коллаген гиалуроновая кислота

ЛАБОРАТОРИЯ КЛЕТОЧНОЙ КОСМЕТИКИ

estra-X

СПИСОК ПАТЕНТОВ С УПОМИНАНИЕМ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ

95114061 Способ получения гиалурона
2017751 Способ получения гиалурона
2192150 БАД для профилактики йодной недостаточности
2112542 Препарат для лечения патологий соединительных тканей
2225206 Препарат для лечения рака молочной железы
2299733 Лечение опорно-двигательного аппарата
2299732 Способ лечения глаукомы
2299726 Противоинфекционная губная помада
2299725 Косметическое средство для ухода за кожей
2198878 Ароматическое соединение
2198702 Способ подготовки трофических язв к аутодермапластике
2198653 Вагинальные суппозитории
2197946 Композиция для ухода за волосами
2197923 Фармацевтическая композиция для лечения отеков роговицы
2298410 Биотрансплантант и способ лечения ревматических и аутоиммунных заболеваний
2197501 Фотоотверженный гель на основе сшитой гиалуроновой кислоты
2197228 Твердые лекарственные формы
2197222 Водная компазиция для ухода за волосами, лица и тела
2297425 Полипептиды
2297240 Композиция с гиалуроновой кислотой
2297230 Фармацевтическая компазиция с ксантоновой смолой
2196588 Глазные капли
2195955 Применение биологически активных веществ
2195926 Дерматологические композиции
2295954 Микрочастицы для доставки нуклеиновых кислот
2295951 Косметика для ухода за кожей лица и век
2195262 Фармакологическое средство на основе гиалуроновой кислоты
2194512 Способ профилактики и коррекции процесса старения кожи
2194478 Лечение экземы
2294716 Расширяемый стент
2194055 Сшитые сополимеры
2099350 Ассоциаты депротонированной гиалуроновой кислоты
2293557 Средство для лечения кожи и слизистых
2292878 Приготовление микроцастиц, содержащих метопропол
2292746 БАД
2192256 Защита кишечника
2191782 Получение модифицированной гиалуроновой кислоты
2292219 Паратиреоидный гормон человека
2291686 Микроцастицы
2191000 Косметическая маска
2290921 Фармацевтические и косметические средства против старения кожи
2290900 Модифицированный биоматериал для использования в офтальмологии
2290899 Получение биоматерьяла
2290397 Новые инданилиденовые соединения
2290186 Лечение сирингомиелии
2288702 Иррингационный раствор для офтальмологии
2288699 Гель для лечения стоматологических заболеваний
2188011 Активирующая остеогенез фармацевтическая композиция
2187327 Средство с антисептиком
2187325 Средство с радиопротекторным действием
2287330 Композиции миноксидила
2186786 Способ получения гиалуроновой кислоты
2186593 Лечение раненого процесса кожи
2286801 Очищение воды
2286781 Лечение ожогов пищевода у детей
2286764 Средство лечения воспалений полости рта
2185840 Лечение инфекционных заболеваний
2286151 Альфа-2-Дельта-Лиганда
2185149 Ранозаживляющий гель
2285527 Лечение ИЛ-6 заболеваний
2184448 Раствор хранения роговицы, включающий гиалуроновую кислоту
2090179 Крем для кожи
2183961 Способ лечения кожи
2284331 Соли алифотических аминов
2284187 Производные амида
2089191 Снизить внутрение давление
2283320 Получение гликозаминогликанов
2283129 Лечение опухолей
2283098 Косметические средства с Q
2182574 Ароматические соединения
2088257 Средство с гипохолестеролемическим действием
2088218 Состав для гигиенических салфеток
2088206 Способ получения препарата, создающего исскуственный загар
2282462 Противомикробные средства
2182008 Интровагинальная компазиция
2181999 Препарат с отсроченным высвобождением
2181998 Новые композиции липидов
2181995 Лечение болевого синдрома
2181295 Вирионная вакцина
2087144 Витамин Е
2379336 Способ стирки
2379052 Вакцинация
2180855Композиция в виде ионного комплекса
2379025 Противоинфекционный гель
2180825 Лечение травм роговицы
2281082 Способ коррекции эстетических и возрастных проблем кожи
2180576 Биоактивная добавка для косметических средств
2280459 Средство для изменения скорости роста или репродукции клеток
2179981 Соли переходного металла
2378010 Жидкие вакцины
2378008 Комбинированные вакцины
2378007 Анаболическое средство
2377973 Растительные экстракты
2280041 Способ получения водорастворимых комплексов гиалурил
2280038 Биополимеры
2323733 Йодный обмен
2377260 Гель
2178693 Противовирусное средство на основе гиалуроновой кислоты
2178692 Облегчающие зуд косметическое средство
2377022 Гемостатические спреи
2376982 Увлажняющая сыворотка для лица
2376974 Трансдермальный гель для лица
2362784 Гипо-и гиперацетилированные менингокковые капсульные сахариды
2177789 Устройство для доставки лекарства к шейке матки
2277954 Крем для лица омолаживающий
2376378 Способ получения метионина
2177332 Биоматериал для предотвращения послеоперационных спаек, с производной гиалуроновой кислотой
2177310 Способ получения таблеток
2376011 Средство для позвоночника
2277410 Косметическое средство
2323748 Медицинская повязка
2276998 Гидрогелевые композиции
2082416 Способ получения препарата с коллагенном из животного сырья
2375081 Адсорбирующее изделие
2375049 Охлаждающий пластырь
2346049 Способ получения гиалурона
2275913 Фармацевтические средства
2174985 Полисахарид с антиоксидантом
2373957 Носитель для лекарственных средств и биологически активных веществ
2373941 Способ коррекции возрастных и патологических изменений кожных покров
2174845 Композиции и способы доставки генетического материала
2174830 Средство для укрепления волос
2373769 Синбиотическая композиция
2274472 Лечение апорно-двигательного аппарата и болевых синдромов
2372929 Профилактическая композиция на основе веществ фенольной природы в липосомной форме
2173563 Способ нанесения на поверхность предметов покрытия на основе гиалуроновой кислоты, её производных и полусинтетических полимеров
2079304 фармацевтическая композиция, обладающая иммуносупрессорной и антимикробной активностью
2273645 Полипептид ожирения
2173154 Фракция кератансульфатолигосахаридов и содержащий ее фармацевтический препарат
2173136 Грязная мазь
2173128 Способ хирургического лечения центральных разрывов сечатки
2078561 Косметическое средство предотвращающее старение кожи
2172490 Способ прогнозирования воспалительных заболеваний молочной железы при эндопластике
2272645 Способ лечения ЦМВ-Инфекции у детей раннего возроста
2272636 Фармацевтическая композиция для местного лечения воспаления
2272635 Фармацевтически активная субстанция для офтальмологии
2272599 Биоматерьял для стабилизации прогрессирующей миопии "Коллаплант"
2172168 Средство для заживления ран на основе гиалуроновой кислоты
2371172 Фармацевтическая композиция для лечения нервной системы на основе стефаглабрина
2171470 Способ прогнозирования послеоперационной трансформации доброкачественных опухолей нервной системы
2077317 Состав для ванн
2271213 Комбинированные композиции, содержащие экстракты из растений и морских животных
2076872 Способ получения окрашенной гиалуроновой кислоты
2076671 Раствор для защиты роговицы
2370281 Конъюгаты гидроксиалкилкрахмал
2370275 Способ лечения (коррекции) косметических и возрастных дефектов кожи
2370258 Фармацевтическая композиция для парентальной доставки в форме лиофилизата
2270023 Способ экстракции и очистки протеогликана хрящего типа (варианты)
2369408 Гемостатическая композиция, включающая гиалуроновую кислоту
2369387 Фармацевтическая композиция для лечения нервной системы
2369379 Нетаблитированные жевательные формы для индивидуального введения
2169136 Производное коричной кислоты
70792 Медицинский аппликатор
20741717 Способ стабилизации аскорбиновой кислоты
2074712 Способ получения препарата, препятствующего преждевременной эякуляции
