного вируса (Samulski et al., J. Virol., 61: 3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol., 63: 3822-3828 (1989)).

В другом случае ген может быть встроен в ретровирусный вектор, например, такой, как описан Andersen et al., Патент США N 5399346; Mann et al., Cell, 33: 153 (1983); Temin et al., Патент США №4650764; Temin et al., Патент США №4980289; Markowitz et al., J. Virol., 62: 1120 (1988); Temin et al., Патент США №5124263; Международная опубликованная заявка №95/07358 от 16 марта 1995 г, Dougherty et al., и Kuo et al., Blood, 82: 845 (1993).

Альтернативно, вектор может быть введен in vivo путем липофекции. За последнее десятилетие возросло использование липосом для инкапсулирования и трансферами нуклеиновых кислот in vitro. Для коррекции трудностей и опасностей, связанных с опосредованной липосомами трансфекции клеток, разработаны синтетические катионные липиды для получения липосом с целью трансфекции in vivo гена, кодирующего маркер (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84: 7413-7417 (1987); см. Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 8027-8031 (1988)). Использование катионных липидов может обеспечить инкапсулирование отрицательно заряженных нуклеиновых кислот и слияние с отрицательно заряженными клеточными мембранами (Felgner et al; Science, 337-388 (1989)). Применение липофекции для введения экзогенных генов в специфические органы in vivo имеет различные преимущества. Молекулярное нацеливание липосом на специфические клетки - одно из них. Очевидно, что направленная трансфекция определенной клетки чрезвычайно важна в случае ткани с гетерозиготной клеточной популяцией, такой как поджелудочная железа, печень, почка и мозг. Для обеспечения нацеливания липиды могут быть химически связаны с другими молекулами (см. Mackey et al., 1988, выше). Нацеливаемые пептиды, например гормоны или нейромедиаторы, белки, например антитела, или непептидные молекулы, могут быть соединены с липосомами химическим путем.

Кроме того, возможно введение вектора in vivo как «обнаженной» плазмидной ДНК. «Обнаженные» ДНК-векторы для генной терапии могут быть введены в заданные клетки-хозяева известными способами, например трансфекцией, электропорацией, микроинъекцией, трансдукцией, путем слияния клеток, с помощью DEAE-декстрана, кальций-фосфатной преципитацией, при использовании генного ружья или транспортерного ДНК-вектора (см., например, Wu et al., J. Biol. Chem., 267: 963-967 (1992);, Wu et al., J. Biol. Chem., 267: 14621-14624 (1988); Hartmut et al., заявка на патент Канады №2 012 311, поданная 15 марта 1990).

Использование в сельском хозяйстве

Ген ОВ может быть выделен из клеток домашних животных с последующим получением соответствующего полипептида ОВ. В особом случае (см. ниже) проба, сконструированная на основе гена ОВ мыши, гибридизуется с соответствующими гомологичными кодирующими последовательностями большого числа видов животных. Как обсуждалось выше при описании способов лечения людей, могут быть получены также рекомбинантные белки, которые могут быть применены по отношению к домашним животным. Введение полипептида может способствовать получению линейных мясных животных, например коров, овец, свиней, домашней птицы и т.д. Предпочтительно использование аналогов ОВ полипептида, несмотря на то, что изобретение обеспечивает применение анти-аналогов полипептида. Поскольку ОВ полипептид содержит примерно 160 аминокислотных остатков, он не может быть высокоиммуногенен. Таким образом, введение неаутологичного полипептида может не обеспечивать иммунного ответа.

Альтернативно, введение клонированных генов в трансгенные домашние животные способно обеспечить потенциальное уменьшение веса тела и ожирения за счет сверхэкспрессии ОВ трансгена. Простейший способ достижения указанного заключается в нацеливании ОВ трансгена в жировую ткань с помощью собственного или другого, специфичного для жировой ткани, промотора.

В противоположность указанному, в других случаях может оказаться желательным увеличение веса жировой ткани, например, при получении мяса (Kobe beef) или жирной печенки для специальных блюд (foie gras). Это может достигаться нацеливанием антисмыслового ОВ трансгена в жировую ткань или при использовании генной «нокаутирующей» методики. Альтернативно, когда необходимо увеличить процент жировой ткани по отношению к общему весу тела, может использоваться ингибитор или антагонист ОВ полипептида. Такие антагонисты или ингибиторы включают (без ограничений указанными) антитела, взаимодействующие с полипептидом и фрагментами полипептипа, которые связывают, но не активируют ОВ рецептор, т.е. антагонисты ОВ полипептида.

Косметическое использование

ОВ полипептид имеет существенное значение для использования в косметических целях помимо здравоохранения. В частности, поскольку полученные согласно изобретению полипептиды О В, включая их производные и агонисты-аналоги, используются для модулирования количества и качества жировых отложений у животных, они могут быть успешно использованы для уменьшения неприглядных отложений жировой ткани у человека, например, в области живота, бедер, шеи, подбородка, которые не считаются ожирением в полном смысле этого слова, но тем не менее ухудшают внешний вид индивидуума. Считается, что уменьшение количества жировой ткани может быть достигнуто, в частности, снижением аппетита, т.е. уменьшением количества потребляемой пищи или увеличением общего метаболизма, а также и тем, и другим. Таким образом, ОВ полипептид, его производные или агонисты могут быть введены индивидууму для обеспечения косметических изменений в отложениях жировой ткани как за счет модулирования жировых депо или снижения аппетита, так за счет того и другого. Кроме того, заявленные композиции и способы могут быть использованы в сочетании с различными процедурами, такими как пластическая хирургия, улучшающая внешний вид тела (например, липосакция или лазерная хирургия для уменьшений массы тела за счет отсасывания или удаления жировой ткани), физические упражнения (особенно бег и специальные тренировки), низкожировая диета, гипноз, биологические методы и т.д., которые могут быть применены каждым, кто захочет попытаться уменьшить процент жировой ткани и улучшить свой внешний вид.

В соответствии с указанным изобретение относится к способу эффективной косметической модуляции жировой ткани у индивидуума, включающему применение модулирующего количества полипептида ОВ или его агониста-аналога или производного по отношению к индивидууму, который хочет улучшить внешний вид своего тела за счет косметической модуляции жировой ткани. В частности, модуляция жировой ткани является следствием подавления аппетита. Предпочтительно, модуляция жировой ткани заключается в ее редукции.

С другой стороны, изобретение относится к способу обеспечения эффективной косметической потери жировой ткани, включающему процедуру изменения внешнего вида тела и применение модулирующего жировую ткань количества ОВ полипептида или его производного или агониста-аналога по отношению к индивидууму, который желает улучшить внешний вид тела за счет косметической модуляции жировой ткани.

ОВ рецептор

Изучение небольших молекул агонистов и антагонистов ОВ фактора может быть существенно ускорено выделением соответствующего рецептора. Это может быть достигнуто путем получения активного ОВ полипептида и его использования для скрининга экспрессионной библиотеки в соответствии со стандартной методикой. Связывание рецептора в экспрессионной библиотеке может быть тестировано применением рекомбинантного полипептида, полученного бактериальных или иных векторов экспрессии, и учетом его эффектов за короткое время и при постоянном использовании по отношению к клеткам экспрессионной библиотеки или же непосредственным определением связывания ОВ полипептида в клетках.

Как считается в настоящее время, ОВ рецептор по-видимому, локализован в гипоталамусе и, возможно, в печени. КДНК-библиотеки из этих тканей могут быть получены в обычных экспрессионных клонирующих векторах. Такие кДНК-клоны могут быть введены в COS-клетки и полученные трансформанты скринированы с помощью активного лиганда для идентификации COS-клеток, экспрессируюших ОВ рецептор. Положительные клоны изолируют для выделения клонированного рецептора. Клонированный рецептор затем может быть использован в комплексе с ОВ-лигандом (предположительно гормоном) для получения необходимых компонентов с целью скрининга небольших молекул модуляторов ОВ. Система анализа, которая может быть использована в соответствии с настоящим изобретением, известна как методика исследования рецептора. В этом случае материал для исследования подходящим образом метят и затем определенные клеточные колонии инокулируют заданным количеством меченого и немеченого материала и после этого определяют количество меченого материала, связавшегося с клеточными рецепторами. В эксперименте определяют разницу в аффинности между меченым и немеченым материалом.

Соответственно определенное количество очищенного модулятора веса может быть радиактивно-меченно и соединено, например, с антителами или другими ингибиторами, а затем осуществлены исследования по связыванию. Приготавливают среды с различным количеством меченого и немеченого свободного модулятора веса, в которые помещают клеточные образцы с последующей инкубацией. Полученный клеточный монослой отмывают, солюбилизируют и просчитывают в -счетчике в течение времени, необходимого для получения стандартного отклонения <5%. Данные затем анализируют по методу Скэтчарда и обобщают наблюдения и заключения в соответствии с активностью материала. Все вышесказанное является примером и иллюстрацией методики осуществления исследования рецептора, в частности, когда клеточная связываюшая активность исследуемого материала может служить дифференцирующим свойством. В свою очередь, исследование рецептора может быть особенно полезно при идентификации специфических рецепторов заявленных модуляторов, таких как db рецептор.

Еще один метод исследования, обеспечиваемый заявленным изобретением, известен как «цис/транс»-анализ. Коротко говоря, в нем используются две генетические конструкции, одна из которых обычно является плазмидой, постоянно экспрессирующей представляющий интерес рецептор при трансфекции в подходящую клеточную линию, а вторая является плазмидой, которая экспрессирует маркер, такой как люциферазу, под контролем комплекса рецептор/лиганд. Таким образом, например, если необходимо исследовать соединения на способность быть лигандом определенного рецептора, одну из плазмид конструируют таким образом, что она экспрессирует рецептор в выбранной клеточной линии, в то время как вторая плазмида будет содержать промотор, связанный с геном люцеферазы, в который встроен ген, кодирующий элемент, возможно, реагирующий на рецептор. Если тестируемое соединение является агонистом рецептора, лиганд будет связываться в комплекс с рецептором, и полученный комплекс будет присоединять реагирующий элемент и инициировать транскрипцию люциферазного гена. Затем хемилюминесценцию выявляют фотометрически и строят кривую зависимости «доза-ответ» и сравнивают ее с таковой для известных лигандов. Приведенная методика детально описана в Патенте США №4981784 и международной заявке РСТ № WO 88/03168, к которой может обратиться любой специалист.

После идентификации рекомбинантов, экспрессирующих последовательность гена ОВ рецептора, можно проанализировать ОВ рецептор. Это обеспечивается исследованием, основанным на физических или функциональных свойствах ОВ рецептора, в том числе радиоактивным мечением рецептора с последующим гель-электрофорезом, иммуноанализом, связыванием лиганда и т.д. Более того, могут быть получены антитела к ob рецептору.

Структура ОВ рецептора может быть проанализирована различными методами, известными из уровня развития техники. Предпочтительно определить структуру различных доменов, в особенности ОВ связывающего участка. Структурный анализ может быть осуществлен путем определения сходства последовательности с другими известными белковыми последовательностями, в частности гормонов и белковых рецепторов. Степень сходства (гомологии) может служить основанием для предсказания структуры и функции ОВ рецептора или его домена. В особом случае сравнение последовательностей может осуществляться при анализе последовательностей из банка генов, например, при использовании программ FASTA и FASTP (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 2444-48 (1988)).

Белковая последовательность может быть далее охарактеризована путем исследования гидрофильности (см., например, Норр et al., 1981, выше). Профиль гидрофильности может быть использован для идентификации гидрофобных и гидрофильных участков белка ОВ рецептора, что позволит в свою очередь выявить экстрацитоплазматические, мембраносвязывающие и внутрицитоплазматические области.

Может быть осуществлен анализ вторичной структуры (см., например, Chou et al., 1974, выше) для идентификации участков ОВ рецептора, обладающих специфической вторичной структурой.

Могут быть использованы различные известные компьютерные программы для предсказания вторичной структуры, открытия рамок считывания, механизмов трансляции, действия, строения и т.д.

При обеспечении источника рекомбинантного ОВ полипептида и выделении ОВ рецептора (т.е. продукта гена db) настоящее изобретение позволяет выявить структурное детерминирование активной конформации OB полипептида и ОВ рецептора или их доменов. В частности, доступно достаточное количество материала для ядерного магнитного резонанса (NMR), инфракрасного (IR), Рамановского и ультрафиолетового (UV), особенно основанного на круговом дихроизме (CD) спектроскопического анализа. В частности, NMR обеспечивает очень точный структурный анализ молекул в растворе, который максимальным образом соответствует их природному окружению (Marion et al., 1983, выше; Bar et al., 1985, выше; Kimura et al., 1983, выше;). Другие методы структурного анализа также могут быть использованы. К ним относятся, в частности (без ограничений указанными), рентгеновская кристаллография (Engstom, 1974, выше).

Более предпочтительно, могут быть изучены совместные кристаллы ОВ полипептида и ОВ рецептора. Анализ совместных кристаллов позволяет получить детальную информацию о связывании, которая, в свою очередь, служит для построения модели агонистов и антагонистов лиганда. Может быть использовано также компьютерное моделирование, особенно в сочетании с NMR или рентгеновской кристаллографией (Fletlerick et al., eds., Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1986)).

Идентификация и выделение гена, кодирующего ОВ рецептор согласно изобретению, обеспечивает экспрессию рецептора в больших количествах, чем он может быть выделен из природных источников, и кроме того, его экспрессию в индикаторных клетках, которые специально приспособлены для выявления активности рецептора после трансфекции или трансформации клеток. Соответственно в дополнение к выявлению строения агонистов и антагонистов на основе структуры ОВ полипептида изобретение обеспечивает альтернативный способ идентификации специфических лигандов ОВ рецептора с помощью различных методов скрининга, известных из уровня техники.

Изобретение может быть лучше понято с помощью представленных ниже Примеров, которые приведены здесь для его иллюстрации, а не с целью ограничения.

ПРИМЕРЫ

Ниже описывается способ, используемый для идентификации генетического материала, который является объектом изобретения. Он включает четыре последовательные стадии; А) Генетическое картирование, В) Физическое картирование, С) Выделение генов кандидатов и D) Выявление мутаций. Принимая во внимание, что был выделен ген мыши (стадия D), был выявлен и гомологический ген человека, и оба гена и возможные белки были охарактеризованы. Стадии более детально описаны ниже.

А. Генетическое картирование

Мутация ob была сегрегирована в генетических скрещиваниях, и для определения положения мутации, связанной с RFLPs (полиморфизм длины рестрикционного фрагмента), был использован стандартный анализ связи. Данные позволили поместить ОВ ген в примерно 5сМ - интервале на проксимальном участке хромосомы 6 мыши (5сМ - это величина генетического расстояния, соответствующего 5 явным генетическим кроссоверам (возникающим в результате кроссинговера) на 100 животных. Для генетического картирования использовали данные о 771 информатированном мейозе, которые были получены Friedman et al., (1991, см. выше). Генетический локус, который был картирован в отношении ОВ, описан ранее. Два наиболее близких описанных RELPs были идентифицированы с помощью проб, полученных на основе онкогенов карбоксипептидазы и met.

Генетическое разрещение описанных выше экспериментов было неадекватно клону ob, в основном, потому, что ни один из генетических маркеров не находился с ним в тесной связи. Для идентификации тесно связанных RELPs были выделены дополнительные пробы и генетические скрещивания расширены. Для выделения случайных участков ДНК из проксимальной области хромосомы 6 мыши был использован способ, известный как хромосомная микродиссекция (Bahary et al., Mammalian Genome, 4: 511-515 (1993)). Индивидуальные клонированные пробы были тестированы на тесную связь с ob. На основе указанных экспериментов была отобрана проба D6Rck 13, также обозначенная psd 3, и использована для дальнейшего анализа благодаря генетической близости к OB.

Данная проба была использована для генотипирования потомков ob 835 от межспецифического и межсубспецифического скрещиваний, которое показало, что D6Rck 13 нерекомбинантна у всех 835 животных, как сообщалось Bahary et al. В случае физического картирования новый полиморфный маркер был идентифицирован из космидного субклона, происходящего из YAC 53A6. Этот новый маркер был расположен между D6Rck 13 и геном OB и использован для генотипирования дополнительного 771 информативного мейоза в межспецифическом скрещивании и обратном скрещивании. Одно животное, #167, было идентифицировано как несущее рекомбинантный кроссовер между ob и D6Rck 39. Указанные исследования показывают, что D6Rck 39/ D6Rck 13 находится в положении около 0.06 сМ от ob. Дополнительная проба Pax 4 была идентифицирована на расстоянии 0.12 сМ проксимально ob. Pax 4 была рекомбинантной у двух животных, #111 и #420. Pax 4 - это псевдоген, который предварительно картирован на проксимальном участке хромосомы 6 мыши Gruss с соавторами (Gruss et al., Genomics, 11: 424-434 (1991)). Основываясь на этом, было показано, что OB ген находится примерно в 0.2 сМ интервале между Pax 4 и D6Rck 13. Это привело к попыткам клонировать межпозиционную ДНК для выделения OB.

В. Физическое картирование

Клонирование ДНК в этом интервале подразумевает использование искусственных хромосом дрожжей (YACs) и относительно нового клонирующего вектора, позволяющего клонировать последовательности смежной ДНК длиною более чем один миллион пар оснований.

Искусственные хромосомы дрожжей были выделены при использовании D6Rck 13 и Pax 4. Получали очищенные ДНК-пробы и применяли их для выделения соответствующих YACs. Эти YACs (#8, #16, #107, и #24) были выделены и подробно охарактеризованы, и на основании полученных данных был сделан вывод о том, что YAC 16 представляет собой YAC, который простирается более дистально, т.е. максимально приближен к ob. Затем был получен ключевой конец YAC #16, и было показано, что он ближе к ob, чем Pax 4. Данный конец обозначен 16М (+). Такое заключение было сделано на том основании, что данная проба не была рекомбинантной у животного #420 (как Pax 4). Конец был секвенирован и использован в PCR-анализе. PCR-анализ использовали для скрининга YAC-библиотеки. Было выделено четыре положительных клона. Последующая характеризация указанных YACs путем спасения концов, рестрикционного картирования, пульсового гель-электрофореза и Саузерн-блоттинга совместно с генетическими скрещиваниями показали, что два из указанных YACs, adu и aad, наиболее важны для последующих исследований. YAC aad представляет собой 550 kb нехимерную YAC, которая простирается наиболее дистально. Поэтому дистальный конец этой YAC, aad (pICL) используется для полного физического картирования. YAC adu представляет собой 370 kb нехимерную YAC и ее дистальный конец, adu (+) является нерекомбинантным у всего ob потомства при генетических скрещиваниях, включающих животных #111 и #167. Это позволяет предположить, что ОВ ген находится в данной YAC.

Для продолжения физического картирования на основе выделения других YACs и Pl-клонов используют PCR-анализ указанных двух концов aad (pICL) и adu (+). Важные P1-клоны, выделенные для осуществления данной попытки, включают 498, 499, 500 (данные клоны выделены с помощью пробы, полученной из aad (pICL)) и 322, 323 и 324 (указанные клоны выделены с помощью пробы из adu (+)).

В промежутке были охарактеризованы YACs, выделенные с помощью D6Rck 13 (53А6, 25А8, 25А9, 25А10). Исследования показали, что 53А6 простирается наиболее проксимально по отношению к aad YAC. Размер щели между 53А6 и aad был определен, и он составляет около 70 kb. Затем ключевой конец 53А6, 53(pICL) был использован для скрининга трех доступных библиотек YAC и библиотеки Р1. Критический P1-клон перекрывался с Р1-клонами, выделенными с помощью aad (pICL), как описано выше и, следовательно, использовался для «закрывания» щели между 53 (pICL) и aad (pICL). В результате был клонирован целый контиг, содержащий YACs и Р1-клоны, размером около 2.5 млн. п. о. в длину и перекрывающий Pax 4, 16М (+), adu (pICL), 53 (pICL), DGR6K 39 и D6Rck 13. Путем тщательного картирования сайтов рекомбинации у животных #111 и #167 было показано, что ОВ находится в 400 kb интервале. Для обеспечения работающего ДНК-источника для выделения ОВ гена был выделен участок около 500 kb, перекрывающий данный нерекомбинантный район, в 24 Р1-клонах. Указанные Р1-клоны, включая 322 и 323, которые, как позже выяснилось, оказались полезными клонами, были использованы для экзонного картирования. Физическая карта области хромосомы, несущей ОВ, показана на Фиг.7А. На Фиг.7В показан контиг YAC. На Фиг.7С показан Р1-контиг.