2367954 Способ прогнозирования развития кожной патологии у женщин с синдромом склерополикистозных яичников (СПКЯ)
2268075 Устройство для электрокинетической доставки
2268052 Средство для лечения воспалительных и дегенеративных заболеваний суставов
2167649 Способ получения твердой дисперсии умеренного водорастворимого лекарственного вещества
2167647 Гель для бритья
2073520 Лечение урологических инфекций
2367476 Биопластический материал
2367475 Мембрана для использования при направленной регенерации тканей
2367469 Фармацевтическая композиция на основе лизоамидазы
2367456 Фармацевтическая композиция обладающая антибактериальным и некролитическим действием
2367455 Фармацевтическая композиция обладающая некролитическим и антибактериальным действием
2267324 Применение антиадгезивных углеводов, препарат для уменьшения и /или блокирования адгезии патогенных веществ
2166934 Композиции включающие биологический агент
2166510 Псевдодипептиды
2366460 Композиции, имеющие высокую противовирусную и антибактериальную активность
2360901 Производные феноксиуксусной кислоты
2165749 Способ восстановления эндотелия роговицы
2265441 Способ укрепления склеры
2365382 Композиции и способы для регуляции развития сосудов
2070879 Соли гликозаминогликанов
2164914 Циклические и гетероциклические N - замещенные - иминогидроксамовые карбоновые кислоты
2264627 Хламидийный конъюктивит
2364399 Фармацевтический препарат на основе стефаглабрина
2264230 Препарат с замедленным высвобождением активного вещества
2363497 Фармацевтические композиции
2363496 Способ увеличения объема мягких тканей
2363473 Способ антифлогистической активации в эксперементе
2363461 Фармацевтический препарат на основе сигетина
2363459 Средства для введения в роговицу глаз для предотвращения офтальмологических нарушений
2363448 Фармацевтические композиции
2163123 Глазные капли
2162687 Усовершенствованнная лекарственная форма индуктора интерферана
2162343 Биосовместимый полимерный материал и способ его получения
2162327 Лечение рака
2067841 Способ получения ароматизатора
2161478 Способ консервированого лечения гонартроза
2361617 Вольфрамовые частицы в качестве рентгеноконтрастных веществ
2361552 Способы и устройства для дренирования жидкостей и понижения внутриглазного давления
2066996 Способ изготовления пленочного материала для офтальмохирургии
2361417 Корм с глюкозамином и экстрактом ивы для профилактики артроза у животных
2161002 Пищевой общеукрепляющий лечебно-профилактический продукт из хрящевой ткани акул
2360928 Комплексная матрица для медико-биологического применения
2160574 Способ лечения глаукомы
2360688 Способ лечения повреждений переферических нервов
2360670 Фармацевтическая композиция при климактерических расстройствах
2360646 Эндолюминальный протез
2260445 Способ усовершенствования транспортировки через легко прспосабливаемый полупроницаемый барьер
2260007 Производные амида
2359975 Способ получения модифицированных арабиногалактанов
2359974 Антигенные Пептиды
2159775 Псевдопептидный продукт
2259833 Фармацевтическая композиция для лечения роговицы глаза
2259816 Ранозаживляющее средство
2259815 Способ коррекции возрастных изменений, связанных с процессами старения кожи
2359706 Способ сохранения офтальмологических растворов
2359704 Антисептическое средство
2359662 Микрокапсулы
2159253 Катионные полимеры
2159111 Средство для ухода за кожей лица
2159105 Композиция для защиты кожи от опасных химических веществ Получение
2158593 Биосовместимый водный раствор
2358728 Способ лечения и предупреждения потери костной ткани
2258517 Способ хирургического лечения травмотических повреждений селезенки пленкой на основе гиалуроновой кислоты
2357968 Кристалические формы производной имидазола
2357957 Ингибиторы P38 и их применение
2157647 Пищевая добавка и ее получение
2357758 Препараты для чрескожной и чересслизистой добавки
2063244 Способ стабилизации растворов
2063140 Способ получения препарата для консервирования мяса
2157381 Способ получения гиалуроновой кислоты
2257198 Композиции микроцастиц
2356909 Белковый комплекс
2356570 Косметическая композиция
2256434 Способ закрытия перфорации барабанной перепонки
2356520 Способ лечения постконтузионного повреждения сечатки глаза
2156133 Гель
2255945 Полимерная композиция
2355761 Средства повторной дифференцировки
2061043 Способ повышения устойчивости урокиназы к нагреванию
2061005 Способ получения красителей для гистологических исследований
2355420 Зубная паста
2355385 Композиции пролонгированного действия с контролируемым высвобождением
2355240 Способ получения пищевого препарата хондропротекторного действия
2155057 Пихтово репейный бальзам
2354409 Способ производства высвобождающих лекарственные средчтва медицинских устройств
2254145 Раневое покрытие на основе коллаген-хитозанового комплекса
2254133 Лечение и профилактика ВИЧ-инфекции у человека
2253439 Фармацевтическая композиция для защиты и улучшения оптических свойств роговици при проведении эндовитреальных вмешательств
2253437 Способ омоложения кожи
2153352 Фармацевтическая композиция обладающая ранозаживляющим и противовоспалительным действием
2353354 Фармацевтический препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
2252787 Способ получения искусственной матрицы кожи
2252767 Способ нормализации иммунобиохимического гомеостаза коров в предродовом и послеродовом периодах
2352583 Фармацевтическая композиция содержащая Fc-область иммуноглобулина в качестве носителя
2152403 Модифицированные полисахариды
2352356 Иммуногенная композиция
2352342 Исскусственный физиологический солевый раствор Способ его получения
2352330 Фармацевтический препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
2352323 Фармацевтический препарат с модифицированным высвобождением
2152027 Способ подготовки ткани мозга для определения гликозаминогликанов
2251842 Интектицидный состав для борьбы с личинками оводов
2151580 Способ активации пролиферации эндотелия роговицы
2351648 Дифференцировка стромальных клеток, полученных из жировой ткани, в эндокринные клетки поджелудочной железы и их использование
2351595 N - гидроксиформамидные соединения в качестве ингибиторов металлопротеина
2251411 Косметическое средство в лиофилизированной фармацевтической форме
2251405 Косметика...ее композиции для косметических препаратов
2251367 Средство со сшитой гиалуроновой кислотой для наращивания тканей
2351359 Косметика для профилактики и лечения избыточной массы тела
2351322 Препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
2351153 Диета при остеортрите собак
2350958 Способ определения групповой принадлежности синовальной жидкости
2350625 Производные гиалуроновой кислоты с пониженной биодеградируемостью
2150266 Крем после бритья
2350354 Фармацевтическое средство содержащие антагонист и фактор некроза
2350340 Способ коррекции процессов регенерации
2350309 Способ лечения избыточной массы тела с помощью рефлексотерапии
2250047 Профилактический продукт из хрящевой ткани гидробионтов
2249467 Медицинский матерьял и изделия на его основе
2055079 Способ получения препарата гиалуроновой кислоты
2349599 Биоадгезив мидии
2054903 Способ лечения коллагеноза у бычков на откорме
2249210 Способ прогнозирования предрасположенности к развитию и тяжести течения деформирующего остеоартроза коленного сустава у взрослых
2349339 Средство для соединительной ткани
2148988 Человеческий интерферона
2148399 Лечение атеросклероза