С. Выделение генов-кандидатов

Способ, который использовался для выделения генов в данном интервале, представляет собой экзонный захват. В данном способе используется коммерческий вектор для идентификации экзогенной ДНК (т.е. кодирующих последовательностей) путем селекции функционального сплайсинового акцептора и донорных последовательностей в геномной ДНК, введенной в тестируемую конструкцию ДНК. ДНК из этих Р1-клонов клонируют и субклонируют в захватывающий экзоны вектор. Данные клоны представляют собой короткие вставки, клонированные в BlueScript векторе. Каждый клон амплифицируют в PCR с помощью PCR-праймеров, соответствующих плазмидным последовательностям, которые фланкируют вставку. PCR-амплификацию осуществляют в бактериях, несущих плазмиду. Реакции осуществляют с помощью робота Biomer. Продукты PCR подвергают электрофорезу в 1%-ном агарозном геле в ТВЕ-буфере, содержащем бромистый этидий. Методику захвата экзонов модифицируют для устранения контаминации ДНК Е.Coli из Р1-клонов и скрининга избыточных экзонов-артефактов, которые превышают 80-90% возможных захваченных экзонов. Вектор захвата экзонов включает HIV-последовательности; короткий сегмент указанных векторных последовательностей соответствуют данному артефакту.

Эксперимент по захвату экзона осуществляют при использовании различных Р1-клонов. Продукты захвата экзона затем амплифицируют в PCR, отбирают и секвенируют. Последовательности возможных экзонов сравнивают с имеющимися в банке генов с помощью компьютерной программы Blast. Около 15 экзонов отбирают для дальнейшего исследования в PT-PCR, Нозерн-блоттинге и zoo-блоттинге на присутствие соответствующей РНК или консервативных последовательностей. Семь из 15 возможных экзонов, 325-2, 323-9, 322-5, D1-F7, 1НЗ и 2G7, как обнаружилось, кодируют РНК-транскрипт. 325-2 представляет собой специфический ген семенников; 323-8 и 323-9 скорее всего являются двумя экзонами того же гена, экспрессируемого главным образом в мозге и почках. IН3 и 322-5 соответствуют двум транскриптам, выявляемым в мозге на низком уровне. D1-F7 представляет собой экзон из предварительно клонированного гена гинозинмонофосфатдегидрогеназы, которая экспрессируется повсеместно. Ни один из указанных генов, по-видимому, не кодирует OB. 2G7, представляющий собой ОВ экзон, обсуждается ниже.

После трех безуспешных попыток экзонного захвата ОВ гена была предпринята другая попытка, основанная на объединении ДНК изо всех Р1 клонов критического ОВ района. Указанные клоны включали клоны 258, 259, 322, 323, 324, 325, 498, 499, 500, 653, 654 и другие. Затем Р1 клоны 258, 260, 322, 498 и 499 были субклонированы в вектор захвата экзона и далее были получены различные чашки с бактериальными клонами, каждый из которых содержал возможный экзон. Примерно 192 полученных клона соответствовали возможным генам ОВ. Как отмечалось выше, наблюдался соответствующий артефакт, заключающийся в том, что многие изоляты содержали два захваченных экзона, происходящих из вектора. Таким образом, клоны были идентифицированы как по размеру, так и по гибридизации ДНК-проб, соответствующих данному артефакту, с соответствующими полосами в геле Саузерн-блота. Таким путем 185 из 192 клонов были исключены из дальнейшего рассмотрения. Исключение артефактов на основании одного размера было невозможным, поскольку в конечном счете привело бы к исключения экзона, соответствующего ОВ.

Таким образом, для дальнейших исследований из 192 экзонов было отобрано семь. Были получены матрицы для секвенирования данных семи экзонов и проведено секвенирование. Последовательности семи экзонов проанализировали и обнаружили, что семь экзонов идентичны и один представляет собой явный артефакт. В частности, клон 1D12 содержал HIVпоследовательность, т.е. артефактную полосу. Три левых экзона были отобраны для дальнейшего анализа, а именно 1F1, 2G7 и 1Н3. 1F1 был элиминирован, поскольку картировался вне критического участка. Для 1НЗ и 2G7 были отобраны и синтезированы PCR-праймеры.

Была определена последовательность экзона 2G7, которая приведена на Фиг.10 (SEQ ID NO:7). Были отобраны и синтезированы PCR-праймеры для 2G7. Участки последовательности, соответствуюшие PCR-праймерам, подчеркнуты. Структура праймеров приведена ниже:

5' ССА GGG CAG GAA AAT GTG (Tm=60.0°С) (SEQ ID NO:8)

3' CAT CCT GGA CTT TCT GGA TAG G (Тm=60.0°C) (SEQ ID NO:9)

Указанные праймеры амплифицировали геномную ДНК при следующих условиях PCR: 25-30 циклов при 55°С отжига в течение 2'; удлинение при 72°С в течение 2'; денатурация при 94°С в течение 1' в стандартном PCR-буфере. Указанные праймеры также использовались для получения меченой пробы включения 32P-dCTP в PCR-реакцию с соответствующим уменьшением количества холодного dCTP.

PT-PCR осуществляли при использовании различных тканевых РНК и было обнаружено, что 2G7 экспрессируется исключительно в белой жировой ткани по сравнению со всеми исследованными тканями (Фиг.11А). Затем 32P-меченный 2G7 гибридизовали с Нозерн-блотом тканевых РНК (Фиг.11В) и было показано, что соответствующая РНК экспрессируется на высоком уровне в жировой ткани, но не экспрессируется или экспрессируется на очень низком уровне во всех других тканях (где сигналы могут быть результатом контаминации жировой тканью препаратов других тканей). 10 мкг общей РНК из каждой ткани подвергали электрофорезу в агарозном геле с формальдегидом. Пробу гибридизовали с блотом при 63°С в стандартном гибридизационном буфере, Papid Hybe (Amersham). Размер РНК примерно составлял 4.9 kb. С этой точки зрения 2G7 является реальным кандидатом на роль гена ОВ и подлежит дальнейшему анализу.

D. Выявление мутаций

Для подтверждения того, что 2G7 кодирует ген ОВ, необходимо показать различие в уровнях экспрессии ДНК-последовательности данного гена у мутантных животных по сравнению с животными дикого типа. Две раздельные мутации гена ob доступны для изучения, а именно C57BL/6J ob/ob (1J) и Ckc/Smj ob/ob (2J). Данные мутации позже обозначили 1J и 2J соответственно. (Неформальная номенклатура используется для обозначения изученных линий мыши. В описании и фигурах C57BL/6J означает C57BL/6J +/+; Ckc/Smj означает SM/Crc-+Dac-+/+; Ckc/Smj ob/ob означает SM/Crc-+Dac-ob21/ob21;). РНК получали из жировой ткани мышей 1J, 2J и контрольных животных. Общую РНК каждого образца обрабатывали ДНКзой и затем обратно транскрибировали с помощью олиго-dT в качестве праймера и обратной транскриптазы. Полученную в результате одноцепочечную кДНК амплифицировали в PCR при использовании 207-праймеров (условия описаны выше) для нижней полосы и при использовании коммерчески доступных актиновых праймеров для верхней полосы. RT-PCR продукты разгоняли в 1%-ном агарозном ТВЕ-геле, который затем окрашивали бромистым этижем (Фиг.12А). С помощью RT-PCR было обнаружено, что в то время как 2G7 мРНК экспрессируется в 1J и всех других контрольных животных, она полностью утрачена у 2J мышей. Сигнал не был обнаружен после 30 циклов амплификации. Указанный эксперимент напрямую свидетельствует, что 2G7 соответствует экзону гена ОВ.

Поскольку 2J мутация является относительно недавней и поддерживается как коизогенный штамм, это является первым значительным доказательством того факта, что 2G7 представляет собой экзон ОВ гена. Мутация скорее всего локализована в промоторной области, что приводит к общему нарушению синтеза мРНК. Наличие сигнала у 1J мыши в данном RT-PCR эксперименте позволяет предположить, что животные 1J должны нести точечную мутацию, которая не приводит к значительному изменению размера образца РНК. Кроме того, 2G7 мРНК не обнаруживалась при тестировании RT-PCR у четырех дополнительных 2J-животных.

Полученный результат согласовывается с Нозерн-блотом (Фиг.12В). Получают РНК из жировых клеток каждого штамма (C57Bl/6J, 1J, CKC/smj и 2J). Десять мкг указанных РНК подвергают электрофорезу и блоттингу. Блот тестируют с 2G7-пробой, меченной с помощью PCR путем амплификации материала, т.е. полосы на Фиг.11, при использовании 32P-dCTP в PCR-реакции. Актин служит контролем количества нанесенной РНК. Актиновый сигнал был чрезвычайно сходным во всех образцах. ОВ сигнал отсутствует в мозге, поскольку мРНК специфична для жировых клеток.

Результаты Нозерн-анализа подтверждают, что 2G7 специфическая РНК отсутствует у 2J-мышей. РНК ob отсутствует у CKC/smj ob/ob мышей, поскольку у этого мутантного штамма животных, страдающих ожирением, ген разорван, так что РНК не образуется. Кроме того, что уровень 2G7 РНК увеличен примерно в 10-20 раз, у животных 1J и у животных db/db fat. Данные результаты совместимы с гипотезой, что ОВ кодирует циркулирующий гормон или отвечает на генерацию сигнала от жировых клеток, который модулирует вес тела. Результаты свидетельствуют также в пользу заключения, что 2G7 является ОВ геном, и предсказывают, что 1J мыши имеют точечную мутацию, возможно, нонсенс-мутацию, приводящую к преждевременной терминации трансляции.

Нозерн-блоты реплицировали при использовании РНК-препаратов из жировых клеток четырех различных животных 2J (Фиг.13). В этом исследовании ар 2 представляет собой специфический транскрипт жировой ткани, который использовали в качестве контроля практически так же, как актин на Фиг.12В. Не обнаруживалось существенных вариаций в плотности полосы ар 2. Ар 2 метили путем конструирования PCR-праймеров для опубликованной последовательности ар 2. RT-PCR-продукты РНК жировых клеток радиоактивно метили с помощью той же самой методики, что и для PCR-мечения. Данное исследование показывает наличие ОВ мРНК у нормальных гомозиготных и гетерозиготных животных и ее отсутствие у 2J мутантных животных.

Мутацию идентифицировали у 1J мышей. Мутация заключается в изменении основания С на Т, что приводит к замене аргинина на явный преждевременный стоп-кодон аминокислоты 108 и, по всей вероятности, является мутацией 1J (Фиг.14) несмотря на высокий уровень экспрессии ob мРНК (см. Фиг.12 и 13, C57BL/6J ob/ob линии).

Затем на основе Саузерн-блотов было сделано заключение, что 2J мутация является результатом выявляемого ДНК-изменения на 5'-конце OB, что, по-видимому, полностью нарушает РНК-экспрессию. Реальную природу данной возможной перестановки еще предстоит установить.

Геномный Саузерн-блоттинг ДНК мышей CKC/smj (СМ/Ckc-+Dac) и C57BL/6J с помощью четырех различных рестрикционных эндонуклеаз проводился для определения, характерен ли для мутанта ob уникальный набор фрагментов (Фиг.15А). Примерно 10 мкг ДНК (полученной из геномной ДНК печени, почки или селезенки) обрабатывали указанным рестрикционным ферментом. ДНК подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном ТВЕ-геле. Затем ДНК переносили на мембрану «имобилон» и гибридизовали с PCR-меченной 2G7 пробой. Ключевая полоса представляла собою наиболее верхнюю полосу в переваре Bgl II ДНК CKC/smj ob/ob (SM/Ckc-+Dac ob2/ob2). Указанная полоса имела самый высокий мол. вес по сравнению с другим штаммом, указывая на мутацию у данного штамма.

На Фиг.15В показан Саузерн-блот Bgl II перевара геномной ДНК потомков ob21/+ x ob21/+ скрещивания. Некоторые образцы ДНК имеют только одну верхнюю полосу, некоторые другие - только нижнюю полосу, и определенное количество образцов имеют обе полосы. Животные, у которых обнаружена только верхняя полоса, имеют полную степень ожирения, т.е. ob21/ob21. Эти данные указывают, что полиморфизм (т.е. мутация), показанный на Фиг.15А, в генетическом смысле сегрегирован.

ПРИМЕР 1: Клонирование кДНК и определение последовательности ОВ

С помощью меченной в PCR 207-пробы были выделены 50 кДНК клонов мыши из библиотеки кДНК gt 11 в жировых мышиных клетках (кДНК Clonetech 5'-STRETCH из жировых комков семенников мышей Swiss, # ML3005b) и 30 перекрестно-гибридизующихся кДНК-клонов человека из библиотеки кДНК gt 10 в жировых клетках человека (кДНК Clonetech 5'-STRETCH из абдомена, # HL1108a). Библиотеки скринировали при использовании метода переноса бляшек. Соответствующие фильтры денатурировали автоклавным способом. Фильтры гибридизовали в повторах с PCR-меченной пробой 2G7 (Rapid Hybe буфер, 65°С, в течение ночи). После 2-4 ч предгибридизации фильтры отмывали 2xSSC, 2% SDS, дважды в течение 30 мин при 65°С и экспонировали на рентгеновской пленке. Позитивные дубликаты очищали с помощью бляшек. Очищенный методом бляшек фаг амплифицировали в PCR при использовании коммерчески доступных векторных праймеров, например, gt 10 и gt 11. Продукты PCR-реакции соответствовали кДНК-вставке для каждого фага с небольшим количеством векторной последовательности на каждом конце. Полосы очищали гель-электрофорезом и секвенировали с помощью автоматического секвенсера ABI и векторных праймеров в качестве проб к ДНК-полимеразе.

Полученные данные по секвенированию затем проверяют с помощью ручного секвенирования «от основания к основанию», чтобы скорректировать ошибки компьютерной программы. После уточнения последовательности синтезируют праймеры, соответствующие положению «downstream» и используют их для продолжения секвенирования. Такие эксперименты повторяют до тех пор, пока каждый доступный клон кДНК не будет секвенирован и синтезирован в составе контига. Определяют порядок около 3000 п.о. с 5'-конца мРНК. Один из кДНК-клонов продолжается до 5'-конца мРНК, поскольку его последовательность идентична таковой 5'RACE продукта РНК жировой ткани (данные не показаны).

Результаты секвенирования показывают, что имеются 167 аминокислот в открытой рамке считывания (Фиг.1). Консенсусная последовательность инициации трансляции Козака включает три аленозиновых основания в положении «upstream» по отношению к ATG. Было обнаружено два класса кДНК, которые характеризуются включением одного глутаминового кодона. Данный остаток выявляется в «немедленном» положении 3' по отношению к акцептору сплайсинга 207-экзона. Поскольку CAG кодон глутамина включает возможную AG-сплайсинговую акцепторную последовательность, то, по-видимому, существует «проскальзывание» в сплайсинговом акцепторном сайте с явной делецией в 3 п.о. в полнаборе кДНК, как показано ниже.

Обозначение «ag» в приведенных выше последовательностях относится к последовательности интрона в положении «upstream» по отношению к глутаминовому кодону, и AG представляет собой возможный альтернативный сплайсинговый сайт. Данный остаток глутамина расположен в высоко консервативном участке молекулы и его значение для биологической активности до сих пор неизвестно.

Выявлена возможная N-терминальная сигнальная последовательность, сайт отщепления которой, как предсказано, является карбокситерминальным по отношению к аланиновому остатку в положении 21 аминокислотной последовательности. Возможная сигнальная последовательность была получена при использовании компьютерного алгоритмического метода von Heijne. С помощью данной методики наиболее вероятная сигнальная последовательность была идентифицирована в кодирующем полипептид участке, соответствующем аминокислотам 1-23 с последовательностью

MCWRPLCRFLWLWSYLSYVQAVP (SEQ ID NO:10),

в которой стрелкой показан возможный сайт отщепления сигнальной последовательности. Оставшаяся аминокислотная последовательность высокогидрофильна и не имеет каких-либо существенных структурных особенностей или мембранных доменов, других, чем N-концевая сигнальная последовательность. Авторы не обнаружили консенсусных последовательностей для N-связанного гликозилирования или двухосновных аминокислотных последовательностей, свидетельствующих о возможном расщеплении в предсказанном процессированном белке (Sabatini et al., The metabolic basis of inherited disease, pp. 177-223, С. V. Scriver et al., eds., Mc Graw-Hill, New York). Данные поиска оснований при использовании программ Blast и Block не идентифицировали каких-либо гомологичных последовательностей.

РНК из жировой ткани человека анализировали в Нозерн-блоттинге и выявили типы РНК, соответствующие по размеру гену ob мыши. Секвенирование и анализ кДНК-клонов показали, что ген ОВ человека также кодирует полипептид в 167 аминокислот (Фиг.2А и В и Фиг.3). Было обнаружено два класса кДНК человека, содержащих и не содержащих делеции в три пары оснований (Фиг.6). Гены ob человека и мыши высокогомологичны в предсказанном кодирующем участке, но имеют только 30% гомологии в 3' и 5' нетранслируемых участках. В полипептиде OB человека также присутствует N-терминальная сигнальная последовательность. Сравнение последовательностей полипептида ОВ человека и мыши показывает, что две молекулы имеют более 83% идентичности на аминокислотном уровне (Фиг.4). N-концевой участок зрелых белков человека и мыши также обнаруживает высокую степень гомологии только с 6 консервативными и тремя неконсервативными аминокислотными замещениями среди 100 N-концевых аминокислотных остатков.

Геномную ДНК выделяли из клеток мыши, крысы, кролика, кошки, полевки, коровы, овцы, свиньи, человека, цыпленка, угря и дрозофиллы и расщепляли EcoR I. Полученные фрагменты подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном ТВЕ-геле. Затем ДНК переносили на мембрану «имобидон» и тестировали с меченной в PCR пробой 2G7. Фильтр гибридизовали при 65°С и отмывали 2xSSC, 0.2% SDS при 65°С дважды в течение двадцати минут на каждую процедуру отмывания, т.е. буфер меняли два раза. Приведенные данные свидетельствуют о том, что ген OS консервативен среди позвоночных (Фиг.16). В этой связи обращает на себя внимание то обстоятельство, что в ДНК угря (который является рыбой) обнаружено более 2 сигналов.

В целом, известные факторы позволяют предположить, что вес тела и ожирение физиологически контролируется. Семь лет назад были предприняты попытки идентифицировать два ключевых компонента данной системы: гены ОВ и DB. Как показано в данном примере, ОВ ген сейчас идентифицирован как специфический ген жировой ткани, который играет ключевую роль в регуляции веса тела. Продукт данного гена, который скорее всего является секретируемым гормоном, будет иметь важное применение в диагностике и лечении нарушений, связанных с питанием, у человека и животных.

ПРИМЕР 2: Экспрессия ОВ в бактериях

кДНК, кодирующую ob человека и мыши, клонировали в экспрессионном векторе pET-15b (Novagen). Данный вектор содержит Т7-промотор в соединении с lac-оператором и экспрессирует белок слияния, содержащий метку (His-tag) и сайт расщепления тромбином в положении «немедленно upstream» по отношению к сайту вставки кодирующей последовательности (Фиг.17) (SEQ ID NO:11 и 12).

кДНК человека и мыши модифицировали так, что аланин на конце сигнальной последовательности преобразовывался в Nde I-сайт с образованием отдельной последовательности в 3'-участке. Вставку Nde I-сайта осуществляли с помощью новых праймеров PCR:

пять первичных праймеров мыши

Mnde-5'

CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC (SEQ ID NO:13)

три первичных праймера мыши

Mnde-3'

ТСССТСТАСА TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC (SEQ ID NO:14)

пять первичных праймеров человека

Hnde-5'

TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC (SEQ ID NO:15)

три первичных праймера человека

Hnde-3'

TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA (SEQ ID NO:16)

Праймеры содержали не совпадающие в середине 6 пар оснований, которые интродуцируют Nde I рестрикшюнные сайты на каждом конце PCR-фрагмента. Фаг, несущий кДНК человека или мыши, PCR-амплифицировали с помощью данных праймеров. PCR-продукг расщепляли Nde I и подвергали гель-электрофорезу в 1%-ном геле легкоплавкой агарозы. Очищенные полосы геля субклонировали в рЕТ-вектор. Полученные плазмиды секвенировали для того, чтобы показать, что мутации не интродуцируются в процессе клонирования на стадии PCR-амплификации. Получены конструкции кДНК человека и мыши, кодирующие и утратившие глутамин 49. В частности, PCR-клонирующим методом получены конструкции рЕТ 15b, содержащие ОВ кодирующую последовательность человека и мыши (за исключением сигнальной последовательности), слитую с His-tag. Конструкции секвенировали, чтобы убедиться в том, что на стадии PCR-амплификации не происходит ошибочного встраивания последовательностей в кодирующую область гена ОВ.

Для трансформации бактериального хозяина экспрессии были отобраны две плазмидные конструкции, рЕТМ9 и рЕТН14. При индукции 1 мМ IPTG в оптимальных условиях трансформированные бактерии были способны продуцировать 100-300 мкг/мл белка слияния ОВ. Основная часть белка слияния ОВ обнаруживались в тельцах включения. После солюбилизации 6М гуанидин-HCl или мочевиной белок слияния очищали на His-связываюшей (Ni-хелатируюшей) колонке со смолой. Условия очистки белка слияния ОВ на колонке (связывание, отмывание и элюция) были установлены экспериментально. Белок слияния ОВ связывается со смолой при 5 мМ имидазола/6М гуанидина-HCl и остается связанным со смолой при 20 мМ имидазола/6М гуанидина-HCl. Белок может быть элюирован с колонки при 60 мМ имидазола/6М гуанидина (Фиг.18А, В). Очищенные белки слияния ob человека и мыши затем диализуют в PBS для удаления гуанидин-HCl из препарата и используют для получения поликлональных антител.