2148396 Способ определения активного вещества в дифильных мазевых основах
2148375 Способ диагностики близорукости
2348415 Способ противоспаечной терапии после хирургического вмешательства
2348400 Препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
2348386 Способ непроникающего хирургического лечения первичной открытоугольной глаукомы
2248213 Лечение Галактозидальной А недостаточности
2347586 Микрофлюидизированные эмульсии типа "масло в воде" и вакцинные средства
2147243 Контрастное средство
2146526 Лечебный препарат дисбактериоза и урогенитальных инфекций
2146148 Терапевтическое применение фактора роста кератиноцитов (ФРК)
2146139 Способ повышения активности макрофагов и комбинации для его осуществления
2346277 Способ диагностики специфического синовита
2345793 Ультразвуковые контрастные вещества и их получение
2345782 Терапевтические комбинации на основе PORIFERA для лечения и предотвращения кожных заболеваний
2245131 Способ коррекции косметических недостатков кожи
2245130 Способ активации восстановительных процессов в коже
2144833 Хондроитиназа
2344809 Получение твердых дозированных форм с использованием сшитого нетермопластичного носителя
2244540 Косметический гель для ухода за кожей лица
2244536 Способ лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний тазобедренного сустава
2344167 Хмелевый экстракт
2143884 Агент регулирования дифференциации клеток кожи, культурная среда для клеток или тканей и способ регулирования дифференциации клеток кожи
2343932 Способ получения обладающих пониженной растворимостью в воде пленночных материалов
2343903 Устройство доставки лекарств для контролируемого введения препаратов
2048817 Способ получения материала для лечения ожогов и гнойно - некронических ран
2048803 Гидратантный крем
2242974 Средства и способы лечения воспалительных заболнваний
2142816 Способ получения антигерпетической вакцины
2342923 Средство для обработки рук с увлажняющим эффектом
2142781 Косметика для макияжа ресниц и бровей и агент ингирирующий рост микроорганизмов в косметических средствах
2242251 Трансплантируемые стенты с биоактивными покрытиями
2142257 Способ обработки глазных имплантантов и контакных линз
2342389 Мононатриевая соль
2342107 Способ устранения западения верхнего века при анофтальме
2141828 Средство, пролонгирующее эффективность чесночного порошка
2241489 Косметическое средство матриксных протеинов для залечивания ран
2241443 Средство для лечения герпеса
2241414 Способ получения протезов кровеносных сосудов
2341539 Гидрогель
2141324 Регулятор скорости воздействия препарата для инъекций
2141312 Косметическое средство для ухода за кожей лица
2341296 Средства и способы покрытия медицинских имплантантов
2341272 Средство для неспецифической иммунотерапии
2341266 Стенты с нанесенным покрытием содержащим N - (5-(4-(4-
2341257 Иммуномодулирующее средство
2341255 Средство для лечения климактерических расстройств
2240821 Способ лечения урологических инфекций
2140786 Способ лечения лишая
2140243 Способ хирургического лечения диабетической ретинопатии и отслоек сечатной оболочки
2240140 Медицинская многослойная повязка и изделия на ее основе
2240135 Культура клеток, содержащая клетки - предшественники остеонегеза, имплантант на ее основе и его использование для восстановления целостности кости
2240123 Экзогенные биологически активные коньюгирующие вещества
2139886 Фотоотвержаемое производное гликозаминогликата, сшитое производное гликозаминогликата и способы их получения, способ предотвращения клеточной и тканевой адгезии
2139729 Вакцина. Способ стимулирования иммунной системы
2339386 Средство обладающее радио - и химиозащитным действием
2339369 Лечение офтальмологических нарушений с использованием мочевины и ее производных
2139041 Гидратантный регенерирующий крем и способ его получения
2139039 Косметический суперкрем для ухода за кожей
2139017 Способ получения боисовместимого материала
2138503 Производные камптотецина, способы их получения, уникальное средство
2338556 Средство содержащие антагонист Р2Х - рецептора и нестероидное противоспалительное лекарственное средство
2338514 Косметическое средство для профилактики старения кожи
2138297 Медицинские устройства, подверженные вызываемому разложению
2138295 Покрытие для ран
2337906 Ингибиторы цитозольной фосфолипазы А2 Применение физиологически допустимого корпускулярного ферримагнитного или ферромагнитного материала. Способ формирования магнитометрического изображения
2137501 Устройство формирования изображения
2137477 Способ лечения заболеваний характеризующихся аутоиммунной агрессией
2137467 Крем для кожи лица и тела
2137449 Способ коррекции дефектов преломления в глазу млекопитающего
2137402 Пищевая Добавка БАД
2336899 Способ стимуляции миелопоэза
2336862 Способ получения раствора для лечения роговицы
2336830 Способ восстановления костных структур челюсти
2136696 Новый полипептид и средство против ВИЧ - Инфекции
2336092 Биоадгезивное средство, по существу свободное от воды
2336089 Средство и способ лечения заболеваний периодонтальных и пульпы
2336074 Средства и способы лечения заднего сегмента глаза
2235548 Ранозаживляющее средство
2135186 Способ лечения рефлекторных синдромов при остеохондрозе
2234945 Стабилизатор водного раствора и водосодержащего сырья
2334762 Растворимая ассоциативная карбоксиметилцеллюлоза
2234514 Макропористые хитозановые гранулы и способ их получения. Способ культивирования клеток
2133615 Средство для лечения неврологических заболеваний
2233164 Способ профилактики развития послеоперационных спаек брюшной полости
2133127 Неткатный материал, способ его получения и способ лечения
2333223 Альдегидные производные сиаловой кислоты и средства на их основе
2333007 Полипептидные вакцины для широкой защиты против рядов поколений менингококов с повышенной вирулентностью
2332985 Дозированные формы анестезирующих средств с длительным высвобождением для обезболивания
2132677 Косметическая маска
38603 Пленочный аппликатор
2232594 Средство содержащие ингибирующие остеокластогенез фактор и полисахарид
2332238 Средство для прокладок, раневых повязок и других изделий, контактирующих с кожей
2331668 Стромальные клетки, получение из жировой ткани, для заживления дефектов роговицы и внутриглазных дефектов и их использование
2331438 Альфа - 2 - Дельта Лигант для лечения симптомов нижних мочевыводящих путей
2331411Электропряденые аморфные фармоцевтические средства
2331367 Способ профилактики образования спаек и их рецидива
2130767 Масло в воде для получения косметических и дерматологических средств, способ косметической обработки
2230752 Поперечносшитые гиалуроновые кислоты и их применение в медицине
2230558 Способ восстановления и сохранения здоровья скмьи
2230550 Средства длительного высвобождения, способ их получения и применения
2230458 Поддержания здоровья суставов
2330290 Способ определения состояния метаболических процессов в ткани суставного хряща
2230073 Способ поперечного сшивания карбоксилированных полисахаридов
2329059 Способ лечения полипозного риносинусита
2329037 Комбинированная терапия для лечения иммуновоспалительных заболеваний
2128666 Гиалуроновая кислота и ее соли, способ очистки гиалуроновой кислоты, способ получения гиалуроновой кислоты. Фармацевтический препарат с гиалуроновой кислотой и средства с гиалуроновой кислотой используемые в офтальмологии
2328740 Способ экспресс - оценки действия зубных паст
2128502 Косметический гель
2328272 Суппозитории индуктора интерферона
2328268 Косметика содержащая амфолитный сополимер
2128057 Композиционная мембрана, способ ее получения и способ направленной регенерации тканей с ее применением
2128055 Средство замедленного освобождения и способ его получения
2128049 Свечи
2227743 Полипептидные варианты с повышенной гепаринсвязывающей способностью
2326893 Ковалентное и нековалентное сшивание гидрофильных полимеров
2326697 Новый перевязочный материал для быстрого заживления раневой поверхности кожи
2126264 Фармацевтическое средство с гиалуроновой кислотой
2326137 Способ получения содержащих альгинат пористых формованных изделий
2325902 Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани
2225195 Репелленты против насекомых
2325193 Сосудистый стент
2325184 Улучшенные везикулы наружной мембраны бактерий
2325153 Многокомпонентная фармацевтическая дозированная форма
2325152 Удерживаемая в желудке система регулируемой доставки лекарственного средства
2029955 Способ предоперационного определения помутнения задней капсулы хрусталика при экстракции катаракты
2324688 Производные бисбензизоселеназолонила с противоопухолевым, противовоспалительным и антитромбоническим действием
2323017 Устройство и способ контролируемый доставки активных веществ в кожу
2323011 Содержащий Коллаген I и Коллаген II способный к рассасыванию внеклеточный матрикс, предназначенный для реконструирования хряща
2322955 Способ изготовления имплантанта для пластики дефектов хрящевой ткани
2322454 Антитело против CCR5
2322263 Система продолжительного высвобождения растворимого лекарственного средства
2221561 Витамин Е и его сложные эфиры
2321634 Гены участвующие в метаболизме углерода и продуцировании энергии
2321597 Биоматерьял, способ его приготовления и его применение, медицинское средство, имплантант и вкладыш
2121340 Средство для похудения
2220737 Средство для улучшения состояния опорно-двигательного аппарата
2220729 Гель используемый в стоматологии
2320720 Способ культивирования фибропластов для заместительной терапии
2320378 Накожный аппликатор
2320369 Средства, содержащие Альфа - 2 - Дельта Лиганды и ингибиторы обратного захвата серотонина/норадреналина
2320362 Местные фармацевтические средства, содержащие проантоцианидины, для лечения дерматитов
2320322 Биоадгезивная доставка лекарств
2320318 Чувствительное к температуре изменяющие состояние средство гидрогеля
2025120 Способ получения препарата, содержащего Фактор /G-CSF/, стимулирующий рост колоний гранулоцитов
2319490 Средство для введения железа при лечении синдрома беспокойных ног
25995 Содержащее адгезив приспособление для фиксации зубных протезов в полости рта
2218907 Средство для ухода за кожей лица и веками
2318830 Способ получения модифицированного дерматансульфата
2118153 Косметика - туш для ресниц
2217441 Способ получения полимера
2317296 Изетионатная соль селективного ингибитора CDK4
2217171 Мембрана для использования при направленной регенерации тканей
2317095 Экстракты ECHINACEA ANGUSTIFOLIA
2216332 Препарат для лечения астроза
2216314 Крем - маска для обезвоженной кожи
2316333 Средство оздоровительно-восстановительных косметических панто-магниевых ванн
2021304 Способ получения биологически активного средства
2115662 Способ получения гиалуроновой кислоты
2315627 Впрыскиваемые имплантанты на керамической основе для заполнения морщин, кожных впадин, шрамов
2315623 Средство получаемое путем лиофилизации препарата
2114862 Способ получения гиалуроновой кислоты
2314791 Лечебно-Косметическое средство
2314791 Косметический крем-бальзам для ухода за кожей лица и шеи
2214600 Способ оценки эффективности лечения неврологических проявлений
2114602 Способ косметической обработки
2114587 Раствор для защиты роговицы
2214283 Имплантант для подкожного или внутрикожного введения
2313370 Медицинские протезы, имеющие улучшенную биологическую совместимость
2313356 Препарат для лечения демодекоза
2313338 Средство на основе этиллинолеата и триэтилцитрата для лечения себореи и угрей
2313328 Косметика содержащая тонкодисперный и пористый порошок
2212880 Способ получения препарата содержащего антибиотик, с замедленным высвобождением активного вещества
2312640 Способ лечения Блефароконьюнктивальной формы синдрома сухого глаза
2017751 Способ получения гиалуроновой кислоты
2312145 Гены CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM, кодирующие белки, участвующие в синтезе мембран и мембранном транспорте
2311458 Белки вызывающие измененную иммуногенную реакцию. Способ их получения и использования
2311183 Улучшенное разделение с использованием гталуроновой кислоты
2311177 Ингибиторы интегрина для лечения заболевания глаз
2300069 Косметическая маска
2211024 Уход за сухой кожей
2310440 Раствор для защиты роговицы от повреждений
2309684 Лечение межфалангового остеоатроза узелковой формы
2309406 Способ мониторинга фиброза печени у больных хроническим гепатитом с (ХГС)
2209088 Опосредованная рецепторами доставка генов с использованием векторов на основе бактериофагов
2308967 Уменьшение объема ткани
2308962 Средство для опорно-дигательного аппарата
2308957 Способ получения препарата для мезотерапии
2308954 Средство для лечения ран, содержащее плазму или сыворотку крови
2308951 Комплексный способ профилактики вагинальных дисбактериозов
2308937 Косметическая биологически активная добавка и косметический литофитокомплекс на ее основе
2208638 ДНК (варианты), способ получения белка
2207885 Способ подачи небольшого объема лечебного раствора к целевому месту
2207858 Лишенные побочных эффектов производные простагландинов для лечения глаукомы
2207845 Твердая лекарственная форма пролонгированного действия
2207844 Препарат для местного неинвазивного применения
2207841 Средства с антиферментативным действием
2306335 Стволовые клетки и решетки полученные из жировой ткани
2306140 Новые рецепторы для Helicobacter pylori и их применение
2205612 Способ эндотелизации IN VITRO протезов кровеносных сосудов
2105540 Депигментирующее средство
2304960 Косметическое средство для кожи
2304616 Гены участвующие в гомеостазе и адаптации
2204550Способ получения длинноцепочечной N-Ацилированной кислотой Аминокислот
2204415 Способ получения изображения
2204394 Средство для лечения грибковых инфекций, желудочных язв
2204366 Способ хирургического лечения глаукомы
2104034 Вагинальное увлажняющие средство, способ его получения
2303991 Биологически активная добавка
2303990 БАД
2303973 Адсорбирующее изделие
2203676 Средство обладающее иммунокорригирующим действием
2203672 Способ предупреждения беременности
2303635 Гены кодирующие белки резистентности и толерантности к стрессам
2303529 Способ фиксации альгинатного геля на твердой фазе, способ получения клеточного чипа на его основе
2203078 Способ лечения гнойных ран
2302412 Гидразоно-малонитрилы
2102400 Способ получения гиалуроновой кислоты
2202356 Способ стимуляции репаративных процессов длительно незаживающих ран и трофических язв
2202336 Средство для ухода за кожей
2302231 Глазные капли
2102082 Способ магнитометрического исследования тела человека или животного
2301814 Полиакриламидный гидрогель
2201765 Гибридные матричные имплантанты и эксплантанты
2301677 Биотрансплантант для лечения дегенеративных и трвматических заболеваний хрящевой ткани и способ его получения
2301676 Способ лечения ревматизма
2301674 Способ лечения больных с переломами нижней челюсти
2301661 Средство с регулируемым освобождением и способ его получения
2005488 Средство для лечения болезней соединительной ткани
2200001 Крем для кожи