Для тестирования биологической активности белков слияния использовали «распрямляющие» условия для очищенного белка. Первоначально белок слияния диализовали в 1М растворе гуанидина с последующим разбавлением 0.4 М раствором аргинина. His-tag затем удаляли из белков слияния до исследования биологической функции. Удаление tag осуществляли обработкой белка слияния тромбином из плаценты человека. Кроме того, кодирующие последовательности гена OB человека и мыши за исключением сигнальной последовательности были встроены в вектор рЕТ12с с помощью PCR-клонирующего метода. Указанные конструкции могут направлять синтезированные белки слияния ОВ в периплазматическое пространство бактериальной клетки-хозяина. Белок слияния OB, выделенный из периплазматического пространства, нуждается только в простой гель-фильтрации, чтобы быть очищенным от других белков клетки-хозяина и не подвергнуться денатурации в данном процессе.

ПРИМЕР 3: Получение антител к полипептиду OB

Кроме того, при использовании рекомбинантного белка для генерации поликлональных антител были идентифицированы 4 пептидных последовательности из предсказанной последовательности ОВ мыши с помощью программного обеспечения исследований иммунногенности (GCG Package). Четыре карбокси-терминальных пептидных фрагмента приведены ниже:

(SEQ ID NO:18):

Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr

(SEO ID NO:19):

Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala

(SEQ ID NO:20):

Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp

(SEQ ID NO:21):

Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys

Данные пептиды конъюгировали с KLH, и полученные конъюгаты использовали для иммунизации кроликов по стандартной методике. Затем получали поликлональную сыворотку, специфичную к каждому полипептиду.

ПРИМЕР 4: Транслокация ОВ полипептида in vitro

Для обнаружения функциональной сигнальной последовательности кДНК человека, которая включает полную открытую рамку считывания, субклонировали в вектор pGEM. В данном эксперименте использовали только кДНК человека, поскольку не были получены подходящие субклоны мыши. Положительную полосу РНК ob человека транскрибировали при использовании Sp6 полимеразы и включали в реакцию трансляции in vitro как в присутствии, так и в отсутствие микросомальных мембран поджелудочной железы собаки. Первичный продукт трансляции мигрировал с явным мол. весом около 18 кДа, что согласуется с тем, что было предсказано на основе кДНК-последовательности. Включение микросомальных мембран в реакцию ингибирует чрезвычайно интенсивную трансляцию - примерно в 5 раз. Тем не менее, около 50-70% первичного продукта трансляции ОВ усечено примерно на 2 кДа в присутствии мембранного препарата. Это позволяет предположить функциональность сигнальной последовательности (Фиг.19А). Размер первичного продукта трансляции РНК интерлейкина -1, который не кодирует сигнальной последовательности, не изменялся при внесении в реакцию микросомальных мембран. Для выяснения возможной транслокации белка ОВ продукты трансляции in vitro обрабатывали протеиназой К. Обработка протеазой приводила к полному протеолизу 18-кДа первичного продукта трансляции, в то время как на 16-кДа процессированную форму обработка ферментом не влияла. Это свидетельствует о том, что данная форма транспонируется в просвет макросом (Фиг.19В). Полученные данные совместимы с гипотезой о том, что ОВ является секретируемой молекулой.

После отщепления сигнальной последовательности два остатка цистеина остаются в предсказанном белке, подтверждая возможность образования дисульфидной связи, что характерно для других секретируемых полипептидов (Shen et al., Science, 224: 168-171, 1984).

ПРИМЕР 5: Характеристика гена ОВ

Для установления взаимосвязи между ожирением и генетическими изменениями гена ОВ у человека была определена последовательность гена ОВ человека (Фиг.20А-С) (SEQ ID NO:22 и 24). Для скрининга P1-библиотеки человека были использованы специфические праймеры из кодирующей последовательности человека. Было получено три различных Р1-клона, затем их нарастили и амплифицировали в PCR с помощью праймеров, фланкирующих сплайсинговый сайт между вторым и первым кодирующими экзонами. Целый участок интрона размером около 2 kb был амплифицирован и частично секвенирован (Фиг.20А и как показано в SEQ ID NO:22 и 24).

Структура генов человека и мыши была охарактеризована с помощью PCR-исследования и других известных методик. Было обнаружено, что ген ОВ мыши содержит три экзона, первый и второй из которых считаются кодирующей последовательностью (Фиг.20D). Кодирующий участок гена ОВ человека обнаружил аналогичную структуру, однако ген человека утратил 5'-экзон и интрон (Фиг.20Е).

Было получено два набора праймеров из интронных последовательностей гена человека (Фиг.20А-С). Последовательности праймеров приведены ниже (F и R означают прямой и обратный праймеры соответственно):

НОВ 1gF 5'-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3' (SEQ ID NO:29)

НОВ 1gR 5'-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3' (SEQ ID NO:30)

НОВ 2gF 5'-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3' (SEQ ID NO:31)

НОВ 2gR 5'-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3' (SEQ ID NO:32)

ДНК-образцы были получены из различных источников, и данные наборы праймеров использовались для амплификации геномной ДНК человека из клеток некоторых людей, страдающих ожирением. Продукты PCR подвергали гель-электрофорезу в геле легкоплавкой агарозы и полосы вырезали и расщепляли агаразой. Последовательности были получены с помощью ABI 3 73 А ДНК-секвенсера и набора Taq дидеокиси терминатора (ABI, Perkin-Elmer). На сегодня обнаружена в одном образце одна точечная мутация гена ob. Она находится в первом экзоне и не изменяет аминокислотной последовательности. Предварительные данные свидетельствуют, что последовательность вставки может находиться в первом экзоне гена ob другого образца. Для более легкого «считывания» последовательностей с целью выявления мутаций могут быть использованы различные автоматические методы секвенирования при использовании Секвеназы вместо Taq ДНК-полимеразы.

ПРИМЕР 6: Экспрессия OB в дрожжах

После позиционного клонирования OB становится важным определить физиологический механизм, посредством которого белок ОВ снижает потребление пищи и вес тела. Первый шаг в данном направлении - это рекомбинантное получение функционального белка с помощью экспрессионной системы. Была отобрана дрожжевая система экспрессии в дополнение к успешно работающей бактериальной системе экспрессии. Дрожжевая система имеет определенные преимущества для экспрессии OB. Наиболее важно то, что биологически активные белки эукариот могут быть получены в данной системе с наибольшей вероятностью. Полипептид OB секретируется клетками млекопитающих. Белковая секреция очень сходна у всех эукариот, и это означает, что секреторный аппарат дрожжей более близок к секреторному аппарату млекопитающих, чем бактериальный. В частности, модификации белка ОВ, наблюдаемые в клетках млекопитающих, будут также наблюдаться при экспрессии и секреции в дрожжах. Кроме того, по мере секреции происходит скручивание белка, и поэтому прохождение ob через секреторный аппарат дрожжей будет приводить к образованию более правильно скрученного белка с нативной биологической активностью. Это имеет важное значение для OB, поскольку два цистеиновых остатка могут образовывать дисульфидный мостик. В противоположность секреторным путям, восстанавливающее окружение клеточной цитоплазмы предотвращает образование дисульфидных связей, и поэтому необходимо прохождение OB через секреторный путь, чтобы дисульфидная связь образовывалась in vivo. Другие преимущества связаны с легкостью и быстротой манипулирования дрожжами, доступностью векторов и штаммов и большим опытом в использовании дрожжевой рекомбинантной технологии.

Экспрессионная система Pichia pastoris была выбрана по четырем причинам: (1) она обладает наиболее высоким уровнем экспрессии гетерологичного белка по сравнению с другими дрожжевыми системами, такими как S. cerevisiae; (2) гликолизирование белка более сходно с системой гликозилирования млекопитающих у Р. pastoris по сравнению с S. cerevisiae (несмотря на то что сайты гликолизирования не обнаружены в ob с помощью компьютерного поиска, гликозилирование может происходить по неустановленным сайтам); (3) Р. pastoris секретируют очень незначительное количество белков, и поэтому значительно легче очищать экспрессированный чужеродный белок в данном случае; и (4) векторы и дрожжевые штаммы коммерчески доступны (фирма Invitrogen). Две стратегии получения векторов для экспрессии в дрожжах показаны на Фиг.21 и 22.

Выбранный вектор представляет собой рР1С9. Данный вектор содержит клонирующий сайт в положении «немедленно downstream» по отношению к препрокодирующей последовательности -фактора спаривания, которая обеспечивает секрецию белка, кодируемого клонированным геном в клонирующем сайте, через секреторные пути. Другим важным свойством вектора является наличие HIS 4 гена, который обеспечивает селекцию поглощения вектора при использовании дрожжевого штамма, выращенного на дефицитной по гистилину среде после трансформации дрожжей вектором. Клонирующая стратегия заключается в следующем: кДНК OB PCR-амплифицируют при использовании 5'-праймера, содержащего на 3'-конце последовательность ОВ, сразу же за предсказанным пептидным сайтом отщепления лидерной последовательности и на самом близком к 5'-концу участке последовательность, комплементарную 3'-концевому участку последовательности -фактора спаривания вектора. 5'-праймер также содержит Xho I-сайт. 3'-праймер, как показано, имеет на 3'-конце последовательность, комплементарную последним нескольким аминокислотам ОВ, и Есо RI-сайт на 5'-конце. После PCR-амплификации PCR-продукт расщепляют Xho I и Есо RI и клонируют в расщепленный такими же ферментами pPIC.9. После клонирования сДНК ОВ человека и мыши как с глутаминовым колоном 49, так и без него, индивидуальные клоны выделяют для всех четырех конструкций и секвенируют для подтверждения того, что конструкции были клонированы в правильной ориентации и с правильной рамкой, и на стадии PCR-амплификации не возникло мутаций. После идентификации клонов с правильно ориентированной последовательностью ими трансформируют Р. pastoris штамма GS 115, который ауксотрофен по гистидину.

Для двух конструкций, содержащих ОВ, проводят скрининг трансформированных дрожжевых клонов на экспрессию белка. Проводят дот-блот-гибридизацию ДНК и колоночную гибридизацию для того, чтобы подтвердить содержание ОВ в трансформированных дрожжах. Оба метода выявляют наличие ОВ последовательности в трансформированных клетках и ее отсутствие в нетрансформированных. Более того, трансформированные дрожжи секретируют 16-кДа белок в культуральную среду, в то время как нетрансформированные не секретируют белка указанного размера (Фиг.23А). Это предсказанный размер ОВ. Было показано, что индивидуальные клоны для обеих конструкций мыши обладают высокой экспрессией ОВ и в настоящее время разрабатывается адекватная процедура очистки ob до состояния гомогенности. В одном случае ОВ очищают путем катионообменной хроматографии на колонке (Фиг.23В); предварительные данные свидетельствуют, что может быть использована катионообменная хроматография в строгих условиях. Однако после катионообменной хроматографии возможный продукт ob утрачивается. Это означает присутствие протеазы в образце.

Один подход для решения указанной проблемы заключается в получении белков слияния ob-His-tag для экспрессии в дрожжах (Фиг.22). Дальнейшее исследование показывает, что OB без His-tag прочно связывается с Ni-хелатирующей колонкой. Очистка ОВ полипептида на такой колонке с последующей гель-фильтрацией приводит к выходу продукта с чистотой, достаточной для масс-спектрального анализа. Указанный анализ показывает, что мол. вес экспрессионного белка идентичен ожидаемому. Это подтверждает успешную экспрессию ОВ в клетках Pichia.

Однако Ni-хелатирование/гель-фильтрация не приводят к получению ОВ полипептида в достаточно очищенной форме. Присутствуют дополнительные небольшие молекулы. Это означает, что протеолитически активные фракции с Ni-хелатирующей колонки содержатся в свободном объеме. Соответственно используется трехступенчатая процедура очистки: Ni-хелатирование, катионообменная хроматография (удаление небольших контаминирующих молекул) и гель-фильтрация.

Оценка уровня экспрессии путем окрашивания Кумасси синим SDS-PAGE геля выявляет количество полипептида, составляющее около 10 мг/л, когда дрожжи выращивают в шейкерных флаконах. Эти уровни ожидаются при использовании ферментационных систем, и авторы надеятся получить таким способом большие количества белка. По отношению к конструкциям, содержащим OB человека, идентифицированы трансформированные дрожжевые клоны, содержащие большое число копий гена OB, и ожидается, что они экспрессируют ОВ белок. После получения антител они будут использованы для идентификации секретируемого 16-кДа белка.

ПРИМЕР 7: Экспрессия на высоком уровне белка слияния OB в бактериях

Получение замороженных исходных препаратов:

К каждой из двух 4-мл аликвот стерилизованной среды M9ZB без источника углерода добавляют 40 мкг исходного раствора декстрозы (0.4 г/мг, стерилизация с помощью фильтра), 10 мкг исходного раствора ампициллина (200 мг/мл) и 5 мкг исходного раствора хлорамфеникола (34 мг/мл в этаноле). Для инокуляции среды используют одиночные колонии Е.coli с клонированной ДНК ОВ1 человека и мыши в Novagen рЕТ-14b-векторе. Пробирки инкубируют в течение ночи при 37°С.

0.5 мл ночных культур используют для инокуляции 50 мл среды M9ZB с декстрозой, ампициллином и хлорамфениколом. Культуры инкубируют при 30°С и периодически измеряют поглощение при 600 нм (А600). При А600 около 1-1.2 175-мл аликвоты культур смешивают с 25 мкл 60%-ного глицерола в 2-мл пробирках «Эппендорф», быстро замораживают в жидком азоте и хранят при -80°С.

Выращивание культур:

50 мл среды M9ZB с 0.5 мл 40%-ной декстрозы, 125 мкл исходного раствора ампициллина и 50 мкл исходного раствора хлорамфеникола инокулируют 1 мл замороженной культуры и инкубируют при 30°С. При А600 1-1.2 10 мл культуры используют для инокуляции каждого из четырех 2-л флаконов с 500 мл среды M9ZB, содержащей декстрозу, ампициллин и хлорамфеникол. Культуры инкубируют при 30°С до обеспечения А600 около 1-1.2 с помощью индукции IPTG при конечной концентрации 0.5 мМ. Культуры инкубируют в течение ночи. Клетки собирают центрифугированием при 4000 rpm в течение 20 мин. Данная система экспрессии приводит к выходу рекомбинантного ОВ полипептида с высоким процентным содержанием общего белка в пересчете на г/л культуральной среды Е.coli.

Лизис клеток и ресуспендирование телец включения

Клеточную пасту ресуспендируют в минимальном объеме 20 мМ HEPES, рН 7.2, 10% глицерола, 0.1 М KCl, 5 мМ MgCl2, 1% апротинина, 1 мМ PMSF, 5 мкг/мл лейпептина и 50 мкг/мл ДНКазы I. Суспензию трижды замораживают и оттаивают с помощью жидкого азота и тепловатой воды. Лизированные клетки центрифугируют при 18000 rpm в течение 30 мин и ресуспендируют в 20 мМ HEPES, рН 7.5, 0.1 NaCl. Суспензию обрабатывают ультразвуком и добавляют Тритон X100 до конечной концентрации 2%. Затем суспензию центрифугируют в течение 15 мин при 18000 rpm. После двух указанных циклов препарат трижды отмывают Тритоном. И наконец осадок растворяют в 6М GdHCl (гуанидин-HCl), 20 мМ HEPES, рН 7.5, путем обработки ультразвуком для дальнейшей очистки.

Белок ОВ очищают в нескрученном состоянии аффинной хроматографией с иммобилизованными ионами металлов (IMAC). Раствор наносят на 40-мл колонку Pharmacia с хелатируюшей быстротекущей серофазой, загруженной 50 мМ NiSO4 в 5 объемах колонки, и уравновешивают 6М GdHCl, 20 мМ HEPES, рН 7.5. Колонку отмывают 6М GdHCl, 30 мМ имидазолом, 20 мМ HEPES, рН 7.5. Затем белок элюируют тем же самым буфером, содержащим 0.2 М имидазола. Нескрученный белок в 6М GdHCl хранят при 4°С после добавления ацетата натрия (NaAc) до 10 мМ и доводят рН до значения около 4.5 уксусной кислотой.

Восстановление структуры и очистка белка

6М GdHCl раствор, содержащий 100 мг белка, обрабатывают 67 мкл 1М дитиотреитола (DTT) и разбавляют до 67 мл 6М GdHCl, 10 мМ NaAc, рН 4.5. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1ч. Затем смесь разводят в 4л 20%-ного глицерола, 2.5 мМ CaCl2, 20 мМ Трис, рН 8.4, при перемешивании. После соответствующего смешивания раствор оставляют при комнатной температуре в течение 8ч без дальнейшего перемешивания. Затем добавляют 2000 ед. очищенного бычьего тромбина (из тромбостата, продукт Parke-Davis) и раствор мягко перемешивают. Через 2.5 ч вновь добавляют 2000 ед. тромбина, и продолжают отщепление гистидин-tag более 3 ч. Расщепление останавливают добавлением PMSF до конечной концентрации 0.1 мМ. Раствор фильтруют и хранят при 4°С.

Расщепленный белок далее очищают на колонке IMAC, как описано выше, уравновещенной 1 М KCl, 20%-ным глицеролом, 20 мМ HEPES, рН 8.4. После нанесения раствора белка его отмывают тем же самым буфером и расщепленный белок элюируют 1М KCl, 20%-ным глицеролом, 40 мМ имидазолом, 20 мМ HEPES, рН 8.4. Нерасщепленный белок элюируют 0.2 М имидазолом.

Очищенный белок концентрируют, обрабатывают 50-100 мМ ЭДТА, 10 мМ феррицианидом калия (для завершения недостаточного окисления) и подвергают гель-фильтрации на колонке с супердехсом 75 16/60. Выход продукта при осуществлении указанной процедуры составляет 50% от начального.

Очищенный экспрессированный белок может быть охарактеризован различными методами. Физическая характеристика основывается на динамическом рассеивании света для определения гомогенности препарата и должной степени скручивания. Данные, основанные на рассеивании света, показывают, что полипептид ОВ человека преимущественно или исключительно экспрессируется в форме мономера, в то время как полипептид ОВ мыши может быть обнаружен в форме димера и мономера.

Исследование с помощью реагента Эллмэна и масс-спектроскопический анализ показывают, что цистеиновые остатки образуют дисульфидную связь в белке. Такую окисленную форму полипептида вводят животным, как указано ниже, для определения биологической активности.

Для определения структурной геометрии белка используют метод кругового дихроизма (КД). Спектр КД в физиологическом буфере (рН около 8, ионная сила примерно соответствует физиологической) показывает, что полипептид ОВ человека имеет около 60% -спиральной структуры и около 40% выборочной кольцевой структуры. Методом СД спектроскопии показано, что полипептид ОВ мыши имеет около 50% -спиральной структуры и 50% выборочной кольцевой структуры. Ограниченный протеолиз, осуществленный после масс-спектрометрического анализа (Cohen et al., 1995, см. выше), проводят для идентификации участков полипептида, чувствительных к протеолизу. Данный метод показывает наличие подвижной петлевой структуры из аминокислотных остатков 54-60 (как показано на Фиг.4). Вероятно, что данная подвижная петля соединяет два домена определенной 20 структуры, т.е. -спирали.

Биологическую активность очищенного белка определяют (как описано далее в Примерах) путем его введения неожиревшим и ожиревшим грызунам посредством осмотического насоса (например, осмотический насос ALZET фирмы Alza Corporation, Palo Alto, CA) или интраперитонеально с помощью ежедневных пилюль по крайней мере в течение двухнедельного периода с последующим наблюдением эффектов на поведение, связанное с питанием, и вес тела.

ПРИМЕР 8: Влияние ОВ полипептида (лептина) на снижение веса

Генный продукт локуса ОВ мыши играет важную роль в регуляции веса тела. Данный пример показывает, что белок ОВ циркулирует в плазме крови мыши, крысы и человека. Циркулирующая форма белка у всех трех видов имеет идентичный мол. вес, определенный в SDS-PAGE для предсказанной аминокислотной последовательности без сигнальной последовательности. Это позволяет предположить, что in vivo белок не процессируется после отщепления сигнальной последовательности. Белок ОВ не обнаруживается в плазме крови мышей C57/Bl6J ob/ob и выявляется в десятикратной концентрации в плазме крови мышей db/db и в двадцатикратной концентрации в плазме крови крыс fa/fa по отношению к контролю. Приведенные данные позволяют предположить, что указанные мутантные животные, страдающие ожирением, устойчивы к эффектам ОВ. Наблюдаются семикратные различия в уровнях ОВ белка в плазме крови неожиревших индивидуумов в пределах группы из шести человек. Ежедневные инъекции рекомбинантного ОВ белка мыши существенно снижают массу тела мышей ob/ob, в значительной степени влияют на вес тела мышей дикого типа и не оказывают воздействия на мышей db/db. Эти данные позволяют предположить, что генный продукт генного локуса ОВ выполняет эндокринную функцию с целью регуляции веса тела.

Материалы и методы

Кроликов иммунизировали рекомбинантным белком в адъюванте Фрейнда (HRP, Inc). Иммуноочищенные антитела к ОВ мыши получают путем пропускания сыворотки через колонку с 4 В сефарозой, конъюгированной с рекомбинантным белком, как описано Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1988). Иммунопреципитацию плазмы крови мыши осуществляют следующим образом: 0.5 мл плазмы крови мыши, крысы и человека, содержащей примерно 2.5 мМ ЭДТА, предварительно очишают на неконъюгированной сефарозе 4 В при комнатной температуре с потряхиванием в течение 2 ч. Сефарозу удаляют выдавливанием и добавляют 50 мл 50%-ной жидкой конъюгированной с антителом сефарозы, содержащей аффинно-очищенное антитело в концентрации 1 мг/мл сефарозы. Затем добавляют 1/2 мл 2xRIPA буфера до обеспечения следующих конечных условий связывания: 50 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 100 мМ NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% дезоксихолата и 0.025% азида натрия. Реакцию проводят в течение ночи при 4°С с встряхиванием. Конъюгированную с антителом сефарозу 8 раз отмывают RIPA-буфером, затем трижды отмывают PBS и подвергают электрофорезу в 15%-ном SDS-PAGE. Белки переносят на нитроцеллюлозу и проводят Вестерн-блотгинг с биотинилированным иммуноочищенным антителом против рекомбинантного белка. Второе антитело представляют собой HRP-стрептавидин, и для выявления реакции используют ECL.

Для количественного определения ОВ в сыворотке крови мыши к 100 мкл плазмы крови C57BL/6J ob/ob добавляют возрастающие количества рекомбинантного белка ОВ мыши с восстановленной структурой (0.01; 0.1; 0.5; 2.0; 15.0 нг) и инкубируют сыворотку при 4°С в течение 3 ч с протеин А сефарозой, конъюгированной с антителом. После интенсивного отмывания буфером А (10 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7.4; 100 мМ NaCl; 1% Тритона Х-100, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF) образцы ресуспендируют в буфере для образцов, наслаивают на 15%-ный SDS-PAGE и переносят на нитроцеллюлозную мембрану. Вестерн-блоттинг осуществляют при использовании иммуноочищенного биотинилированного антитела к аминотерминальному участку в качестве первого антитела и HRP-стрептавидина в качестве второго антитела с последующей ECL-детекцией. Цитоплазматические экстраты приготавливают путем гомогенизации жировой ткани в буфере NDS (10 мМ Трис, рН 7.5, 10 мМ NaCl, 60 мМ ICCI, 10 мМ спермина, 0.5 мМ спермидина, 14 мМ -меркаптоэтанола, 0.5 мМ ЭГТА, 2 мМ ЭДТА, 0.5% NP-40) и удаляют ядра центрифугированием при 700 d.

Иммунопреципитацию осуществляют, как описано выше, за исключением того, что используют иммуноочищенные антитела к ОВ человека. Для ELISA 100 мл 1 мг/мл раствора иммуноочищенного антитела к ОВ человека растворяют в забуференном боратом PBS и помещают на ночь в планшеты для микротитрования (Corning cat. # 2595) при 4°С. Затем планшеты 4 раза отмывают боратным физиологическим раствором, содержащим 0.05% Твина-20, и удаляют избыток жидкости. Планшеты блокируют инкубированием в течение 2 ч при комнатной температуре, добавляя в каждую лунку 240 мл боратного физиологического буфера, содержащего 0.3% желатины, и затем отмывают и высушивают. Известные количества раскрученного белка ОВ человека или образцы плазмы крови в объеме 100 мл инкубируют в отдельных лунках в течение ночи при 4°С. После отмывания планшеты инкубируют при добавлении 100 мл биотинилированного иммуноочишенного антитела к белку ОВ человека (0.1 мг/мл в желатин-боратном буферном растворе) в течение 4 ч при комнатной температуре. После отмывания в планшеты добавляют пероксидазу хрена (HRP), конъюгированную со стрептавидином (0.1 мг/мл в боратном буфере, 0.3% желатины). Субстрат для HRP (ABTS, 0.3 мг/мл и Н2О2, 0.01% в лимонной кислоте) используют для выявления реакции, и О. D. измеряют при 414 нМ для количественного определения связавшегося антитела.

Кодирующие последовательности гена ОВ мыши и человека PCR-амплифицируют из плазмид, содержащих ОВ кДНК-последовательности, и субклонируют в плазмиду pPIC.9 (Invitrogen). 5'-праймер человека имеет структуру

5' GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAG 3'

(SEQ ID NO:34),

3'-праймер имеет структуру

5' GCGCGAATTCTCAGCACCCAGGGCTGAGGTC 3'

(SEQ ID NO:35).

5'-праймер мыши имеет структуру

5' GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCTATCCAGAAAGTCCAGG 3'

(SEQ ID NO:36) и

3'-праймер имеет структуру

5' GCGCGAATTCTCAGCATTCAGGGCTAACATC 3'

(SEQ ID NO:37).

5'-праймер человека и мыши содержит Xho I сайт на 5'-конце, а в векторе pPIC9 содержится кодирующая последовательность для последних 4 аминокислот сигнальной последовательности -спаривающего фактора. Данный вектор направляет секрецию продуктов гетерологично экспрессирующихся генов из клетки в культуральную среду. 5' PCR-праймер также включает первые 19 нуклеотидов открытой рамки считывания гена ОВ после сайта отщепления сигнальной последовательности перед аминокислотой аланином в положении 21. 3'-праймер содержит EcoR I - сайт на 5'-конце, который расположен сразу же (немедленно) после последовательностей, комплементарных возможному стоп-кодону ОВ. Условия PCR были следующими: денатурация в течение 1 мин при 94°С, отжиг в течение 1 мин при 55°С и удлинение в течение 2.5 мин при 72°С. Мало циклов PCR (15 циклов) и строго-считывающую полимеразу PFU (Stratagene) использовали для ограничения числа PCR-генерируемых мутаций. Продукты PCR обрабатывали Xho I и EcoR I и клонировали в аналогичным образом расщепленный вектор рР1С.9. Все конструкции секвенировали по двум цепям, чтобы убедиться в отсутствии PCR-генерированных мутаций. Клоны трансфицировали в клетки Pichia pastoris (His) методом сферопластов и отбирали на среде с дефицитом гистидина. Примерно 200 клонов человека и мыши было скринировано на высокопийное встраивание методом исследования гибридизации колоний. Высокопийные клоны затем анализировали на экспрессию OB, первоначально окрашивая Кумасси синим, которое показало наличие нового 16-кДа белка в культуральной среде трансформированных дрожжей. 16-кДа полоса представляла собой ОВ, как было выявлено с помощью антител к ОВ белку, полученному в бактериальной системе экспрессии. Рекомбинантные белки затем очищали с помощью двухсталийного метода очистки, описанного ниже. Масс-спектрометрию и обработку цианоген бромидом осуществляли, как описано Beavis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6873-6877 (1990).

Полную кодирующую последовательность OB генов ОВ человека и мыши, которая является С-концевой по отношению к сигнальной последовательности, субклонировали в вектор экспрессии pET15b (Novagen) и экспрессировали на высоком уровне в Escherichia coli (BL21 (DE3) plYsS) с помощью Е7 РНК-полимеразной системы (Studier et al., Meth. Enzymology, 185: 80-89 (1990)). Клетки выращивали при 30°С до поглощения 0.7 при 595 нМ, индуцировали 0.5 мМ изопропил--D-тиогалактопиранозидам в течение ночи и затем собирали низкоскоростным центрифугированием. Лизис осуществляли тремя циклами замораживания-оттаивания и ДНК расщепляли ДНКазой. Мембранную экстракцию проводили при отработке препарата ультразвуком и солюбилизации детергентом, полученный осадок телец включения растворяли в 6М гуанидин - HCl, 20 мМ HEPES, рН 8.4. Рекомбинантные ОВ белки очищали в денатурирующих условиях методом IMAC при использовании Ni-ионной аффинной колонки и отмывания возрастающими количествами имидазола. Очищенный денатурированный ОВ белок хранили в 6М гуанидин - HCl, 10 мМ ацетате натрия (NaAc), рН 5, и восстанавливали с помощью 2 мМ DTT при комнатной температуре в течение 1ч. Денатурацию проводили путем разбавления восстановленного белка в 20%-ном глицероле, 5 мМ CaCl2, 5 мМ NaAc, рН 5 при смешивании и инкубации при комнатной температуре в течение 8-12ч. После денатурации рН доводили до 8.4 добавлением Триса до 10 мМ и гексагистидиновую метку удаляли путем расщепления тромбином. Расщепленный ренатурированный белок повторно очищали методом IMAC для отделения от тромбина и нерасщепленного белка слияния. Расщепленный ренатурированный белок элюировали с Ni-анион аффинной колонки 40 мМ имидазолом, в то время как тромбин и нерасщепленный белок слияния элюировали 0.2 мМ имидазолом. Продукт затем концентрировали, обрабатывали 100 мМ ЭДТА и 10 мМ феррицианидом калия и затем очищали гель-фильтрацией при использовании супердекса Pharmacia на колонке 75 16/60.

Исследование Эллмэна проводили, как описано Ellman, Biochem. Biophis., 82 70: 77 (1959). Реагент Эллмэна получали растворением 39.6 мг 5.5'-дитиобис (2-нитробензоловой кислоты) (DTNB) в 10 мл 0.05 М фосфата, рН 8. Калибровочную кривую строили при разбросе концентраций 10-120 мМ свободного сульфгидрила (при использовании 1 мМ исходного раствора восстановленного DTT) при 412 нМ. Каждое исследование проводили при использовании 0.02 мл реагента Эллмэна и общем объеме реакционной смеси 0.5 мл. Определенный коэффициент экстинции составлял 12974 M-1см-1 для свободной сульфгидрильной группы (коэффициент корреляции 0.99987), что находится в пределах 5%-ной ошибки по сравнению с ранее выявленным значением 13600 M-1см-1.

50 мл очищенного гель-фильтрацией белка в концентрации 2 мг/мл, соответствующей концентрации свободного сульфгидрила около 24 мМ в конечной реакционной смеси, исследуют методом Эллмэна. В конечном растворе поглощение при A412 составляет около 0.02, позволяя предположить, что два цистеиновых остатка в белке окислены с образованием цистина или что их свободные сульфгидрильные группы полностью погружены в недоступное ядро скрученного белка. Аналогичные результаты были получены при осуществлении такого же исследования на нескрученном белке в присутствии 6М гуанидин - HCl.

Мышей индивидуально содержали в свободном от патогенов окружении и приучали к диете, содержащей 35% (вес на вес) лабораторного питания для грызунов 5001 (РМР Feeds, Inc.), 5.9% (вес на вес) пудинга из крахмальной муки (General Foods) и 59.1% воды, энергетическая ценность которой составляет 1.30 ккал/г. Пищу стерилизуют автоклавированием и упаковывают в 60-мм пластиковые чашки, которые закрепляют на поверхности 100-мм чашек Петри. Крахмальный пудинг придает пище консистенцию пасты, и поэтому животным трудно разбрасывать ее по клетке. Свежую порцию еды помещают в клетку каждое утро, а предыдущую порцию убирают и взвешивают. Разница в весе последующей и предыдущей порцией составляет величину ежедневного потребления пищи животными. Влияние рекомбинантного белка на потребление пищи и вес тела определяют у трех штаммов мышей: C57Bl/6J ob/ob, C57Bl/Ks db/db и CBA/J+/+, купленных в Jackson Laboratory. Тридцать мышей каждого штамма разделяли на группы по 10 животных. Одной группе каждого штамма ежедневно интраперитонеально (i. р.) вводили раскрученный бактериальный ob белок с восстановленной структурной в дозе 5 мг/г/день в 300 мкл PBS. Вторая группа получала i. р. инъекции того же самого объема PBS. Эти контрольные животные получали инъекции PBS диализата рекомбинантного белка. PBS очищали от эндотоксина при использовании колонки Acticlean ETOX. Третья группа животных не получала инъекций. Потребление пищи регистрировали ежедневно, а вес тела - регулярно с интервалом в 3.5 недели. Для парного эксперимента потребление пищи в отдельной группе ob мышей совпадало с ежедневным значением, которое определялось для мышей ob, получающих белок.

Результаты

OB белок циркулирует в плазме крови человека, мыши и крысы

Рекомбинантный белок ОВ получают с помощью рЕТ 15b бактериального вектора экспрессии (Novagen) и путем клонирования в клетках Pichia pastoris, дрожжевой системе экспрессии, которая секретирует рекомбинантные белки непосредственно в культуральную среду. Белок ob, экспрессируемый в дрожжах, включает 146 аминокислот с карбокси-концевого участка по отношению к сигнальной последовательности. Кроликов иммунизируют бактериальными белками (HRP, Inc.). Антитела очищают на колонке с антигеном (Research Genetics) и используют для иммунопреципитации и Вестерн-блоттинга белка из плазмы крови и жировой ткани.

Белок ОВ из плазмы крови мыши мигрирует с явным мол. весом 16 кДа в SDS-PAGE. Электрофоретическая подвижность идентична таковой рекомбинантного белка ОВ, секретируемого дрожжами после удаления сигнальной последовательности (Фиг.24А). Белок не выявляется в плазме крови мышей C57BL/6J ob/ob, которые имеют нонсенс-мутацию в кодоне 105. В некоторых антисыворотках не удается идентифицировать полипептидную цепь с удаленным остатком в положении 105, предсказанную на основе кДНК-последовательности.

В плазме крови мышей db/db обнаруживается десятикратный уровень ОВ по сравнению с контролем (Фиг.24А). Иммунопреципитация плазмы крови крыс дикого типа и fa/fa выявляет двадцатикратное увеличение уровня белка ОВ у мутантных животных по сравнению с животными дикого типа (Фиг.24В). Мутация db приводит к фенотипу ожирения, идентичного тому, который наблюдается у мышей ob (Bahary et al., 1990, см. выше). Крысы fatty становятся ожиревшими в результате рецессивной мутации в гене, гомологичном db (Truett et al., 1991, см. выше). Для определения количественного уровня OB в плазме крови мыши к сыворотке добавляют возрастающие количества рекомбинантного белка и проводят иммунопреципитацию (Фиг.24С). Линейное увеличение интенсивности сигнала на Вестерн-блотах соответствует увеличению количества рекомбинантного белка. Сравнение интенсивности сигнала нативного белка в плазме крови мыши с контролем показывает, что уровень циркулирующего белка ОВ у животных дикого типа составляет около 20 нг/мл. Эти данные демонстрируют, что иммунопреципитацию и Вестерн-блоттинг проводили в условиях избытка антител. Увеличенные уровни белка ОВ также обнаружены в белковых экстрактах жировой ткани мышей db/db в сравнении с контролем (Фиг.24D). Как ожидается для секретируемого белка, белок жировой ткани выделяется в составе мембранной фракции (данные не показаны).

Образцы плазмы крови шести не страдающих ожирением индивидуумов с индексом массы тела менее 25 (BMI=вес/рост) иммунопреципитировали с помощью имуноочищенных антител к белку человека. Иммунопреципитированный материал мигрирует с электрофоретической подвижностью, идентичной той, которая характерна для белка человека из 146 аминокислот, экспрессированного в дрожжах. В пределах шести образцов интенсивность сигнала существенно варьирует (Фиг.25А). Денситометрия авторалиографий выявляет примерно пятикратные различия в уровнях белка у индивидуумов НР1 и НР6 со средними значениями у других испытуемых. Фермент-связанный иммуноанализ (ELISA) осуществляли при использовании иммуноочищенного антитела и бактериального белка с восстановленной структурой в качестве стандарта (см. ниже). Полученная стандартная кривая приведена на Фиг.25В. В данном методе исследований уровни ОВ белка в плазме крови в шести образцах варьировали между 2-15 нг/мл (Фиг.25С). Уровень ОВ белка в плазме крови индивидуума НР6 выходил за пределы линейного ряда в иммуноанализе и составлял 15 нг/мл. Указанные количественные различия коррелировали с полученными методами Вестерн-блоттинга.

Предварительные данные позволяют предположить, что лептин может циркулировать, по крайней мере частично, в виде комплекса с другим белком или белками. Заключение основывается на гетерогенности формы кривой титрования для сыворотки по сравнению с рекомбинантным стандартом. Анализ большого количества лептина, иммуноочищенного на колонке с антителами кролика к ОВ путем HPLC гель-фильтрации в денатурирующих и неденатурирующих условиях с последующим осуществлением ELISA и SDS-PAGE, позволяет предположить, что полипептид ОВ представляет собой высокомолекулярный комплекс. Однако эти данные остаются предварительными. Белок, связывающий полипептид ОВ, если он вообще существует, пока не охарактеризован.

Структурные особенности ОВ белка

Поскольку белок ОВ имеет два цистеиновых остатка, он может формировать внутри- и межмолекулярные дисульфидные связи в окисляющих условиях in vivo. Вестерн-блоттинг повторяют в отсутствие или при добавлении восстанавливающих агентов к образу буфера. В обоих случаях белок ОВ в сыворотке человека мигрирует как мономер (данные не показаны). В невосстанавливающих условиях белок, иммунопреципитированный из сыворотки мышей db, выявлялся в положениях, соответствующих как мономеру 16 кДа, так и димеру с мол. весом около 32 кДа (Фиг.26А). Полоса, соответствующая соединению с большим мол. весом, исчезала в восстанавливающих условиях. Это позволяет предположить, что фракция белка ОВ мыши циркулирует в виде соединения с большим мол. весом за счет образования межмолекулярной дисульфидной связи. Примерно 80% белка ОВ мыши циркулирует в виде 16 - кДа белка и 20% - в форме 32-кДа белка.

Те же самые молекулярные формы выявляются, когда белки человека и мыши экспрессируются в дрожжах Pichia pastoris (Abrams et al., Immunol. Rev.,: 5-24 (1992)). В данных исследованиях ДНК последовательность, соответствующая 146 аминокислотам зрелого белка ОВ, была клонирована в положении «downstream» по отношению к сигнальной последовательности -спаривающего фактора дрожжей в векторе pPIC.9 (Invitrogen). Белок очищали из среды дрожжевых штаммов, экспрессирующих белки человека и мыши, и подвергали электрофорезу в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях (Фиг.26А). Белок мыши экспрессировался в дрожжах главным образом в виде димера в невосстанавливающих условиях и только в виде мономера в присутствии восстанавливающих агентов. Рекомбинантный белок человека мигрировал в положении мономера в обоих условиях (данные не показаны).

Очищенный белок человека, экспрессируемый в клетках Pichia, имеет мол. массу 16.024±3 Да, как определено масс-спектрометрией (Beavis, 1990, см. выше). Эти данные согласуются со значением мол. массы, вычисленной на основе аминокислотной последовательности белка, содержащего один внутримолекулярный дисульфидный мостик (16.024 Да). Масс-спектрометрический анализ с матрикс-опосредованной лазерной десорбцией применительно к расщепленным цианоген бромидом белковым продуктам, показывает, что цистеины 117 и 167 соединены посредством внутримолекулярной дисульфидной связи (Фиг.26В). Цианоген бромид отщепляет карбокси-концевой участок по метиониновым остаткам.

Получение и характеристика биоактивного рекомбинантного белка

Белок ОВ мыши экспрессируется в Е. coli с помощью плазмиды рЕТ 15b в виде нерастворимого белка слияния из 20 аминокислотных остатков с N-концевой гекса-гистидиновой меткой, содержащей сайт расщепления тромбином. Бактериальные тельца включения солюбилизируют с помощью гуанидин-HCl и очищают в денатурирующих условиях при использовании ион-аффинной хроматографии с иммобилизированным металлом (IMAC) (Фиг.27). Очищенный денатурированный белок слияния восстанавливают, разводят и заново обеспечивают формирование структуры в водной среде при комнатной температуре. После расщепления тромбином ренатурированный белок ОВ мыши, содержащий четыре дополнительных N-концевых остатка (Gly-Ser-His-Met; SEQ ID NO:38), повторно очищают путем IMAC до >98% гомогенности, как подтверждается SDS-PAGE и масс-спектрометрией. Масс-спектрометрия с матрикс-опосредованной лазерной десорбцией выявляет значение массы 16.414±3 Да (предсказанная масса составляет 16.415 Да). SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях, показывает наличие полос с одной явной мол. массой, а именно 16 кДа (данные не приведены).