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ

Патент №2234514

(54) МАКРОПОРИСТЫЕ ХИТОЗАНОВЫЕ ГРАНУЛЫ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК

(57) Реферат:

Изобретение относится к макропористым хитозановым гранулам, имеющим относительно большие и одинаковые поры размером 30-150 мкм снаружи и внутри, которые распределены от поверхности до области ядра, и способу их получения, включающему в себя следующие стадии: добавление по каплям хитозанового раствора, водного хитозанового раствора или их смеси в низкотемпературный органический растворитель или жидкий азот; регуляцию размера пор с помощью метода разделения фаз за счет разницы температур. Макропористые хитозановые гранулы согласно изобретению делают культивирование клеток более эффективным, чем предшествующие субстраты, так как клетки могут эффективно прикрепляться к ним благодаря большой площади их поверхности, клеткам легко войти в них и клетки, прикрепленные к таким субстратам, могут существовать дольше благодаря их трехмерной структуре, поэтому макропористые хитозановые гранулы могут быть использованы для изучения продукции белка, антибиотиков, противораковых средств, полисахаридов, физиологически активных веществ, гормонов животных или гормонов растений, а также изучения замещения метаболических органов, хряща или кости. 4 с. и 10 з.п. ф-лы, 8 табл., 3 ил. ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Данное изобретение относится к макропористым хитозановым гранулам и способу получения макропористых хитозановых гранул. Более конкретно, данное изобретение относится к макропористым хитозановым гранулам, которые превосходны по прикреплению к ним клеток, биосовместимости с клетками и биодеградации и, таким образом, пригодны для роста клеток, ангиогенеза и для диффузии питательных веществ, и к способу получения макропористых хитозановых гранул. Данное изобретение относится также к способу культивирования клеток животных и растений с использованием макропористых хитозановых гранул. ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ В последнее время активные исследования были обращены к клеточным культурам для получения замены метаболическим тканям, таким как ткани печени и поджелудочной железы, а также хряща и кости. Для эффективного культивирования клеток необходимы матрицы для культур, чтобы была возможность прикрепления клеток, чтобы облегчить рост клеток и помочь клеткам сохранять их функции, кроме того, что они должны обладать биосовместимостью, способностью к биодеградации, пластичностью и должны быть пористыми. В частности, матрикс для клеток должен быть пористым, чтобы разместить как можно больше клеток в ограниченном пространстве. В этом отношении размер и трехмерное строение пор должны определяться при тщательном рассмотрении клеточного роста, ангиогенеза и диффузии питательных веществ. К настоящему времени в качестве матрикса для культур клеток использовалось много природных и синтетических полимеров. Например, для создания трехмерных пористых заменителей кости использовали сетку из ПГК (PGA; полигликолевая кислота), которая дает возможность множеству клеток прикрепиться к ней, кроме того, что она способствует быстрой регенерации ткани и является превосходной по биодеградации (Vunjak-Nonakovi G. et al., Journal of Biotechnology Progress, vol. 14, 193-202, 1998). Du С. et al. синтезировали пНАС (нано-НАр/коллаген) (Journal of Biomedical Materials Research, vol. 44, 407-415, 1999). PLLA (поли-L-молочная кислота) была успешно использована для культивирования остеобластов (Lo et al., Journal of Biomedical Materials Research, vol. 30, 475-484, 1996; Evans G.R. et al., Journal of Biomaterials, vol. 20, 1109-1115, 1999). Из PGA и PLLA были изготовлены сетка или трехмерный пористый остов с использованием метода литья в растворителе или выщелачивания частиц, на которых выращиваются хондроциты (Freed et al., Journal of Biomedical Materials Research, vol. 27, 11-23, 1993). Была предпринята попытка культивировать фибробластные клетки на пористом матриксе, изготовленном из ПЭГ (полиэтиленгликоля), сопряженного с фибриногеном (Pandit A. S. et al., Journal of Biomaterials Application, vol. 12, 222-236). Другой успех в культивировании фибробластов был достигнут путем использования трубчатой ПГК, формируемой с помощью метода литья напылением раствора PLLA или PLGA (поли-D,L-молочной-согликолевой кислоты) в хлороформе, у которой была выявлена повышенная прочность на сжатие. Для эффективного культивирования клеток необходим в основном пористый матрикс, чтобы дать возможность легко и равномерно прикрепиться к ним как можно большему числу клеток в ограниченном пространстве, а также для облегчения роста клеток. Однако вышеуказанные матриксы недостаточно удовлетворяют данным требованиям. Было сделано предположение, что бусиноподобные матрицы скомпенсируют недостатки вышеназванных матриц. Исследование различных биосовместимых материалов со свойствами фактора роста, эффективным и для гомеостаза в случае травмы, привело к открытию того, что положительно заряженные гранулы более эффективны в остановке кровотечения (Wu L. et al., Journal of Surgical Research, vol. 85, 43-50, 1999). Альгинатные гранулы использовали для культуры хондроцитов и через 1-2 дня культивирования добавляли ИЛ-1