Динамическое рассеивание света с помощью детектора Molecular Size DP801 (Protein Solutions, Inc.) показывает, что ренатурированный белок ОВ мыши в основном мономерен с небольшими агрегатами более высокого порядка. Белок обрабатывают ЭДТА и химически окисляют. Затем более высокомолекулярные структуры удаляют гель-фильтрацией. Дальнейшее динамическое рассеивание света показывает, что очищенный ренатурированный рекомбинантный белок ОВ мыши обладает монодисперсными свойствами. После диализа (PBS) бактериальный эндотоксин удаляют при использовании колонки Acticlean ETOX (Sterogene Bioseparations, Inc.). Конечный выход белка составляет 45 мг/мл.

Анализ Эллмэна применяют к очищенному, восстановленному рекомбинантному белку ОВ мыши для определения степени его окисления (Ellman, 1959, см. выше). Ренатурированный белок и раскрученный с помощью 6М гуанидина - HCl обнаруживает <0.5% свободного сульфгидрила, показывая, что мономерный продукт содержит внутримолекулярную дисульфидную связь. Это подтверждается масс-спектрометрией продуктов расщепления бактериального белка с восстановленной структурой с помощью цианоген-бромида (данные не показаны).

Биоактивность ОВ белка.

Очищенный ренатурированный рекомбинантный белок ОВ мыши ежедневно путем интраперитонеальных инъекций в дозе 5 мг/кг/день вводят мышам, разделенным на группы из 10 животных, а именно C57Bl/6J ob/ob (16 недель), C57Bl/Ks db/db (12 недель) и CBA/J+/+ (8 недель). Аналогичное количество животных получает PBS путем ежедневных инъекций. PBS, используемый для контрольных инъекций, получают из диализата после уравновешивания белка. Десять дополнительных животных трех штаммов не получают инъекций. Потребление пищи индивидуальными животными контролируется ежедневно и вес животных регистрируют с интервалами в 3-4 дня. Общие сведения, касающиеся потребления пищи и веса тела каждого животного из 9 групп мышей, показаны на Фиг.28A-F, а статистическая значимость указанных данных иллюстрируется Табл.1. Потребление пищи мышами C57Bl/6J ob/ob, которым инъецировали белок, было значительно снижено после первой инъекции и продолжало уменьшаться до пятого дня, когда стабилизировалось на уровне, эквивалентном примерно 40% потребления пищи животными, получавшими инъекции PBS (р<0.001). Животные, получавшие PBS, не теряли в весе за время исследования, составлявшее более 3 недель. Мыши C57Bl/6J ob/ob, получавшие белок, теряли около 10% веса после 5 дней (р<0.001). Данные животные продолжали терять в весе и после трех недель, когда вес ob животных, получавших белок, снизилась примерно до 60% первоначального веса (р<0.001). Отдельную группу мышей ob использовали в экспериментах по парному питанию с животными ob, получавшими белок. Данные Фиг.29В показывают, что животные в экспериментах по парному питанию значительно меньше теряли в весе, чем животные, получавшие рекомбинантный белок (р<0.02). Фотографии двух мышей, получавших инъекции белка или носителя, показывают огромное различие во внешнем виде животных как результат введения белка (Фиг.29В). Для определения дальнейших эффектов белка осуществляли аутопсию двух мышей в каждой группе животных. Тщательное обследование мышей ob, получавших белок, выявило существенное уменьшение содержания жира, так же, как и размера печени. Печень мышей ob, получавших инъекции PBS, весила 5.04 г и 5.02 г в противоположность 2.23 г и 2.03 г - весу печени животных, получавших рекомбинантный белок. По сравнению с бледной ожиревшей печенью мышей ob печень ob мышей, получавших белок, имела более темный цвет, характерный для нормального органа (Фиг.29С). Гистологические срезы печени показывают, что «необработанные» животные имели ожиревшую печень, что не было свойственно животным, получавшим белок (данные не приведены).

В противоположность ob мышам, не было существенных различий в весе тела или потреблении пищи у мышей C57Bl/Ks db/db, как получавших белок, так и контрольных животных, получавших носитель (Фиг.28A-F, Табл. 1). Мыши во всех трех группах db/db потеряли в весе 2-5г во время периода осуществления эксперимента. Среднее содержание глюкозы в крови db мышей измеряли с помощью глюкометра; оно составило >500 мг/дл у всех мышей, свидетельствуя о том, что у данных животных диабет развивался вторично по сравнению с ожирением. Инъекции мышам db прекращали через две недели.

У животных дикого типа наблюдалось небольшое, но значительное уменьшение веса тела после введения рекомбинантного белка (Фиг.28A-F, Табл. 1). Через 5 дней после инъекции белка мыши теряли в среднем 0.5г, в то время как контрольные мыши прибавляли 0.4г (р<0.02). В две последующие временные точки животные, получавшие белок, весили значительно меньше, чем мыши, получавшие ежедневные инъекции PBS. Значимость изменения веса уменьшалась в более поздние временные точки. У животных, потерявших вес, потребление пищи существенно отличалось от контрольных животных. Инъекции PBS имели небольшой, но существенный эффект на потребление пищи и вес тела у ob, db и животных дикого типа по сравнению с мышами, не получавшими инъекций (р<0.05).

Обсуждение

Предположение об эндокринной функции белкового продукта локуса OB впервые было высказано Коулмэном (Coleman), который показал, что вес тела мышей ob/ob уменьшается после парабиотического соединения с нормальными или db мышами (Coleman et al., 1978, см. выше). Результаты, приведенные выше, поддерживают указанную гипотезу, поскольку показывают, что белок ОВ циркулирует в кровотоке, а инъекции рекомбинантного белка снижают вес тела. Молекулярный вес продукта, кодируемого геном ОВ, примерно составляет 16 кДа, что эквивалентно аминокислотной последовательности из 146 аминокислот, которая является карбокси-концевой по отношению к сигнальной последовательности. Рекомбинантный ОВ белок не модифицируется при экспрессии в клетках Pichia pastoris. Экспрессия генов млекопитающих в Pichia в основном приводит к образованию правильной белковой структуры (Cregg et al., Bio/Technology, 11: 905-914 (1993)). Эти данные позволяют предположить, что ОВ белок не гликозилирован и не подвергается пост-трансляционному процессингу in vivo. Они не исключают возможности того, что белок ОВ нековалентно связан сам с собой или другими белками в плазме крови или жировой ткани. Несмотря на то что протеолитическое расщепление белка не исключается, формы белка ОВ с более низким мол. весом не обнаруживается в какой-либо антисыворотке при тестировании с помощью четырех антител к пептиду.

Белок ОВ имеет два цистеиновых остатка и циркулирует в виде мономера у человека и в виде диамера у мыши. Внутримолекулярная дисульфидная связь, типичная длл секретируемых молекул, обнаруживается, когда белок человека экспрессируется в дрожжах Pichia pastoris, позволяя предположить, что in vivo он находится в такой же форме. Данное предположение подтверждается биологической активностью рекомбинантного бактериального белка, у которого обнаружена внутримолекулярная дисульфидная связь. Белок ОВ мыши может выявляться в плазме крови как в виде мономера, так и в виде димера. Мономер и димер обнаруживаются при экспрессии белка ОВ в дрожжах; это показывает, что предрасположенность белка мыши образовывать димер является результатом различий в его первичной последовательности по отношению к белку человека. В то время, как очевидно, что мономер обладает биологической активностью, функциональная активность димера неизвестна.

Воздействие белка ОВ на потребление пищи и вес тела у мышей ob чрезвычайно существенно. Через три недели ob мыши, получающие ежедневные инъекции рекомбинантного белка, теряют 40% веса и потребляют пищи на 40% меньше по сравнению с контрольными животными. Более того, вес обработанных ob животных не восстанавливается и после завершения эксперимента. Результаты эксперимента по спаренному питанию свидетельствуют о том, что потеря веса наступает в результате воздействия белка ОВ как на потребление пищи, так и на расход энергии. Таким образом, отдельная группа животных ob, чье потребление калорий было ограничено по сравнению с ob мышами, получавшими белок, более существенно теряли в весе, чем животные, получавшие белок. Уменьшение потребления пищи мышами ob/ob до более низкого уровня, чем у животных дикого типа, в течение дня, когда животные получали ОВ белок, свидетельствует о том, что мыши ob/ob особенно чувствительны к воздействию данного белка. В действительности, ОВ рецептор может подвергаться повышенной регуляции у данных животных. Потребление пищи «обработанными» ob мышами становилось относительно постоянным после пяти дней «обработки». Если такое воздействие белка выходит на стабильный высокий уровень, то можно предположить, что белок имеет относительно продолжительный период полужизни (The Pharmacological Basis of Therapeutics pp. 19-45, Goodman and Ceilman, eds., Pergamon Press, New York, 1990). Указанное заключение согласуется с данными эксперимента по парабиозу (Coleman et al., 1978, см выше; Weigle, Int. J. Olesity, 12: 567-578 (1988)).

Влияние рекомбинантного белка на вес тела мышей дикого типа было незначительным, но статистически значимым в течение первых двух недель эксперимента. В то время как различие в весе между животными дикого типа, получавшими белок и PBS, выявлялось в более поздние временные точки, статистическая значимость данных существенно падала через три недели. Ранняя потеря в весе не считалась связанной с различием в потреблении пищи. Вероятно, определение потребления пищи было недостаточно точным для выявления пониженного результата, основанного на разнице в весе тела в 1 г, во время эксперимента. Указанные наблюдения отличны от таковых предварительных экспериментов, в которых грызунов дикого типа парабиотически объединяли с мышами db, крысами fa, крысами с нарушениями функций гипоталамуса, и крысами, страдающими ожирением в результате высококалорийной диеты (Coleman et al., 1978, см. выше; Harris et al., 1987, см. выше; Harris et al., «Физиологические и метаболические изменения у парабиотических партнеров среди крыс, страдающих ожирением», Hormones, Thermogenesis and Obesity, Lardy and Staatman, eds., Elsevier Science Publishing Co., New York (1989); Harvey, J. Physiol., 145: 336-352 (1959)). В каждом случае животные дикого типа приобретали анорексию и сильно теряли в весе. Поскольку уровни ОВ белка возрастали у db мышей и крыс fa и уровень ОВ РНК увеличивался у мышей с нарушениями функции гипоталамуса, представляется вероятным, что мыши дикого типа могут реагировать на ОВ, когда он циркулирует в плазме крови в достаточно высокой концентрации. Эти данные согласуются с предположением, что уровни введенного белка ниже эндогенных и приводят к установлению постоянного веса на уровне чуть ниже нормального. Количественное определение циркулирующих уровней белка ОВ у «обработанных» животных сможет помочь в рещении проблемы. В то время, когда еще не было возможности определить содержание белка в организме мыши с помощью иммунологического анализа, иммунопреципитация позволила предположить, что уровни циркулирующего белка ОВ не были значительно повышены у мышей дикого типа, получавших белок.

Меньшее воздействие белка у мышей дикого типа и отсутствие ответа у мышей db делает маловероятной возможность того, что введение белка имеет неспецифический или обратный эффект. Все мыши db теряли небольшое количество в весе за время «обработки» независимо от того, получали они белок ob или нет. Животные db страдали ярко выраженной гипергликемией, и потеря в весе, вероятно, являлась результатом диабета, а не эксперимента. У мышей C57Bl/Ks db/db часто развивался диабет, и они начинали немного терять в весе, когда их возраст приближался к возрасту животных, используемых в эксперименте (Coleman et al., 1978, см. выше). У мышей C57Bl/6J ob/ob сходного возраста не развивалось существенной гипергликелии. По видимому, данные фенотипические различия являлись результатом генетических различий между штаммами C57Bl/6J и C57Bl/Ks, несущими мутации (Coleman et al., 1978, см. выше).

Отсутствие возможности выявить усеченный белок из 105 аминокислот, предсказанный на основе кДНК последовательности гена OB, у мышей C57Bl/6J позволяет предположить, что мутантный белок деградирован или не транслируется. Однако не может быть исключена возможность того, что в используемой сыворотке указанный белок не определяется. Наблюдаемое десятикратное увеличение в уровнях белка ob у мышей db по сравнению с животными дикого типа может свидетельствовать о том, что белок ob сверхпродупируется, когда наблюдается устойчивость к его эффектам. Эти данные коррелируют с изучением OB мРНК. Как отмечалось, предварительные эксперименты показали, что мутации в генах db и db, которые картируются в гомологичных участках хромосом, приводят к сверхпродукции фактора плазмы, который снижает вес тела (Truett et al., 1991, см. выше; Coleman et al., 1978, см. выше; Hervey, 1959, см. выше). В обоих случаях можно было предположить, что мутантные животные устойчивы к эффектам белка ОВ. Эта возможность основывается на наблюдении, что белок ОВ не влияет на вес тела или потребление пищи, когда его вводят мышам db.

Ожирение у людей может быть связано с увеличенными уровнями белка ОВ в плазме крови тех индивидуумов, которые относительно нечувствительны к гормону. С другой стороны, пониженная экспрессия OB также способна приводить к ожирению, при котором могут быть обнаружены «нормальные» (т.е. неадекватно низкие) уровни белка. Таким образом, уровни OB белка в плазме крови человека могут быть маркером различных форм ожирения. У небольшой группы не страдающих ожирением индивидуумов с BMI<25 с помощью ELISA выявляются нанограммовые количества белка OB. Существенно, что выявляемые различия в концентрациях OB позволяют высказать предположение, что уровень экспрессии и/или чувствительности к белку, может играть определенную роль в регуляции веса тела.

Участок действия белка ОВ неизвестен. Белок влияет на потребление пищи и расход энергии. Это согласуется с клиническими наблюдениями, показывающими, что обе указанные системы регулируют вес тела (Leibel et al., N. Engl. J. Med., 332: 621-628 (1995); Keesey et al. «Метаболическое поддержание веса тела на определенном уровне», в кн. Association for Research in Nervous and Mental Diseal, pp. 87-96, Stun Kard and Stellar, eds., Raven Press, New York (1984)). Вероятно, что гипоталамус находится в положении «downstream» по отношению к пути ОВ, который контролирует вес тела, хотя возможно и прямое воздействие ОВ на различные органы.

ПРИМЕР 9: Увеличенная экспрессия РНК ОВ в адипоцитах мышей с нарушениями функции гипоталамуса и мутациями в db локусе

Продукт недавно клонированного гена ожирения мыши (ОВ) играет важную роль в регуляции количества жировой ткани. РНК ОВ специфически экспрессируется адипоцитами мыши различных типов жировой ткани in vivo, включая бурую жировую ткань. Она также экспрессируется в культивируемых преадипоцитных клетках 3Т3-442А, которые были индуцированы к дифференцировке. Мыши с повреждениями функции гипоталамуса, так же, как и мыши, мутантные по db локусу, экспрессируют в двадцать раз более высокий уровень РНК ОВ в жировой ткани. Указанные данные позволяют предположить, что db ген и гипоталамус находится в положении «downstream» по отношению к гену ОВ и пути ОВ, который регулирует количество жировой ткани, и согласуются с предварительными экспериментами, согласно которым локус db кодирует ОВ рецептор. У мышей db/db и животных с повреждениями гипоталамуса количественные различия в уровне экспрессии РНК ОВ коррелируют с содержанием липидов в адипоцитах. Молекулы, которые регулируют уровень экспрессии гена ОВ в адипоцитах, вероятно, играют важную роль в установлении веса тела, поскольку являются молекулами, опосредующими эффекты ОВ на его участок действия.

Материалы и методы

Гибридизация in situ.

Белую жировую ткань идентичных абдоминальных участков мышей дикого типа (Wt) и db одновременно «обрабатывали» в соответствии с модифицированным методом, описанным Pichardson et al., Growth, Development and Aging, 56: 149-157 (1992). Коротко говоря, ткани фиксировали в течение 2ч при 4°С. Затем их дегидратировали путем последовательного помещения в этиловый спирт возрастающей концентрации (от 10% до 100%) на 5 мин в каждый раствор при 4°С. Дальнейшую инкубацию тканей в ксилоле (1 ч) и парафине (2 ч) проводили при 65°С. Заключенную в парафин жировую ткань Wt и db/db разрезали и помещали на предметные стекла. Затем срезы прогревали при 65°С в течение 1ч, обрабатывали ксилолом и последовательно проводили через растворы этанола в концентрации от 100% до 50% (3 мин в каждом) при комнатной температуре. Антисмысловую РНК-пробу гена ОВ синтезировали in vitro транскрипцией линеаризованной кодирующей последовательности гена ОВ в положении «upstream» по отношению к полимеразному промотору Sp6 РНК. Гибридизацию in situ осуществляли в точном соответствии с методом Schaeren-Wiemers et al., Histochemistry, 100: 431-440 (1993).

Получение РНК и клеточная культура.

Общую РНК и Нозерн-блоты получали, как описано. Стромальные васкулярные клетки и адипоциты получали в соответствии с методом Родбелла, а РНК из обеих фракций получали согласно Dani et al., Moll. Cell. Endocrinol., 63: 199-208 (1989); Rodbell, J. Biol. Chem., 239: 375-380 (19 ). После субклонирования клетки 3Т3-F 442 выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко, содержащей 10% сыворотки плода крови (стандартная среда) (Dani et al., «Методики молекулярной биологии в изучении дифференцировки адипоцитов», в кн. Ожирение в Европе, vol. 88, pp. 371-376, Bjontorp and Rossner, Eds., John Libley Company Ltd., London, England (1989)). На стадии монослоя клетки переносили в стандартную среду с добавлением 2 нМ трийодтиронина (Т3) и 17 нМ инсулина. Через 12 дней РНК получали, как описано выше.

Обработка золотой тиоглюкозой (GTG).

Самкам мышей CBA/J двухмесячного возраста проводили однократную интраперитонеальную инъекцию золотой тиоглюкозоы (Sigma Каталог № АO632) в дозе 0.2 мг/г в физиологическом растворе. Мышей взвешивали через один месяц после «обработки». РНК выделяли из жировой ткани тех животных, у которых вес увеличивался более чем на 20г, после введения GTG.

Результаты

Как недавно было обнаружено, ген ОВ экспрессируется в жировой ткани (Zhang et al., Nature, 372: 425-432 (1994)). Поскольку жировая ткань состоит из клеток многих топов, включая адипоциты, преадипоциты, фибробласты и васкулярные клетки, гибридизацию in situ проводят на срезах жировых комков придатка яичка нормальных животных с антисмысловыми ОВ рибопробами и смысловыми ОВ рибопробами (Richardson et al., 1992, см. выше; Wasserman, «Концепция жировой ткани как органа» в кн. под. ред. Rodahl, Issekutz «Жир как ткань», стр. 22-92, Me Graw Hill, New York (1964)). При использовании антисмысловой пробы позитивные сигналы выявлялись во всех адипоцитах среза (Фет. 30 - отметка Wt). Сигналы не обнаруживались, когда антисмысловую пробу гибридизовали со срезами мозга (данные не показаны). Степень гибридизации антисмысловой пробы со срезами жировой ткани мышей C57Bl/Ks db/db была значительно увеличена, подтверждая специфичность экспрессии РНК ОВ в адипоцитах и демонстрируя существенное увеличение уровня РНК ОВ в расчете на адипоцит у этих животных (Фиг.30 - отметка db/db). Мутанные мыши по локусу db страдали массивным ожирением как составляющей частью синдрома, фенотипически идентичного тому, который наблюдался у мышей C57Bl/6J ob/ob (Bahary et al., 1990, см. выше).

РНК ОВ не синтезируется в стромальных клетках жировой ткани, отделенных от адипоцитов. Как и ожидалось, клетки во фракции адипоцитов экспрессировали РНК ОВ, что было показано с помощью Нозерн-блоттинга (Фиг.31). Сходные результаты были получены и с помощью RT-PCR (данные не показаны). Эти данные подтверждают заключение, что только в адипоцитах экспрессируется ген ОВ. Результаты, полученные при использовании циркулирующих адипоцитов, свидетельствуют в пользу такого заключения. В указанных экспериментах 3T3-F442A клетки культивировали в условиях, приводящих к ассимиляции липидов, что является частью клеточной программы дифференцировки адипоцитов. РНК ОВ не экспрессировалась ни в экспотенциально растущих клетках, ни в преадипоцитах 3T3-F442A в состоянии монослоя, в которых экспрессируется ранние маркеры, в то время как дифференцировка указанных клеток в адипоциты приводит к экспрессии выявляемых уровней РНК ОВ (Фиг.31) (Dani et al., J. Biol. Chem., 264: 10119-10125 (1989)). Уровень РНК ОВ чрезвычайно чувствителен к условиям культивирования, поскольку мРНК не выявлялась на поздних стадиях, когда клетки после стадии монослоя не подвергались воздействию инсулина.