(интерлейкин-l

) для облегчения формирования внеклеточного матрикса (Beekman В. et al., Osteoarthritis Cartilage, vol. 5, 330-340, 1998). Кроме того, были разработаны другие пористые матрицы для клеточных культур из желатина, коллагена, гиалуроновой кислоты, целлюлозы и стекла. Пористые желатиновые гранулы полимеризуют путем добавления ГЭМА (2-гидроксиэтилметакрилат) и ЭДМ (этиленгликольдиметакрилат) и придают им пористость с помощью повторных циклов замораживания и оттаивания. Такие желатиновые гранулы делают возможным прикрепление к ним различных видов клеток. Затем клетки имплантируют в ткани чтобы изучить замещение ткани. Данные гранулы могут варьировать по размеру, в зависимости от материалов, но они непригодны для использования в клеточной культуре по причине малых размеров их пор, заключенных в интервале от 0,7 до 2,6 мкм. Матрицы в виде круглых гранул обладают преимуществами размещения большого числа клеток в ограниченном пространстве, что дает возможность хорошего роста клеток и эффективного выделения продуктов. Однако у матриц в виде гранул, изготовленных из альгината или желатина, есть сложности в формировании пор желаемых размеров и в возможности равномерного распределения на них и в них. Когда они изготовлены из коллагена или стекла, гранулы страдают тем недостатком, что имеют плохую биосовместимость. Поэтому эти гранулы непригодны в качестве матриц для адсорбции клеток с точки зрения неустойчивости клеток и силы адсорбции. Что касается эффективного применения при исследовании по замещению ткани посредством имплантации клеток, необходимы полимеры, которые обладают способностью к прикреплению клеток и обладают биосовместимостью, способностью к биодеградации, пластичностью и пористостью. Превосходя по пластичности в отношении размера и формы природные полимеры, синтетические полимеры хуже их по биосовместимости и в отношении биодеградации. Поэтому синтетические полимеры обладают свойством оказывать различные побочные эффекты на прямую имплантацию ткани. По этим причинам природные полимеры, которые являются безопасными и имеют разнообразное применение, активно изучаются. Хитин, предшественник хитозана, обнаруживается на поддающемся количественному определению уровне в панцирях ракообразных, таких как крабы и креветки, и насекомых, и в клеточных стенках низших грибов, грибов и бактерий. Он является полимером, состоящим из повторяющихся N-ацетил-D-глюкозаминовых звеньев, которые связаны друг с другом через (1

4)-

-гликозидную связь. Хитозан, щелочной полисахарид, полученный путем N-дезацетилирования хитина с помощью высокой концентрации щелочи, как известно, превосходит по способности к прикреплению клеток, биосовместимости, биодеградируемости и пластичности вышеназванные синтетические полимеры. Эти преимущества послужили причиной того, что было предпринято множество попыток использовать хитозан в качестве матрикса для клеточной культуры. Например, структурированный глютаральдегидом хитозан и модифицированный фруктозой хитозан использовали в качестве матриц для культивирования гепатоцитов (Yagi, et al., Biological Pharmaceutical Bulletin, vol. 20, No. 6, 708-710 & vol. 20, No. 12, 1290-1294, 1997). Эти хитозановые матрицы могут быть получены путем смешивания глютаральдегида или фруктозы с чистым хитозаном для улучшения прикрепления клеток и изготовлены в желаемой форме. Однако культивирование клеток с использованием этих модифицированных хитозановых матриц может происходить только в двухмерной системе культивирования, так как клетки адсорбируются только на поверхности матриц. Хитозановые пленки с желаемыми размерами пор были получены с помощью различных методик лиофилизации и использовались при тканевой инженерии (Madihally S. V. et al., Journal of Biomaterials, vol. 20, 1133-1142, 1999). Эти хитозановые пленки оказались очень эффективными для получения пор желаемого размера, но все еще оставались ограниченными методиками двухмерного культивирования клеток. Кроме того, сообщалось о хитозановых гранулах, которые были получены посредством лиофилизации (Tsu-Yang et al., Journal of Industrial Engineering Chemical Research, vol. 36, 3631-3638, 1997). Эти хитозановые гранулы были модифицированы путем сшивания глутаральдегида с аминокислотными остатками хитозановых гранул, и производилось измерение для демонстрации высокой степени адсорбции ионов кадмия. Новые хитозановые гранулы были также описаны и в публикации, принадлежащей Wolfgang G. et al. из USPTO, 1999. Эти авторы использовали немагнитный янтарный ангидрид для получения хитозановых гранул с карбоксильными группами. Их подвергали взаимодействию с хлоридом железа (FeCl2) и промывали избыточным количеством воды с получением магнитных хитозановых гранул, которые, как сообщается, могут использоваться для очистки белков или для абсорбции магнитных материалов. Вследствие малого размера пор пористые хитозановые гранулы используются для адсорбции и/или очистки ионов магнитных материалов. Однако нигде не было обнаружено использование пористых хитозановых гранул в качестве матриц для культуры клеток. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ В виду превосходства хитозана по способности к прикреплению клеток, биосовместимости, биодеградации и пластичности его изучали с целью получения макропористых гранул с равномерно распределенными большими порами, в которых можно благополучно культивировать клетки. На пути к данному изобретению глубокие и интенсивные исследования, проведенные авторами настоящего изобретения, привели к обнаружению того, что раствор хитозана претерпевает фазовое разделение в органическом растворителе, так что могут быть получены макропористые хитозановые гранулы с равномерными порами на и внутри них. Поэтому объектом данного изобретения является преодоление проблем, встречающихся в предшествующих решениях, и в получении макропористых хитозановых гранул, которые имеют одинаковые поры внутри и снаружи. Другим объектом данного изобретения является получение макропористых хитозановых гранул, которые имеют такую большую площадь поверхности, чтобы абсорбироввать на ней клетки. Дополнительным объектом данного изобретения является получение макропористых хитозановых гранул, которые являются наилучшими по способности к прикреплению клеток, биосовместимости и деградируемости и, таким образом, пригодны для клеточного роста, ангиогенеза и диффузии питательных веществ. Еще одним объектом данного изобретения является создание способа получения макропористых хитозановых гранул. И еще одним объектом данного изобретения является создание способа культивирования животных и растительных клеток с использованием макропористых хитозановых гранул. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ Фиг.1 является РЭМ фотографией, на которой представлена поверхность пористых хитозановых гранул данного изобретения перед тем, как клетки культивируются внутри гранул и на гранулах. Фиг.2 является РЭМ фотографией, представляющей поперечное сечение пористых хитозановых гранул данного изобретения перед тем, как клетки культивируются внутри гранул и на гранулах. Фиг.3 является РЭМ фотографией, на которой представлены пористые хитозановые гранулы данного изобретения после того, как гепатоциты культивированы внутри пористых хитозановых гранул и на гранулах в течение 10 дней. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Прежде чем будут раскрыты или описаны указанные макропористые хитозановые гранулы и их получение, следует уточнить, что терминология, использованная здесь, предназначена только для целей описания конкретных воплощений и не предназначена для ограничения ими изобретения. Термин “раствор хитозана”, который здесь использован, означает водный раствор уксусной кислоты, содержащий хитозан. Термин “водный раствор хитозана”, который здесь использован, означает раствор водорастворимого хитозана в деионизированной воде. И также термин “хитозановые гранулы” или “пористые хитозановые гранулы”, который здесь использован, означает пористые хитозановые частицы 1-4 мм с относительно одинаковыми порами, изготовленные из раствора хитозана, водного раствора хитозана и их смесей. В то же время термин "матрикс" ("матрица") или “матрикс для культуры клеток”, который использован здесь, означает твердую основу или твердый носитель, к которым клетки прикрепляются при культивировании в среде, для того чтобы размножаться. В одном аспекте данное изобретение относится к пористым хитозановым гранулам для клеточной культуры, которые являются превосходными по их биосовместимости, биодеградируемости, способности к прикреплению клеток и пластичности, с одинаковыми и большими по размеру порами. С этими преимуществами пористые хитозановые гранулы являются очень полезными матрицами, на которых можно культивировать различные виды животных и растительных клеток. Пористые хитозановые гранулы данного изобретения могут использоваться в качестве матриц для культивирования животных и растительных клеток всех видов, и, в частности, пригодны для культивирования гепатоцитов, фибробластов, остеобластов, эпителиальных клеток и упаковочных клеток для вирусов. Что касается пор пористых хитозановых гранул данного изобретения, их размер предпочтительно заключается в пределах 1-500 мкм и более предпочтительно в пределах 5-200 мкм. Гранулы предпочтительно колеблются по размеру от 0,1 до 10 мм и более предпочтительно от 1 до 4 мм. В другом аспекте данное изобретение относится к способу получения пористых хитозановых гранул. Изготовление хитозановых гранул начинается с раствора хитозана, водного хитозана или их смеси. Как упомянуто выше, раствор хитозана получают путем растворения хитозана в водном растворе уксусной кислоты, тогда как водный раствор хитозана получают путем растворения водорастворимого хитозана в деионизированной воде. Затем раствор по каплям добавляют в органический растворитель при низкой температуре или жидкий азот с получением гранул. В заключение хитозановые гранулы лиофилизируют. Хотя хитозан растворим в кислоте, водорастворимый хитозан проявляет значительную растворимость в воде. Применимым в данном изобретении является хитозан со средней молекулярной массой, составляющей 5000-1000000. Предпочтительная средняя молекулярная масса водорастворимого хитозана заключена в интервал 5000-1000000. Для растворения хитозана раствор уксусной кислоты предпочтительно имеет концентрацию 0,1-10% по массе. После завершения растворения хитозан предпочтительно присутствует в количестве 0,1-20% по массе в растворе уксусной кислоты. При растворении в деионизированной воде содержание водорастворимого хитозана предпочтительно колеблется по концентрации от 0,5 до 1,5% по массе. Более высокие концентрации дают в результате меньший размер пор. Таким образом, когда концентрации хитозана выше 4%, образуются очень маленькие поры, ограничивающие внедрение и рост клеток. Когда хитозан используется вместе с водорастворимым хитозаном, хитозан предпочтительно смешивают при весовом отношении 1:9-9:1 с водорастворимым хитозаном. Чем выше пропорция водорастворимого хитозана, тем больше поры по размеру. Примеры органического растворителя, пригодного в данном изобретении, включают в себя хлорциклогексан, хлорпентан, н-гексан, дихлорметан, хлороформ и этилацетат. Эти органические растворители, обладающие низкими температурами плавления, хотя и не растворяют хитозан, однако очень полезны для отвердения хитозана посредством разделения фаз, благодаря различию в растворимости и температуре плавления. Как показано в результате исследования зависимости изменения размера пор от органических растворителей, хлорпентан образует поры большего размера, чем дихлорпентан. Предпочтительно, чтобы температура органического растворителя сохранялась постоянно низкой. Если температура, поддерживаемая постоянной, колеблется, отверждаемые пористые гранулы неожиданно плавятся на их поверхности, так что теряют свою пористость до такой степени, что трехмерная структура, необходимая для прикрепления клеток и помощи клеткам в выполнении их функций, разрушается. Органические растворители предпочтительно поддерживают при температуре -5 - -65

С, а жидкий азот - примерно при -198

С. Например, более низкие температуры приводят к образованию пор меньших размеров. С другой стороны, если органические растворители выдерживают при слишком высоких температурах, разделения фаз вследствие различия температуры не происходит. Наиболее предпочтительные условия для данного изобретения включают в себя добавление 1% раствора хитозана в хлорпентановый растворитель, выдерживаемый при -5 - -25

С, и добавление 1% водного раствора хитозана в хлороформный растворитель, поддерживаемый при -5 - -25

С. Для поддержания низких температур органических растворителей можно использовать сухой лед или этанол, охлажденный в морозильнике. Альтернативно можно использовать жидкий азот примерно при -198

С. Полученные таким образом пористые хитозановые гранулы являются гомогенными по размеру с распределением в пределах от 1 до 4 мм. Чтобы быть пригодными в качестве матриц для клеточной культуры, пористые хитозановые гранулы должны допускать их различную предварительную обработку, например лиофилизацию, нейтрализацию для удаления остающихся кислот и органических растворителей, стерилизацию этанолом, заполнение культуральной средой и затем снова лиофилизацию. В следующем аспекте данное изобретение представляет собой способ культивирования клеток животных и растений с использованием пористых хитозановых гранул. Сначала, после того как приготовленные пористые хитозановые гранулы погружают в культуральную среду, проводят предварительное культивирование для прикрепления клеток к пористым хитозановым гранулам. После удаления несвязанных клеток прикрепленные клетки пролиферируют, и в это время старую среду заменяют свежей средой. Предварительное культивирование для прикрепления клеток предпочтительно проводится в течение 4-6 часов. Предпочтительно, чтобы культуральная среда заменялась каждые два или три дня. Пористые хитозановые гранулы были получены в различных условиях концентрации хитозана и уксусной кислоты и видов и температур органических растворителей, и использовались в качестве матрикса для культивирования различных видов клеток, включая гепатоциты, фибробласты, остеобласты, эндотелиальные клетки, упаковывающие клетки для вирусов. В результате были сформированы поры различных размеров, соответствующих условиям получения. Подробнее, размер образуемых пор пористых хитозановых гранул, как было обнаружено, мал, когда органические растворители поддерживают при низких температурах или же раствор хитозана или водный раствор хитозана имеет повышенную концентрацию. То есть размер пор определяется температурой, при которой происходит разделение раствора хитозана или водного раствора хитозана, и концентрацией раствора хитозана или водного раствора хитозана. К тому же вид органического растворителя влияет на предопределение размера пор хитозановых гранул. При использовании хлорпентана размер пор согласно измерениям был наибольшим. С другой стороны, дихлорпентан давал в результате и наименьшие поры. В случае смесей хитозана и водорастворимого хитозана наибольший размер пор получили, когда использовали смесь хитозана и водорастворимого хитозана в соотношении 4:6. Сравнение хитозана с водорастворимым хитозаном при одной и той же концентрации дает возможность придти к заключению, что хитозан имеет преимущества перед водорастворимым хитозаном и в формировании увеличенного размера пор. Следовательно, 1% водный хитозан и хлороформ при -5 - -25