Исследования по гибридизации показали, что РНК ОВ экспрессируется in vivo в нескольких различных жировых депо, например, в придатке яичка, а также в параметриальных, абдоминальных, околопочечных и паховых жировых комках (Фиг.32А). Точный уровень экспрессии РНК ОВ в каждом жировом депо незначительно варьировал, в паховых и параметриальных жировых комках он был несколько ниже. РНК ОВ также экспрессировалась в бурой жировой ткани, несмотря на то что уровень экспрессии здесь был в 50 раз ниже по сравнению с другими депо жировой ткани. Эти количественные различия коррелировали с предварительно установленными различиями в размерах среди клеток различных жировых депо (Johnson et al., J. Lipid Res., 13: 2-11 (1972)). Количество РНК ОВ в бурой жировой ткани не зависело от холодового воздействия (Фиг.32В). В данном эксперименте уровень РНК несвязавшегося белка ОВ (UCP) увеличивался в бурой жировой ткани после холодового воздействия, в то время как уровень РНК ob не изменялся (Jacobsson et al., J. Biol. Chem., 260: 16250-16254 (1985)). В совокупности указанные сведения подтверждают, что все адипоциты способны продуцировать РНК OB, и демонстрируют различный уровень экспрессии в различных жировых депо. Полученные данные свидетельствуют в пользу предположения, что уровень кодируемого белка коррелирует с общим количеством жировой ткани.

Уровень РНК OB у мышей db/db и мышей с нарушением функции гипоталамуса измеряли во время эксперимента. Повреждения вентромедиального гипоталамуса (VMH) приводили к ожирению, как к составляющей синдрома, сходного с наблюдавшимся у мышей ob/ob и db/db (Bray et al., Metabolism, 24: 99-117 (1975)). Эксперименты по парабиозу позволяют предположить, что такие повреждения приводят к сверхэкспрессии образующегося в крови фактора, супрессирующего потребление пищи и вес тела (Hervey, 1959, см. выше). Сходные результаты наблюдаются, когда мутантные по локусу db мыши парабиотически объединяются с нормальными мышами. Это позволяет предположить, что ОВ рецептор может кодироваться db локусом (Coleman et al., 1978, см. выше). Таким образом, ожирение, развивающееся в результате VMH-повреждений и мутации в локусе db, может обусловливаться устойчивостью к действию белка ОВ. Если это так, то вторичное увеличение уровней ОВ в жировой ткани может быть предсказано.

Повреждения гипоталамуса индуцировали у самок мышей СВА при введении химически чистой золотой тиоглюкозы (GTG) Debons et al., Fed. Proc., 36: 143-147 (1977). Введение GTG приводило к специфическим повреждениям гипоталамуса, особенно в вентромедиальном гипоталамусе (VMH), с последующим развитием ожирения в течение нескольких недель. Обычно однократная интраперитонеальная инъекция GTG в дозе 0.2 мг/г веса тела приводила к развитию ожирения в течение 4 недель. Самкам мышей CBA/J одномесячного возраста (20-25г) вводили GTG, и последующая прибавка в весе «обработанных» и контрольных животных приведена в Табл. 2. РНК получали из жировой ткани мышей db/db и животных, получавших GTG, прибавлявших в весе более 20 г. Нозерн-блоттинг показал двадцатикратное увеличение уровня РНК ОВ у двухмесячных мышей db/db и мышей, получавших GTG, по сравнению с нормальными животными (Фиг.33).

Таблица 2
Прибавление в весе у мышей, которым вводили GTG
контроль (n=41)		GTG (n=93)
<10г	41.0 (100%)	4.0 (4%)
10-20г	0.0 (0%)	15.0 (16%)
>20г	0.0 (0%)	74.0 (80%)

Самкам мышей CBA/J двухмесячного возраста вводили GTG (Sigma АO632) интраперитонеально в физиологическом растворе в дозе 2.0 мг/г. Вес тела контрольных и экспериментальных животных регистрировали до и через один месяц после инъекции. Животных содержали по пять в клетке и кормили досыта. Прибавка в весе через один месяц после инъекции GTG показана в Табл.2. Животных с прибавкой в весе более 20 г. через один месяц после инъекции отбирали для дальнейших исследований.

Обсуждение

Продукт гена ОВ циркулирует в плазме крови человека и мыши и может действовать как регулятор количества жировой ткани. Дальнейшие исследования регуляции экспрессии и механизма действия ОВ будут иметь важное практическое значение для лучшего понимания физиологических путей регуляции веса тела.

Приведенные примеры показывают, что продукт гена ОВ экспрессируется исключительно адипоцитами во всех депо жировой ткани. Этот результат согласуется с возможностью белкового продукта гена ОВ соответствовать запасам липидов в организме. Более того, РНК ОВ подвергается двадцатикратной повышенной регуляции у мышей db и мышей с нарушениями гипоталамуса. У таких животных действительное увеличение уровня РНК ОВ в расчете на клетку скорее всего было даже выше, чем двадцатикратное, поскольку размер адипоцитов у данных животных был увеличен примерно в 5 раз (Фиг.30) (Debons et al., 1977, см. выше). Эти результаты позволяют предположить, что db ген и гипоталамус находятся в положении «downstream» по отношению к ОВ в пути, который контролирует вес тела, и согласуется с предположением, что рецептор ОВ кодируется локусом db (Coleman et al., Diabetologia 14: 141-148 (1978)). Молекулярное клонирование рецептора ОВ и/или гена db разрешит данную проблему. Увеличение уровня РНК ОВ у мышей db/db и получавших GTG также позволяет предположить, что продукт гена ОВ в жировых клетках выполняет неклеточную автономную функцию (Ashwell et al., Proc. R. Soc. Land., 195: 343-353 (1977); Ashwell et al., Diabetologia, 15: 465-470). Таким образом, если кодируемый белок действует непосредственно на жировые клетки, ингибируя их рост и дифференцировку, то сверхэкспрессия гена ОВ дикого типа в мышей, получавших GTG, должна приводить к фенотипической худобе.

Наиболее осторожное объяснение приведенных данных заключается в том, что белок ОВ функционирует как эндокринная сигнальная молекула, которая секретируется адипоцитами и действует, непосредственно или опосредованно, на гипоталамус. Прямые эффекты на гипоталамус требуют, чтобы существующие механизмы позволяли прохождение продукта гена ОВ через гемато-энцефалический барьер. Механизмы, задействующие околовентрикулярный орган и/или специфические переносчики, обеспечивают возможность воздействия на мозг молекулы такого размера, которая кодируется геном OB (Johnson et al., FASEB J., 1: 678-686 (1983); Baura et al., J. Clin. Invest., 92: 1824-1830 (1993); Pardridge, Endocrine Reviews, 7: 314-330 (1986)). Однако данную гипотезу следует интерпретировать с осторожностью, пока не будет идентифицирован механизм, посредством которого белок способен пересекать гемато-эпцефалический барьер. Более того, необходимо оценить возможные эффекты на другие органы-мишени.

Сигнал(ы) жировых клеток, ответственный(ые) за количественные различия в уровне экспрессии гена ОВ, пока еще неизвестны, однако они коррелируют с различиями в размере адипоцитов. Адипоциты мышей db/db в пять раз больше по сравнению с клетками нормальных животных, и содержание липидов на клетку составляет в них 1.0 мкг (Johnson et al., 1972, см. выше). Предварительные свидетельства показывают, что содержание липида в жировой клетке и/или размер является важным параметром, определяющим вес тела (Faust et al., Am. J. Physiol., 235: 279-286 (1978); Faust et al., Science, 197: 393-396 (1977)). Вероятно, каждая жировая клетка экспрессирует низкий уровень РНК ОВ, который в дальнейшем увеличивается пропорционально размеру клетки. Кроме того, возможно, что размер клетки не столь значительный параметр, но просто совпадает с внутриклеточным сигналом, который увеличивает экспрессию гена ОВ в адипоцитах мышей db/db и с VMH - повреждениями. В любом случае компоненты пути передачи сигналов, регулирующие синтез РНК ОВ, скорее всего играют важную роль в определении веса тела. Влияние среды и генов, уменьшающие уровень экспрессии ОВ, приводят к увеличению веса тела, так же, как и факторы, снижающие чувствительность к кодируемому белку. Специфические молекулы, регулирующие уровень экспрессии гена OB, еще неизвестны. Предстоит также выяснить механизмы генного контроля, которые приводят к количественному различию в уровне РНК ОВ, и природу регуляторных элементов гена ОВ. Индентификация молекул, которые регулируют экспрессию гена ОВ в адипоцитах, и тех, которые опосредуют эффекты белка на его участок (участки) действия, будут способствовать более глубокому пониманию физиологических механизмов, регулирующих вес тела.

ПРИМЕР 10: Характер экспрессии РНК и картирование на физиологическом, цитогенетическом и генетическом уровне хромосомы 7

РНК ОВ экспрессируется на высоком уровне в жировой ткани человека и на значительно низком уровне в плаценте и сердце. Ген ОВ человека картируется в контиге большой искусственной хромосомы дрожжей (YAC), которая происходит из хромосомы 7Q 31.3. Для дополнительного определения относительной локализации гена на основе сравнительного картирования генов человека и мыши в данном эксперименте идентифицировали 8 установленных микросателлитных маркеров в тесной физической близости от гена ОВ человека. Поскольку мутации в ОВ мыши могут приводить к синдрому, явным образом напоминающему патологическое ожирение у человека, данные генетические маркеры соответствуют важным инструментам для изучения возможной роли гена ОВ в развитии наследуемых форм ожирения у человека.

Материалы и методы

Нозерн-блоттинг

РНК получают из жировой ткани с помощью метода Chirgwin et al., Biochem., 18: 5294-5299 (1979). Нозерн-блоттинг, радиоактивное мечение и гибридизацию осуществляют, как описано ранее (Zhang et al., 1994, см. выше). Нозерн-блоты polyA+ РНК (MTN человека, MTN II человека, MTN II плода человека) получают от фирмы CLONETECH (Palo Alto, CA), так же, как и PCR-праймеры, используемые для генерации радиоактивномеченной акгиновой пробы человека.

Осуществление STS

Специфический PCR анализ последовательности с сайтами-мишенями (STS) осуществляют и оптимизируют в точности с описанным ранее (Green et al., PCR Methods Applic., 1991; Green et al., Genomics, 11: 548-564 (1991); Green, «Физическое картирование хромосом человека: генерация хромосом-специфической последовательности с сайтами-мишенями», в кн. Методы в молекулярной генетике Vol. 1, Анализ генов и хромосом (Часть A), pp. 192-210, под ред. Adolph., Academic Press, Inc., San Diego (1993); Green et al., Hum. Mol. Genet., 3: 489-501 (1994)). Каждую STS обозначают с помощью префикса «sWSS» за уникальным номером. Подробные сведения о 19 полученных STSs приведены в Табл. 3 с дополнительной информацией (например, условиями реакции PCR, полной ДНК последовательностью), полученной из генного белка и/или геномной базы данных (GDB). Для микросателлит-специфических STSs олигонуклеотидные праймеры, которые использовались в PCR-анализе (Табл. 3), соответствовали тем, которые использовались в генотипическом анализе (Табл. 4), или определенным (наиболее часто с помощью компьютерной программы OSP) (Hiller et al., PCR Metods Applic., 1: 124-128 (1991)) при использовании ДНК-последовательности, доступной из генного банка. В Табл. 3 приведены STSs в контиге YAC, содержащем ген ОВ человека.

В контиге YAC, содержащем ген ОВ человека, было картировано 19 STSs, специфичных для хромосомы 7. Все они приведены на Фиг.35. В каждом случае приведены обозначения «sWSS», соответствующие известные наименования, определяемое GDB название локуса, последовательности PCR-праймеров, размер STS и GDB-идентификационный номер. Источники STSs были следующие: конец YAC (изолированная концевая вставка YAC) (Green, 1993, см. выше), лямбда клон (выборочный, специфичный для хромосомы 7 лямбда клон) (Green et al., 1991, см. выше; Green, 1993, см. выше), генетический маркер (микросателлитный маркер, см. Табл. 2) (Green et al., 1994, см. выше), вставка YAC (случайно выбранный сегмент YAC вставки) и ген (геноспецифическая STS). Обратите внимание, что для некоторых генотипических маркерспецифических STSs PCR-праймеры, используемые для идентификации YACs (приведенных в данной таблице), отличаются от тех, которые используются для генотипического анализа (Табл. 4), поскольку детекция YACs, содержащих генетический маркер, не требует амплификации полиморфной последовательности самой по себе. Все указанные исследования PCR проводили при температуре отжига 55°С за исключением sWSS494, sWSS883, sWSS1529 и sWSS2619 (50°C), sWSS999 и sWSS1174 (60°C) и sWSSSOS (65°С). Дополнительные детали STS-специфического PCR-анализа можно найти в GDB.

На Фиг.35 показаны восемь микросателлитных маркеров, картированных в контиге YAC, содержащем ген ОВ человека. В каждом случае приведены обозначения маркера (указано как известное наименование в Табл.3), тип микросателлитной структуры (тетрануклеотип, «тетра»-повтор или (СА)n повтор), определяемое GDB название локуса, последовательности праймера, используемые для генотипического анализа на основе PCR праймерные последовательности и GDB идентификационные номера. Дополнительные детали, касающиеся PCR-анализа и полиморфизмов, можно найти в GDB.

Структуру (OB-специфической STS человека (sWW2619) определяли с помощью ДНК-последовательности, полученной из 3'-нетранслируемого участка кДНК. Рaх4-специфическую STS человека (sWSS808) получали следующим образом. Олигонуклеотидные праймеры, специфические к гену Рах4 мыши (GGCTGTGTGAGCAAGATCCTAGGA) и (SEQ ID NO:63) (GGGAGCCTTTGTCCTGGGTACAAAG) (SEQ ID NO:93) (Walther et al., 1991, Genomics 11: 424-434) (1991) использовали для амплификации фрагмента геномной ДНК человека размером 204 п. о. (продукт имеет тот же самый размер, что и полученный из геномной ДНК мыши). Указанный PCR-анализ не подходит для идентификации соответствующих YACs, поскольку сходный по размеру (200 п. о.) продукт также амплифицировался из дрожжевой ДНК. Однако анализ ДНК-последовательности продукта PCR, полученного из ДНК человека, выявляет замещения по 20 положениям среди проанализированных 156 оснований (данные не показаны). При использовании специфической для человека последовательности получали новый праймер (TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC) (SEQ ID NO:64), который использовали с первым из указанных выше Pax4-специфических праймеров (см. Табл. 3). Результирующий PCR-анализ Pax4-специфического гена человека не амплифицировал значимый продукт из дрожжевой ДНК и поэтому использовался для идентификации соответствующих YACs.

Таблица 3
Обозначение STS	Известное наименование	Локус	Источник	PCR-Праймеры	Размер (bp)	SEQ ID №	GDB ID №
sWSS1734		D7S2185	YAC конец	CAAGACAAATGAGATAAGG AGAGTTACAGCTTTACAG	72	39 40	G00-455-235
sWSS494		D7S2016	Лямбда клон	СТАААСАССТТТССАТТСС ТТАТАТТСАСТТТТССССТСТС	112	41 42	G00-334-404
sWSS883	UT528	D7S1498	Генетический маркер	TGCAGTAAGCTGTGATTGAG GTGCAGCTTTAATTGTGAGC	490	43 44	G00-455-262
sWSS2359	AFMa065zg9	D7S1873	Генетический маркер	AGTGTTGTGTTTCTCCTG AAAGGGGATGTGATAAGTG	142	45 46	G00-455-247
sWSS2336	AFMa125wh1	D7S1874	Генетический маркер	GGTGTTACGTTTAGTTAC GGAATAATGAGAGAAGATTG	112	47 48	G00-455-244
sWSS1218	AFM309yf1	D7S680	Генетический маркер	GCTCAACTGACAGAAAAC GACTATGTAAAAGAAATGCC	154	49 50	G00-307-733
sWSS1402		D7S1916	YAC конец	AAAGGGCTTCTAATCTAC CCTTCCAACTTCTTTGAC	137	51 52	G00-344-044
sWSS999		D7S1674	YAC вставка	TAAACCCCCTTTCTGTTC TTGCATAATAGTCACACCC	105	53 54	G00-334-839
sWSS1751		D7S2186	YAC конец	CCAAAATCAGAATTGTCAGAAG AAACCGAAGTTCAGATACAG	186	55 56	G00-455-238
sWSS1174	AFM218xf10	D7S514	Генетический маркер	AATATCTGACATTGGCAC TTAGACCTGAGAAAAGAG	144	57 58	G00-307-700
sWSS2061		D7S2185	YAC конец	GTTGCACAATACAAAATCC CTTCCATTAGTGTCTTATAG	200	59 60	G00-455-241

Продолжение таблицы 3
Обозначение STS	Известное наименование	Локус	Источник	PCR-праймеры	Размер (bp)	SEQ ID №	GDB ID №
sWSS2588		D7S2187	YAC конец	АТСАСТАСАСАССТААТС ССАТТСТАСАТТТССАСС	117	61 62	G00-455-253
sWSS808	Рах-4	Pax-4	Ген	GGCTGTGTGAGCAAGATCCTAGGA TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC	153	63 64	G00-455-259
sWSS1392	AFM206xc1	D7S635	Генетический маркер	CTCAGGTATGTCTTTATC TGTCTCTGCATTCTTTTC	75	65 66	G00-307-815
sWSS1148	AFM199xh12	D7S504	Генетический маркер	GACACATACAAACACAAG ATTGAGTTGAGTGTAGTAG	60	67 68	G00-307-652
sWSS1529		D7S1943	YAC конец	CAGGGATTTCTAATTGTC AAAAGATGGAGGCTTTTG	116	69 70	G00-334-119
sWSS2619	ОВ	OB	Ген	CGTTAAGGGAAGGAACTCTGG TGGCTTAGAGGAGTCAGGGA	106	71 72	G00-455-256
sWSS404		D7S1956	Лямбда клон	ACCAGGGTCAATACAAAG TAATGTGTCCTTCTTGCC	122	73 74	G00-334-251
sWSS2367	AFMa345wc9	D7S1875	Генетический маркер	CAATCCTGGCTTCATTTG AAGGTGGGTAGGATGCTA	81	75 76	G00-455-250

Таблица 4 микросателлитные маркеры в контиге УАС, содержащем ген ов человека
Обозначение маркера	Тип	Локус	Праймеры	SEQ ID №	GDB ID №
UT528	Tetra	D7S1498	TGCAGTAAGCTGTGATTGAG GTGCAGCTTTAATTGTGAGC	77 78	G00-312-446
AFMa065zg9	(CA)n	D7S1873	AGCTTCAAGACTTTNAGCCT GGTCAGCAGCACTGTGATT	79 80	G00-437-253
AFMa125wh1	(CA)n	D7S1874	TCACCTTGAGATTCCATCC AACACCGTGGTCTTATCAAA	81 82	G00-437-263
AFM309yf10	(CA)n	D7S680	CATCCAAGTTGGCAGTTTTT AGATGCTGAATTCCCAGACA	83 84	G00-200-283
AFM218xf10	(CA)n	D7S514	TGGGCAACACAGCAAA TGCAGTTAGTGCCAATGTCA	85 86	G00-188-404
AFM206xc1	(CA)n	D7S635	CCAGGCCATGTGGAAC AGTTCTTGGCTTGCGTCAGT	87 88	G00-199-240
AFM199xh12	(CA)n	D7S504	TCTGATTGCTGGCTGC GCGCGTGTGTATGTGAG	89 90	G00-188-280
AFMa345wc9	(CA)n	D7S1875	AGCTCTTGGCAAACTCACAT GCCTAAGGGAATGAGACACA	91 92	G00-437-259

Идентификация YACs путем скрининга, основанного на PCR

Большинство YACs, показанных на Фиг.35, были получены из коллекции клонов, высоко обогащенных ДНК хромосомы 7 человека (YAC-источник хромосомы 7) (Green et al., 1975 см. выше); с помощью основанной на PCR стратегии скрининга (Green et al., 1995, см. выше; Greena et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA, 87: 1213-1217 (1990)). В нескольких случаях клоны выделяли путем основанного на PCR скрининга (Green et al., 1990, см. выше) доступных геномных YAC библиотек человека, сконструированных в СЕРН (Dausset et al., Behring Inst. Mitt., 91: 13-20 (1992); Albertsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 4256-4260 (1990)) или ICI (Anand et al., Nucl. Acids Res., 17: 3425-3433 (1989); Anand et al., Nucl. Acids Res. 18: 1951-1956 (1990)). Каждый YAC обозначали с помощью «yWSS» впереди уникального номера.

Результаты и обсуждения

Исследование тканевой экспрессии гена ОВ человека с помощью Нозерн-блоттинга показало, что РНК ОВ экспрессируется на высоком уровне в жировой ткани человека и на значительно меньших уровнях в плаценте и сердце (Фиг.34). Размер РНК (примерно 4.5 kb) человека и мыши был аналогичным, так же, как и в каждой ткани, где она экспрессировалась. В указанных исследованиях наблюдалось пятикратное увеличение сигналов в 10 мкг РНК из обшей жировой ткани по сравнению с 2 мкг полиА+ плацентарной РНК. Пятикратное снижение сигнала наблюдалось в полиА+ РНК из сердца по сравнению с плацентой. По данным оценкам уровень ОВ РНК примерно в 250 раз ниже в плаценте, чем в жировой ткани. В указанном эксперименте РНК ОВ не выявлялась в какой-либо другой исследуемой ткани, включая мозг, легкие, печень, скелетные мышцы, почки и поджелудочную железу. Дополнительные эксперименты не выявили РНК ОВ в селезенке, тимусе, простате, семенниках, яичниках, тонком кишечнике, толстом кишечнике, лейкоцитах периферической крови, мозге плода, печени или почках (данные не показаны). Возможно, что ОВ экспрессируется на невыявляемом уровне (путем Нозерн-блоттинга) в этих тканях или других тканях, которые не были изучены. Наблюдавшийся характер экспрессии в тканях человека несколько отличается от характера экспрессии в тканях мыши, в которых РНК ОВ определялась почти исключительно в жировой ткани.

Сравнительное картирование участка гена ОВ в геномах человека и мыши.

Ген ОВ мыши локализован в проксимальной хромосоме 6 в участке, гомологичном области хромосомы 7q человека. Гены в пределах указанного сегмента включают (от проксимальной области к дистальной) Met протоонкоген, регулятор трансмембранной проводимости пистического фиброза (Cftr), спаренный бокс-содержаший ген 4 (Рах4), ОВ и карбоксипептидазу А (Сра) (Zhang et al., 1994, см. выше; Friedman et al., 1991, см. выше). У мыши генетическое картирование использовалось для демонстрации того факта, что Рах4 тесно связан с ob (Walther et al., см. выше; Zhang et al., 1994, см. выше). Обнаружено, что физическое расстояние между OB и Рах4 составляет примерно одну мегабазу (Mb) (Zhang et al., 1994, см. выше). На основании указанных сравнительных экспериментов по картированию ожидалось, что ген OB человека располагается между Рах4 и СРА на хромосоме 7q. Более того, поскольку CFTR (Heng et al., Cell Genet., 62: 108-109 (1993)) и Рах4 (Tamura et al., Cytogenet. Cell Genet., 66: 132-134 (1994)) картировались путем флуоресценции при гибридизации in situ (FISH) на 7q31.3 и 7q32 соответственно, наиболее вероятно, что цитогенетическая локализация гена OB человека будет «соседствовать» с границей 7q31.3-q32.

Картирование гена OB на хромосоме 7 человека

STS (sWSS2619), амплифицирующий небольшой сегмент 3'-нетранслируемого участка гена OB человека, использовался для скрининга набора клонов YAC, высоко обогащенных ДНК хромосомы 7 человека (Green et al., 1995a, Genomics 25: 170-183), и было идентифицировано 9 YACs (yWSS691, yWSS1332, yWSS1998, yWSS2087, yWSS3319, yWSS3512, yWSS4875, yWSS4970 и yWSS5004). Для подтверждения того факта, что указанные YACs содержат аутентичный ген OB человека, проводили два дополнительных эксперимента. Во-первых, каждый из YACs тестировали во втором PCR-анализе, специфичном для OB человека, и все YACs обнаружили положительный результат (данные не показаны). Во-вторых, дрожжевую ДНК из каждого клона расщепляли EcoRI и анализировали путем гибридизации после переноса на гель с помощью пробы из кДНК ОВ человека. Во всех случаях наблюдали одну полосу гибридизации, которая имела тот же самый размер в YACs и P1-клоне, содержащих ОВ ген человека (данные не показаны).

При использовании компьютерной программы SEGMAP (Green and Green, 1991, см. выше) vs. других данных, полученных на основе YACs, содержащих STS, и касающихся хромосомы 7 (Green et al., 1991, см выше; Green et al., 1994, см выше; Green et al., 1995, см выше), было обнаружено, что ген ОВ человека находится в пределах YAC-контига, показанного на Фиг.35. Данный контиг содержит 43 перекрывающихся YACs и 19 уникальных упорядоченных STSs. Более подробная информация о каждом из 19 STSs приведена в Табл. 3. Помимо OB-специфических STS, контиг также содержит STS (sWSS808), специфичную для гена Рах4 человека (Tamura et al. 1994, см. выше; Stapleton et al., 1993, Nature Genet. 3: 292-298), 7 STSs, полученных из YACs, специфичных для хромосомы 7, 2 STSs, полученных из лямбда-клонов, специфичных для хромосомы 7, и, что важно, 8 микросателлит-специфичных STSs. Дополнительные сведения об указанных 8 генетических маркерах, включая последовательности праймеров, использованных для генотипического анализа, приведены в Табл. 2. Обратите внимание, что существует избыточность основанных на YACs соединений в пределах контига (т.е. существуют 2 или более YACs, соединяющих каждую соседнюю пару STSs), что является строгим свидетельством в пользу относительного порядка STSs, показанного на Фиг.35.

Как показано на Фиг.35, предсказанная ориентация контига YAC, содержащего ген ОВ человека, такова, что sWSS1734 представляет собой наиболее центромерную STS {т.е. ближайшую к CFTR), в то время как sWSS2367 представляют собой наиболее теломерную STS (т.е. ближайшую к СРА). Эта ориентация преимущественно основана на данных по сравнительному картированию, которое помещает Рах4 проксимальнее и ОВ дистальнее синтетического блока в ДНК человека и мыши (Zhang et al., 1994, см. выше). Ген OB картируется около теломерного конца контига на основании расположения OB-специфической STS (sWSS2619).

В то время как контиг, показанный на Фиг.35, был выведен с помощью SEGMAP без учета размеров YAC (при расположении STSs на одинаковом расстоянии друг от друга), сходный анализ данных при использовании SEGMAP с учетом размеров YAC свидетельствует о том, что общий размер участка, перекрываемого контигом, как раз составляет 2 Mb (данные не показаны). Таким образом, в то время как все 8 микросателлит-специфических STSs (Табл. 4) находятся в пределах геномного интервала примерно в 2 Mb, 3 наиболее близкорасположенных к теломерному концу контига STSs (sWSS1392, sWSS1148, sWSS2367) особенно тесно связаны с геном ОВ самим по себе (возможно, в пределах интервала около 500 kb). В действительности, все 3 указанные выше STS находятся по крайней мере в одном из YACs, содержащих ген ОВ человека. Обратите внимание, что интервал между Рах4 (sWSS808) и ob (sWSS2619) человека оценивали примерно в 400 kb, в то время как данный участок у мыши имеет предсказанную протяженность примерно в 1 Mb (Zhang et al., 1994, см. выше). И наконец, 3 YACs в пределах контига (sWSS691, sWSS999 и SWSS2935) также анализировали методом FISH, и было обнаружено, что каждая из них гибридизуется исключительно с 7q31.3. Одна из указанных YACs (sWSS691) содержит OB-специфическую STS, в то время как 2 остальных клона содержат Pax4-специфическую STS. Последние результаты в целом согласуются с предварительными цитогенетическим картированием Рах4 человека в 7q32 (Tamura et al., 1994, см. выше). На основании этих данных ген OB человека может находиться в цитогенетической взаимосвязи с 7q31.3.

ПРИМЕР 11: Полипептид OB человека проявляет биологическую активность в организме мышей.

Мышам ob/ob, объединенным в группы по 10 животных, путем интраперитонеальной инъекции вводили рекомбинантный (полученный в бактериях) полипептид ОВ человека и мыши (10 мкг/г/день) или физиологический раствор. Через 4 дня группа животных, получавшая физиологический раствор, прибавила в весе 0.3 г. Группа животных, получавшая OB мыши, потеряла в весе 3.2 г. Группа, получавшая OB человека, потеряла в весе 2 г (р<0.01 по сравнению с животными, получавшими физиологический раствор). Указанные группы животных также исследовали на потребление пищи. Данные указанного эксперимента приведены в Табл.5; сведения о массе тела приведены в Табл. 6.

Таблица 5
Потребление пищи в день (г) ob/ob мышей, получавших полипептид ОВ (значение ± станд. откл.)
Вводимый препарат	День 0	День 1	День 2	День 3	День 4	День 5	День 6	День 7
Физиологический раствор	13.4±2.6	12.8	12.8	13.1	14.0	12.3	12.4	8.3
ОВ мыши	14.9	3.7	4.4	5.1	8.9	8.1	8.7	3.5
ОВ человека	14.3	10.3	8.7	7.0	8.9	5.3	3.8	13.0

Таблица 6
Вес тела и изменение веса тела мышей ob/ob, получавших полипептид ОВ (значение ± станд. откл.)
Вводимый препарат	Вес тела День 0	Вес тела День 4	Изменение в процентах (Дни 0-4)	Вес тела День 6	Изменение в процентах (Дни 0-6)
Физ. раствор	39.9±1.8	40.7±1.6	0.8±0.5	41.1±2.2	1.2±1.1
ОВ мыши	39.5±2.1	36.2±2.0	-3.3±1.2	36.3±2.2	-3.1±1.2
ОВ человека	39.5±2.0	37.6±1.7	-2.0±1.0	36.1±1.3	-3.5±1.3

Приведенные данные показывают, что ОВ человека обладает биологической активностью в организме мышей.

ПРИМЕР 12: Высокие дозы ОВ воздействуют на мышей дикого типа

Мышам дикого типа (C57Bl6J±?) интраперитонеально вводили рекомбинантный ОВ мыши в дозе 10 мкг/г/день, и вес тела животных определяли каждые четыре дня. Результаты исследований приведены в Табл.7.

Таблица 7
Вес тела (г) у нормальных мышей, получавших ОВ
Вводимый препарат	День 0	День 4	День 8	День 12	День 16
Физиологический раствор	22.6±1.4	22.2±1.2	22.5±1.3	23	22.5
ОВ мыши	22.4±1.5	20.6±1.5	20.8±1.3	20.8	21.8

Приведенные сведения показывают, что ОВ влияет на вес тела животных дикого типа животных дикого типа так же, как и мышей ob/ob, страдающих ожирением, хотя и в меньшей степени.

ПРИМЕР 13: Введение полипептида ОВ путем постоянной инфузии с помощью насоса

Данный пример показывает, что постоянная инфузия полипептида ОВ приводит к потере веса у нормальных мышей. Нормальные (не страдающие ожирением) мыши получали полипептид ob мыши посредством насоса с осмотической инфузией. Доза, составляющая 0.5 мг белка на 1 кг веса тела в день, приводила к потере веса тела в 4.62% (±1.34%) по отношению к базовой линии веса на 6ой день инфузии.

Материалы и методы

Животные

В эксперименте использовали животных дикого типа (+/+) С57В16. Животных содержали поодиночке в домашних условиях. Возраст мышей в начальной временной точке составлял 8 недель, и вес животных стабилизировался. Для каждого опыта использовали 10 животных (носитель и белок).

Определение потребления пищи и веса

Мышам давали специальное питание для грызунов (PMI Feeds, Inc.) в виде порошка (Allen town Caging and Equipment), что позволяет более точно определить количество потребляемой пищи по сравнению с обычно используемой подкормкой. Вес тела животных измеряли в одно и то же время (в 2 ч дня) каждый день в течение 6 дней. За базовый уровень принимали вес животных в день, предшествующий инфузии.

Клонирование ДНК ОВ мыши

Клонирование ДНК ОВ мыши для экспрессии в Е.coli осуществляли следующим образом. ДНК-последовательность, выведенную на основе опубликованной пептидной последовательности (Zhang et ai, 1994, см. выше, т.е. Пример 1, см. выше), обратно транслировали с использованием оптимальных кодонов Е.coli. Терминальными клонирующими сайтами были Xba I - Bam. HI. Рибосомальный связывающий энхансер и сильный рибосомальный связывающий сайт помещали впереди кодирующего участка. Дуплексную ДНК-последовательность синтезировали с помощью стандартных методов. Соответствующие клоны отбирали по выявлению экспрессии рекомбинантного белка и присутствию заданной ДНК-последовательности ОВ в резидентной плазмиде. Аминокислотная последовательность (и ДНК-последовательность) имеет следующую структуру:

Вектор экспрессии и штамм-хозяина

Для получения белка использовали плазмидный вектор экспрессии pCFM1656, Американская коллекция типовых культур (АТСС) № 69576. Указанную выше ДНК лигировали в вектор экспрессии pCFM1656, который линеаризовали Xba I и Bam HI. Затем вектором трансформировали клетки Е.coli, штамм хозяина FM5. Клетки Е.coli FM5 получены фирмой Amgen Inc., Thousand OaKs, CA, из штамма Е.coli К-12 (Bachmann et al., Bacterial Rev., 40: 116-167 (1976)) и содержат интегрированный репрессорный ген фага лямбда, с I857 (Sussman et al., С.R.Acad. Sci., 254: 1517-1579 (1962)). Получение вектора, трансформацию клеток и селекцию колоний осуществляют стандартными методами, например, как описано Sambrook et al., 1989, см. выше. Клетки-хозяева выращивают в среде LB.

Введение белка или носителя

Рекомбинантный полипептид ОВ мыши используют в настоящих исследованиях, как правило, в настоящих исследованиях, как правило, в концентрации около 0.9 мг/мл фосфатного буферного раствора, рН 7.4. Аминокислотная последовательность (кДНК последовательность) полипептида приведена только что выше. Белок или носитель (фосфатный буферный раствор, рН 7.4) вводят путем инфузии с осмотического насоса. Осмотические мининасосы Alzet (Alza, Palo Alto, CA, модель №1007D) хирургическим путем вживляют каждой мыши в подкожный карман в субкапсулярную зону. Насосы откалибровывают таким образом, чтобы вводить 0.5 мл белка /кг веса тела/день. Контрольным животным вводят фосфатный буферный раствор (рН 7.4) с помощью осмотического мининасоса.

Процесс ферментации. Для получения белка используют трехфазовую ферментационную методику, известную как «процесс дозирования и сортировки».

Дозировалие и сортировка. Источники азота и фосфата стерилизуют (путем повышения температуры до 122°С в течение 35 мин, 18-20 psi) в ферментационном сосуде (Biolafitte, 12л). После охлаждения асептически добавляют углерод, магний, витамины и следовые количества металлов. После культивирования в течении ночи (16 ч или более) бактерий, продуцирующих рекомбинантный белок мыши, 500 мл культуры (в LB бульоне) добавляют в ферментер.

Подкормка I. После достижения значения OD600 4.0-6.0 к культурам добавляют подкормку I. Глюкозу добавляют в ограниченном количестве для контроля скорости роста (). Автоматически систему (называемую распределительной контрольной системой) программируют для контроля скорости роста на уровне 0.15 регенераций hr-1.

Подкормка I. Когда OD600 достигает 30, температуру медленно увеличивают до 42°С и подкормку I заменяют на подкормку II, описанную ниже. Затем ферментацию продолжают в течение 10 ч с взятием образца каждые 2 ч. Через 10 ч содержимое ферментера охлаждают ниже 20°С и собирают центрифугированием.

Состав среды:

Основная среда:

10 г/л	дрожжевой экстракт
5.25 г/л	(NH4)2SO4
3.5 г/л	К2HPO4
4.0 г/л	КН2PO4
5.0 г/л	Глюкоза
1.0 г/л	MgSO4·7H2O
2.0 мл/л	Раствор витаминов
2.1 мл/л	Раствор следовых металлов
1.0 мл/л	Пеногаситель Р2000

Подкормка II:

50 г/л	Бакто-триптон
50 г/л	Дрожжевой экстракт
450 г/л	Глюкоза
8.75 г/л	MgSO4·7H2O
10 мл/л	Раствор витаминов
10 мл/л	Раствор следовых металлов

Подкормка II:

200 г/л	Бакто-триптон
100 г/л	Дрожжевой экстракт
110 г/л	Глюкоза

Раствор витаминов (основная среда, подкормка 1): 0.5 г биотина, 0.4 г фолиевой кислоты и 4.2 г рибофлавина растворяют в 450 мл Н2О и 3 мл 10 н. NaOH и разводят до 500 мл Н2О. Четырнадцать граммов пиридоксин-HCl и 61 г ниацина растворяют в 150 мл Н2О и 50 мл 10 н. NaOH и доводят до 250 мл Н2О. Пятьдесят четыре грамма пантотеновой кислоты разводят в 200 мл Н2О и доводят до 250 мл. Три раствора объединяют и доводят до 10 л общего объема.

Раствор следовых металлов (основная среда, подкормка I):

Хлорид железа (FeCl3·6Н2О):27 г/л

Хлорид цинка (ZnCl2·4H2O):2 г/л

Хлорид кобальта (CoCl2·6H2O):2 г/л

Молибдат натрия (NaMoO4·2H2O):2 г/л

Хлорид кальция (CaCl2·2Н2О):1 г/л

Сульфат мели (CuSO4·5H2O):1.9 г/л

Борная кислота (H3BO3):0.5 г/л

Хчорид марганца (MnCl2·4Н2О):1.6 г/л

Дигидратированный цитрат натрия: 73 г/л.

Очистка полипептида ОВ мыши

Очистку проводили следующим образом (если не указано обратное, все этапы проводят при 4°С):

1. Клеточная паста. Клеточную пасту Е.coli суспендируют в 5-кратном объеме 7мМ ЭДТА, рН 7.0. Затем клетки в ЭДТА разрушают двукратным пропусканием через жидкостной микрогомогенизатор. Разрушенные клетки центрифугируют при 4.2 k rpm в течение 1 ч в центрифуге Beckman JB-6, ротор J5-4.2.

2. Отмывание телец включения #1. Супернатант из полученного выше гомогената удаляют и осадок ресуспендируют в 5-кратном объеме 7 мМ ЭДТА, рН 7.0, и гомогенизируют. Смесь центрифугируют, как описано на стадии 1.

3. Отмывание телец включения #2. Супернатант полученной выше культуры удаляют, осадок ресуспенлируют в десятикратном объеме 20 мМ Триса, рН 8.5, 10 мМ DTT и 1%-ного дезоксихолата и гомогенизируют. Полученную смесь центрифугируют, как описано на стадии 1.

4. Отмывание телец включения #3. Супернатант полученной выше культуры удаляют, осадок ресуспендируют в десятикратном объеме дистиллированной воды и гомогенизируют. Полученную смесь центрифугируют, как описано на стадии 1.

5. Восстановление структуры. Осадок обрабатывают 15 объемами 10 мМ HEPES, рН 8.5, 1% саркозина натрия (N-лаурил саркозин) при комнатной температуре. Через 60 мин раствор добавляют к 60 мМ сульфата меди и далее раствор перемешивают в течение ночи.

6. Удаление саркозина. Восстанавливающую смесь разводят 5 объемами 10 мМ Трис-буфера, рН 7.5, и центрифугируют, как описано на стадии 1. Супернатант собирают и соединяют при перемешивании в течение 1 ч со смолой Dowex 1-Х4, 20-50 меш, хлоридная форма (при общем объеме разбавленной восстанавливающей смеси). Данную смесь наносят на колонку и собирают элюат. Удаление саркозина осуществляют с помощью HPLC.

7. Кислотные преципитаты. Собирают элюат, полученный на предыдущей стадии, рН доводят до 5.5 и инкубируют смесь в течение 30 мин при комнатной температуре. Полученную смесь центрифугируют, как описано на стадии 1.

8. Катионообменная хроматография. РН супернатанта, полученного на предыдущей стадии, доводят до 4.2 и наслаивают препарат на колонку с быстро текущей СМ серофазой. Используют солевой градиент в двадцати объемах колонки при 20 мМ NaOAC, рН 4.2, 0 М-1.0 М NaCl.

9. HIC-хроматография. Пиковые фракции, полученные на предыдущей стадии с помощью СМ- серофазы (контроль по излучению в ультрафиолете), добавляют к 0.2 М сульфата аммония. Обратный солевой градиент в 20-кратном объеме колонки получают при 5 мМ NaOAc, рН 4.2, 0.4 М-0 М (NH4)2SO4. Препарат концентрируют и подвергают диафильтрации в PBS.

Результаты

Ниже приведены различия в процентах между весом мышей C57Bl6J (8-недельный возраст) и базовым уровнем.

Таблица 8
Потеря веса при постоянной инфузии
Воемя (дни)	Носитель (PBS)	Рекомбин. полипептид ОВ
Дни 1-2	3.24±1.13	1.68±1.4
Дни 3-4	4.3±0.97	-2.12±0.79
Дни 5-6	4.64±0.96	-4.62±1.3

Как можно видеть, к концу 6 дня постоянной инфузии животные, получавшие ОВ полипептид, утратили более 4% веса тела по сравнению с базовым уровнем. Это значительно более быстрая потеря веса, чем та, которая наблюдается при интраперитонеальной инъекции. Потеря в весе, составляющая только 2.6-3.0%, наблюдается к концу 32 дня периода инъекций у нормальных мышей дикого типа (ежедневные интраперитонеальные инъекции рекомбинантного полипептида ОВ мыши в дозе 10 мг/кг) и не превышает более 4% в любую временную точку периода инъекций (данные не показаны). Приведенные результаты свидетельствуют, что постоянная инфузия при уменьшенной в 20 раз дозе (0.5 мг/кг в противоположность 10 мг/кг) обеспечивает более существенную потерю веса за более короткий период. Результаты, приведенные здесь, являются специфически достоверными, например, - 4.62% с р<0.0001.

ПРИМЕР 14: Клонирование и экспрессия аналога рекомбинантного полипептида ОВ человека

Данный пример относится к композициям и способам получения аналога рекомбинантного ОВ полипептида человека.

Последовательность ДНК ОВ человека получают при использовании ДНК ОВ мыши, как описано в Примере 13, замещая участок между сайтами Mlu I и Bam HI дуплексной ДНК (полученной из синтетических олигонуклеотилов), которая содержит 20 замещений кодонов. Кодоны аргинина в зрелом белке мыши в положении 35 и кодон лейцина в зрелом белке мыши в положении 74 не изменяются. Сайт Mlu I на приведенной ниже последовательности обозначен сплошной линией сверху. Указанную ДНК встраивают в вектор pCFM 1656 (АСТТ №69576) тем же самым образом, что и рекомбинантный белок мыши, как указано ранее.

Ферментация

Ферментацию указанных выше клеток-хозяев для получения рекомбинантного полипептида ОВ человека осуществляют в тех же условиях и при использовании тех же самых компонентов, которые описаны выше для получения рекомбинантного полипептида мыши. В конечном препарате анализируют выход (г/л), степень предварительной очистки рекомбинантного ОВ человека и содержание примесей бактериальных белков и оценивают эффективность бактериальной экспрессии.

Таблица 9
Анализ экспрессии полипептида ОВ человека
Временная точка	OD600 нм	Выход (г/л)	Экспрессия (мг/OD·л)
Ind.+2ч	47	1.91	41
Ind.+4ч	79	9.48	120
Ind.+6ч	95	13.01	137
Ind.+8ч	94	13.24	141
Ind.+10ч	98	14.65	149

Сокращения: Ind.+...ч обозначает часы после индукции экспрессии белка, как описано в Примере 13 для рекомбинантного белка мыши с помощью плазмиды pCFM 1656. OD - оптическая плотность, измеряемая путем спектрофотометрии (мг/единипа OD/л) мг/OD/л - степень экспрессии в мг белка на единицу OD на литр.

Очистка рекомбинантного полипептида ob человека

Рекомбинантный белок человека может быть очищен с помощью тех же самых методов, что и рекомбинантный белок мыши, как указано выше в Примере 13. Для получения рекомбинантного полипептида ОВ человека стадию 8 осуществляют при доведении рН супернатанта (стадия 7) до рН 5.0 и нанесении на колонку с быстротекущей СМ-серофазой. Солевой градиент в 20-кратном объеме колонки получают при 20 мМ NaOAC, рН 5.5, 0 М-0.5 М NaCl. Стадию 9 осуществляют при разбавлении водой в четыре раза объединенных фракций с СМ-сефарозы и доведении рН до 7.5. Данную смесь помещают в 0.7 М (NH4)2SO4. Обратный солевой градиент в двадцатикратном объеме колонки получают при 5 мМ NaOAc, рН 5.5, 0.2 М-0 М (NH4)2SO4. За исключением указанного, остальные стадии осуществляют, как указано выше.

ПРИМЕР 15: Исследование дозозависимого ответа

Дополнительные исследования показывают, что существует дозозависимый ответ на постоянное введение белка ОВ. В данном эксперименте мышам дикого типа (CD-1, не страдающим ожирением и весящим 35-40 г, водят рекомбинантный белок ОВ мыши с помощью методов, сходных с описанными в Примерах 12 и 13. Результаты исследований приведены ниже (так же, как и % снижение веса тела по сравнению с базовым уровнем).

Таблица 10
Дозозависимый ответ на постоянное введение белка
ДОЗА	ВРЕМЯ	%ПОТЕРИ ВЕСА
0.3 мг/кг/день	День 2	3.5%
1 мг/кг/день	День 2	7.5%
1 мг/кг/лень	День 4	14%

Как можно видеть, увеличение дозы от 0.03 мг/кг/день до 1 мг/кг/день приводит к уменьшению веса от 3.5% до 7.5%. Также заслуживает внимания, что на четырнадцатый день доза в 1 мг/кг/день приводит к 14% редукции веса тела.

ПРИМЕР 16: Эффекты лептина на состав тела мышей ob/ob

Мышам C57Bl/6J ob/ob в возрасте 16 недель вводят лептин мыши в концентрации 5 мкг/кг/день или носитель в течение 33 дней. Контрольные животные не получают ничего. Во втором эксперименте ob/ob мышам 7-недельного возраста вводят лептин мыши или носитель в течение 12 дней. Далее животных забивают и оценивают их обший вес тела, состав тела, уровни инсулина и глюкозы. Данные исследований приведены в Табл. 11.

Таблица 11
Вес тела, состав тела, уровни глюкозы и инсулина исследуемых животных
Группа	16-недельные мыши;			7-недельные мыши;
	лептин, 5 мкг/г/день			лептин 10 мкг/г/день
Препарат	Лептин мыши	Носитель	Контроль	Лептин человека	Лептин мыши	Носитель
Общий вес тела	31.90±2.8	64.10±4.5	67.50±6.2	31.00±1.3	33.40±2.4	42.70±1.5
Жир Общее количество %	9.10±1.7	38.30±4.0	40.87±6.1
	28.40±3.4	59.70±2.1	60.34±3.7
Обезжирен. мыш. масса
Общее кол-во (г)	6.80±1.0	7.60±0.4	7.73±0.5
%	21.30±1.7	11.90±1.2	11.57±1.6
Вода Общее кол-во (г)	16.00±0.8	18.20±0.7	18.90±1.0
%	50.30±4.2	28.40±1.0	28.10±2.2
Инсулин (UIU/мл)	<2.0	<2.0	<2.0	<2.0	<2.0	<2.0
Глюкоза (мг/дл)	170.0±20.9	337±30.3	317.5±51.0	258.3±26.8	320.0±44.9	789.0±152.1

Данные по составу тела показывают, что лептин влияет на три компонента: количество жира, массу обезжиренной мышечной ткани и водную массу. Лептин существенно уменьшает массу жировой ткани и имеет маргинальный эффект на массу обезжиренной мышечной ткани. Однако в последнем случае результат статистически недостоверен.

Сравнение уровня глюкозы и инсулина у животных, получавших лептин, и контрольных показывает, что лептин снижает уровень сахара и инсулина в крови и тем самым снимает эти симптомы диабета.

ПРИМЕР 17: Влияние высоких доз лептина на мышей дикого типа

Не страдающим ожирением контрольным мышам ob/ob (C57Bl6J+/?) один раз в день интраперитонеально вводят 10 мкг/г лептина мыши или носителя (PBS), и в течение двух нелель определяют потребление пищи и вес тела. Наблюдается существенное уменьшение веса тела, начиная с дня 4, и значительное уменьшение потребления пищи с первой недели. Однако через одну неделю уровни потребления пищи становятся неотличимыми в обеих группах животных. Животных умерщвляют в конце второй недели и исследуют состав тела. Результаты анализа состава тела приведены в Табл. 12. Данные показывают уменьшение количества жировой ткани у животных, получавших лептин, в противоположность животным, получавшим PBS.

Второй эксперимент показывает влияние инъекций лептина мыши на животных дикого типа (C57Bl/6J) (дважды в день, интраперитонеально, 12.5 мкг/г). Наблюдается существенное уменьшение веса тела и потребление пищи, ассоциированное с ежедневными двукратными инъекциями полипептида. Для этого эксперимента животных помещали в метаболические камеры. Использовали пищу с консистенцией порошкообразной Пурины #5001. Указанная диета отличается от используемой ранее, которая имела консистенцию пудинга с водой. Поскольку пища, которой кормили животных в метаболических камерах, имеет более высокую калорийную ценность, то количество потребляемой пищи при использовании двух диет было различным.

Приведенные ниже ссылки имеют отношение к данному описанию и особенно к экспериментальным процедурам и обсуждению.

Bahary et al., Genomics, 11: 33-47 (1991)

Bahary et al., Genomics, 13: 761-769 (1992)

Bahary et al.. Molecular mapping of mouse chromosomes 4 and 6: Use of flow-sorted Robertsonian chromosome (1991)

Blank et al., Mammalian Genome, 1: s51-s78 (1991)

Bogardus et al., Annals of the New York Academy of Sciences, 630: 100-115 (1991)

Friedman et al., Mammalian Genome, 1: 130-144 (1991)

Harris, FASEB J., 4: 3310-3318 (1990)

Jacobwitz et al., N. Engl. J. Med., 315: 96-100 (1986).

Kessey, in Obesity, pp. 144-166, StunKard ed., Philadelphia, W. B. Sauders Co.(1980).

Kessey et al., Ann. Rev. Psychol., 37: 109-133.22 (1986).

Leibel et al., «Генетическое разнообразие и питание при ожирении: подходы к молекулярной генетике ожирения», в кн. «Генетические вариации и питание», pp. 90-101.1, Simpoulos and Childs eds., S. Kargen, Basel (1990).

Siegel et al., Cytogenet. Cell Genet., 61 (3): 184-185 (1992).

Настоящее изобретение может быть осуществлено различными способами в пределах его объема и с учетом необходимых особенностей. Описание приведено с целью иллюстрации всех аспектов изобретения и не ограничивает его. Объем изобретения поддерживается заявленными пунктами формулы, которая подразумевает возможные эквивалентные изменения, также входящие в объем притязаний.

Различные источники информации приведены в описании в качестве ссылок.

Изобретение охарактеризовано изложенной ниже формулой, соответствующей описанию с доступными источниками информации и исходным материалам. Однако заявители 9 августа 1995 осуществляли депонирование в Американской коллекции типовых культур, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852-1178, U. S. А. в соответствии с требованиями Будапештского Договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры следующих объектов: плазмида рЕТМ9 Е. coli M9, регистрационный номер 69880; плазмида рЕТМ9 Е. coli M9, регистрационный номер 69879.

Формула изобретения

1. Полипептид ожирения (OB), состоящий из аминокислотной последовательности зрелого полипептида и аминокислотной последовательности сигнального пептида, представленных SEQ ID №4 или SEQ ID №6.

2. Аналог полипептида OB, охарактеризованного в п.1, имеющий аминокислотную последовательность, по крайней мере, на 83% гомологичную аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID №4 или SEQ ID №6.

3. Полипептид ожирения (OB), способный модулировать вес тела животного, который характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID №4 или SEQ ID №6, лишенной последовательности сигнального пептида в положении 1-21.

4. Аналог полипептида OB, охарактеризованного в п.3, имеющий аминокислотную последовательность, по крайней мере, на 83% гомологичную аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID №4 или SEQ ID №6, лишенной последовательности сигнального пептида в положении 1-21.

5. Аналог полипептида OB, охарактеризованного в п.3, в котором, по крайней мере, одна аминокислота в положении, выбранном из группы, включающей положения 53, 56, 71, 85, 89, 92, 95, 98, 110, 118, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 132, 139, 157, 159, 163 и 166 (в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID №4) заменена на другую аминокислоту и который при этом сохраняет способность модулировать вес тела животного.

6. Аналог полипептида по п.5, в котором осуществлена замена на дивергентную аминокислоту полипептида OB мыши с последовательностью, представленной SEQ ID №2 или SEQ ID №5.

7. Аналог полипептида по п.5, в котором осуществлена замена на аланин.

8. Аналог полипептида по п.5, выбранный из группы, включающей полипептиды, в которых

(а) остаток серина в положении 53 заменен на глицин, аланин, валин, цистеин, метионин или треонин и/или

(б) остаток серина в положении 98 заменен на глицин, аланин, валин, цистеин, метионин или треонин и/или

(в) остаток аргинина в положении 92 заменен на аспарагин, лизин, гистидин, глутамин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, серин, треонин, метионин или цистеин.

9. Аналог полипептида OB, охарактеризованного в п.3, выбранный из группы, включающей полипептиды, в которых, по крайней мере,

(а) один остаток аспарагиновой кислоты заменен на глутаминовую кислоту,

(б) один остаток изолейцина заменен на лейцин,

(в) один остаток глицина или валина заменен на аланин,

(г) один остаток аргинина заменен на гистидин,

(д) один остаток тирозина или фенилаланина заменен на триптофан,

(е) один остаток в положениях 121-128 (в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID №4) заменен на глицин или аланин,

(ж) один остаток в положениях 54-60 или 117-167 (в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID №4) заменен на лизин, глутамин, глутаминовую кислоту, цистеин или пролин, который при этом сохраняет способность модулировать вес тела животного.

10. Слитый белок, состоящий из полипептида OB или его аналога по любому из пп.3, 5-9 и связанной с его N-концевым остатком вспомогательной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID №26, SEQ ID №27, SEQ ID №28, SEQ ID №99 и последовательность глицин-серин-пролин.

11. Слитый белок, состоящий из аналога полипептида OB по п.4 и связанной с его N-концевым остатком вспомогательной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей метионин, SEQ ID №38, SEQ ID №98, SEQ ID №27, SEQ ID №28, SEQ ID №99, SEQ ID №26 или последовательность глицин-серин-пролин.

12. Человеческий аналог полипептида OB, способный модулировать вес тела животного, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID №4 или SEQ ID №6 с делецией аминокислотных остатков согласно SEQ ID №4, выбранных из группы, включающей

(а) по крайней мере, один остаток в положениях 121-128,

(б) остатки 1-60,

(в) остатки 1-53,

(г) аналог в соответствии с (а), в котором остатки 1-21 делетированы, и

(д) аналог в соответствии с (б)-(г), имеющий N-концевую аминокислоту или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей

(1) метионин,

(2) глицин-серин-гистидин-метиониновую последовательность (SEQ ID NO:38),

(3) метионин-глицин-серин-серин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-серин-серин-глицин-лейцин-валин-пролин-аргинин-глицин-серин-гистидин-метиониновую последовательность (SEQ ID NO:98),

(4) лейцин-глутаминовая кислота-лизин-аргинин-глутаминовая кислота-аланин-глутаминовая кислота-аланиновую последовательность (SEQ ID NO:26),

(5) глутаминовая кислота-аланин-глутаминовая кислота-аланиновую последовательность (SEQ ID NO:27),

(6) лейцин-глутаминовая кислота-лизин-аргининовую последовательность (SEQ ID NO:28),

(7) метионин-глицин-серин-серин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-серин-серин-глицин-лейцин-валин-пролин-аргинин-глицин-серин-пролиновую последовательность (SEQ ID NO:99), и

(8) глицин-серин-пролиновую последовательность.

13. Аналог полипептида OB, способный модулировать вес тела животного, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID №2 или SEQ ID №5 с делецией аминокислотных остатков в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID №4, выбранных из группы, включающей

(а) по крайней мере, один остаток в положениях 121-128,

(б) остатки 1-60,

(в) остатки 1-53,

(г) аналог в соответствии с (а), в котором остатки 1-21 делетированы, и

(д) аналог в соответствии с (б)-(г), имеющий N-концевую аминокислоту или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей

(1) метионин,

(2) глицин-серин-гистидин-метиониновую последовательность (SEQ ID NO:38),

(3) метионин-глицин-серин-серин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-серин-серин-глицин-лейцин-валин-пролин-аргинин-глицин-серин-гистидин-метиониновую последовательность (SEQ ID NO:98),

(4) лейцин-глутаминовая кислота-лизин-аргинин-глутаминовая кислота-аланин-глутаминовая кислота-аланиновую последовательность (SEQ ID NO:26),

(5) глутаминовая кислота-аланин-глутаминовая кислота-аланиновую последовательность (SEQ ID NO:27),

(6) лейцин-глутаминовая кислота-лизин-аргининовую последовательность (SEQ ID NO:28),

(7) метионин-глицин-серин-серин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-серин-серин-глицин-лейцин-валин-пролин-аргинин-глицин-серин-пролиновую последовательность (SEQ ID NO:99) и

(8) глицин-серин-пролиновую последовательность.

14. Полипептид OB, охарактеризованный в п.3, который модифицирован путем присоединения к нему, по меньшей мере, одного водорастворимого полимера, выбранного из группы, включающей полиэтиленгликоль, сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (гомополимеры и/или выборочные сополимеры), полипропиленгликолевые гомополимеры, декстран, поли(n-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы, поливиниловый спирт и пропиональдегид полиэтиленгликоля.

15. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид OB или его аналог и характеризующаяся нуклеотидной последовательностью, которая в соответствии с генетическим кодом определяет аминокислотную последовательность полипептида OB по любому из пп.1-9.

16. Молекула ДНК, предназначенная для экспрессии полипептида OB, обладающего способностью модулировать вес тела животного, выбранная из группы, включающей

(а) ДНК-молекулу с последовательностью SEQ ID №3 и

(б) ДНК-молекулу, гибиридизующуюся с (а) в условиях средней строгости, использующих 40%-ный формамид с 5х или 6xSSC.

17. Рекомбинантный вектор клонирования, содержащий кодирующую полипептид OB молекулу ДНК по п.15 или 16.

18. Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий кодирующую полипептид OB молекулу ДНК по п.15 или 16, которая функционально связана с последовательностями, контролирующими экспрессию полипептида.

19. Фармацевтическая композиция для снижения веса тела животного, содержащая в качестве активного начала полипептид, обладающий способностью модулировать вес тела, и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что она содержит эффективную концентрацию полипептида OB по любому из пп.3-9 или 14.

20. Моноклональное антитело, специфически взаимодействующее с полипептидом OB, полученное при использовании в качестве антигена полипептида OB или его аналога по любому из пп.1-9, 12-14.

21. Антитело по п.20, меченное выявляемой меткой.

22. Поликлональное антитело, специфически взаимодействующее с полипептидом OB, полученное при использовании в качестве антигена полипептида OB или его аналога по любому из пп.1-9, 12-14.

23. Антитело по п.22, меченное выявляемой меткой.

Конвенционный приоритет:

1. пп.1-9, 14-19, признак «глицин-серин-пролин» в пп.10 и 11; подпункты а, б, в, г и д(1) в пп.12 и 13; пп.20-23, кроме использования полипептида OB по подпунктам д(2)-(7) пп.12 и 13 - от 17.08.1994 (US 08/292, 345).

2. П.10 в части SEQ ID NOS:26, 27 и 28;

п.11 в части SEQ ID NOS:26, 27, 28 и 38;

пп.12 и 13 в части подпунктов д(2, 4, 5, 6);

пп.20-23 в части использования OB по подпунктам д(2, 4, 5, 6) пп.12 и 13 - от 30.11.1994 (US 08/347, 563).

3. П.10 в части SEQ ID NO:99;

п.11 в части SEQ ID NOS:98 и 99;

пп.12 и 13 в части подпунктов д(3) и (7);

пп.20-23 в части использования OB по подпунктам д(3) и (7) пп.12 и 13 - от 10.05.1995 (US 08/438, 431).

Таблица 12 Состав тела и вес мышей дикого типа /+/?/
Группа	C57BL/6J	Вес тела	Жир Общее кол-во	%	Обезжиренная мышечная масса Общее кол-во	%	Вода Общее кол-во	%
Белок	1	17.3	0.30	1.71%	5.00	28.93%	12.00	69.36%
	2	20.5	2.39	11.65%	5.41	26.40%	12.70	61.95%
	3	16.9	0.34	1.99%	4.76	28.19%	11.80	69.82%
	4	18.3	0.84	4.62%	5.16	28.17%	12.30	67.21%
	5	17.7	0.44	2.51%	4.96	28.00%	12.30	69.49%
	6	18.7	2.56	13.72%	4.84	25.86%	11.30	60.43%
	7	15.7	0.37	2.38%	4.53	28.83%	10.80	68.79%
	8	16.4	0.29	1.79%	4.51	27.48%	11.60	70.73%
	9	16.5	0.83	5.05%	4.67	28.29%	11.00	66.67%
	10	14.9					10.40	69.80%
	Среднее станд.откл.	17.3	0.93	5,04%	4.87	27.79%	11.62	67.43%
		1.6	0.90	4.52%	0.30	1.05%	0.74	3.52%
Носители	11	18.8	1.30	6.93%	5.00	26.58%	12.50	66.49%
	12	17.6	2.17	12.34%	4.53	25.73%	10.90	61.93%
	13	18.0	2.29	12.74%	4.61	25.59%	11:10	61.67%
	14	19.6	3.79	19.34%	4.61	23.52%	11.20	57.14%
	15	18.6	2.35	12.65%	4.75	25.52%	11.50	61.83%
	16	17.3	1.96	11.32%	4.54	26.25%	10.80	62.43%
	17	19.3	1.38	7.12%	5.02	26.04%	12.90	66.84%
	18	20.6	4.16	20.19%	4,94	23.98%	11.50	55.83%
	19	17.7	1.08	6.13%	4.72	26.64%	11.90	67.23%
	20	19.5					12.30	63.08%
	Среднее станд.откл.	18.7	2.28	12.09%	4.75	25.54%	11.66	62.45%
		1.1	1.07	5.08%	0.20	1.10%	0.72	3 .83%