С или 1% хитозан и хлорпентан при -5 - -25

С могут привести к образованию пор хитозановых гранул наибольшего размера. В сравнении с обычными матрицами пористые хитозановые гранулы, полученные способом данного изобретения, демонстрируют превосходство по адсорбции разных видов клеток животных и растений. Через 2-3 дня после того, как они адсорбировались на пористых хитозановых гранулах, клетки росли внутри и снаружи гранул, а также на их поверхности. Кроме того, было обнаружено, что гепатоциты, культивированные с использованием матрикса согласно изобретению, сохраняют свои клеточные функции, что подтверждено в результате различных биохимических экспериментов. ПРИМЕРЫ Лучшее понимание данного изобретения может быть получено в свете следующих примеров, которые представлены для иллюстрации, но не должны интерпретироваться как ограничение данного изобретения. Пример 1. Получение пористых гранул с использованием 1% раствора хитозана и хлорпентана В 1% водном растворе уксусной кислоты растворяли хитозан (Fluka, USA) в количестве, равном 1% по массе, после чего раствор хитозана медленно добавляли к хлорпентану (Sigma, USA), выдерживаемому при -5 - -25

С, при -25 - -45

С и при -45 - 65

С с помощью этанола, содержащего сухой лед (Sigma, USA), при помощи 10 мл шприца. Гранулы, которые формировались через 5-10 сек после добавления, отделяли, используя ложку, и замораживали при -70

С в течение 1 дня с последующей лиофилизацией в течение 2-3 дней в аппарате для лиофильной сушки (Cole-Parmer Instrument Company, USA). Их изучали на морфологию поверхности под сканирующим электронным микроскопом и определяли размер пор. Результаты представлены в таблице 1 и показаны на фиг. 1 и 2.

Когда пористые хитозановые гранулы получали с использованием 1% хитозана при тех же самых показателях всех параметров, за исключением температуры органического растворителя, что видно из таблицы 1, были получены поры меньшего размера при более низких температурах. Пример 2. Получение пористых гранул с использованием 1% хитозана и различных органических растворителей Хитозановые гранулы были получены методом, подобным таковому из примера 1, за исключением того, что использовали 1% водный раствор уксусной кислоты, содержащий хитозан в количестве 1% по массе, и различные органические растворители, такие как хлорпентан, н-гексан, дихлорпентан, хлороформ и этилацетат, выдерживаемые при -5 - -25°С. Хитозановые гранулы исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа и определяли размер пор. Результаты представлены в таблице 2.

В таких же условиях при тех же самых параметрах, за исключением органических растворителей, средний размер пор хитозановых гранул согласно измерениям был наименьшим при использовании хлороформа и наибольшим при использовании хлорпентана. Пример 3. Получение пористых гранул с использованием 2% хитозана и хлорпентана Хитозановые гранулы получали методом, подобным таковому из примера 1, за исключением того, что использовали 1% раствор уксусной кислоты, содержащий хитозан в количестве 2% по массе, и хлорпентан, выдерживаемые при -5 - -15

С и -15 - -25

С. Хитозановые гранулы исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа и определяли размер пор. Изменения размера пор в зависимости от концентрации хитозана представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, хитозановые гранулы имеют меньшие размеры пор, когда концентрация хитозана в растворе повышается. Пример 4. Получение пористых гранул с использованием растворов 2% хитозана в 1-4% водных растворах уксусной кислоты и хлорпентана Хитозановые гранулы получали методом, подобным таковому из примера 1, за исключением того, что использовали 2% (мас.) раствор хитозана, 1, 2, 3 и 4% водный раствор уксусной кислоты и хлорпентан, выдерживаемые при -15 - -25

С. Исследование под сканирующим электронным микроскопом показало, что размер пор пористых хитозановых гранул заключен в пределах от 10 до 80 мкм. Результаты наблюдений представлены вместе с результатами из примера 3 в таблице 4. Как видно из таблицы 4, более высокие концентрации раствора уксусной кислоты давали в результате большие размеры пор.

Пример 5. Получение пористых гранул с использованием 2% хитозана и жидкого азота Хитозановые гранулы получали методом, подобным таковому из примера 1, за исключением того, что использовали раствор 2% (мас.) хитозана в 1% водном растворе уксусной кислоты и жидкий азот. Исследование в сканирующем электронном микроскопе показало, что размер пор пористых хитозановых гранул заключен в пределах от 5 до 50 мкм. Это наблюдение согласуется с данными, полученными в примере 1, что дает возможность заключить, что более низкие температуры соответствуют образованию пор меньших размеров, так как температура жидкого азота ниже, чем температура органических растворителей. Пример 6. Получение пористых гранул с использованием 2% хитозана и хлорциклогексана Хитозановые гранулы получали методом, подобным таковому из примера 1, за исключением того, что использовали 2% (мас.) раствор хитозана в 1% водном растворе уксусной кислоты и хлорциклогексане, выдерживаемых при -5 - -15

С, -15 - -25

С и -25-50

С. Исследование в сканирующем электронном микроскопе показало, что размер пор пористых хитозановых гранул заключен в пределах от 10 до 150 мкм. Результаты наблюдений представлены в таблице 5.

При тех же условиях по всем параметрам, за исключением температуры органического растворителя, как видно из таблицы 5, средний размер пор хитозановых гранул согласно измерениям был сходным с размером пор, полученным с использованием хлорпентана, и становился меньше при снижении температуры. Пример 7. Получение пористых гранул с использованием смесей хитозана и водорастворимого хитозана в хлорпентане Хитозановые гранулы получали методом, подобным таковому из примера 1, за исключением того, что использовали растворы 1% (мас.) смесей хитозана и водорастворимого хитозана (Jakwang Co. Ltd., Korea) в соотношениях 8:2, 6:4, 4:6 и 2:8, и хлорпентан, выдерживаемый при -5-25

С и -25-45

С. Исследование в сканирующем электронном микроскопе показало, что размер пор составлял от 10 до 120 мкм. Изменения в размере пор в соответствии с пропорциями в смеси и температурой органического растворителя представлены в таблице 6.

Как видно из таблицы 6, более высокое содержание водорастворимого хитозана способствует образованию пор большего размера, тогда как температура хлорпентана почти не оказывает влияния на размер пор. В частности, при использовании смеси хитозана и водорастворимого хитозана 4:6 показан больший средний размер пор хитозановых гранул, который согласно измерениям составляет от 30 до 120 мкм. Пример 8. Получение пористых гранул с использованием водорастворимого хитозана в хлорпентане Хитозановые гранулы получали методом, подобным таковому из примера 1, за исключением того, что использовали 1% (мас.) раствор водорастворимого хитозана в деионизированной воде и хлорпентан, выдерживаемый при -5 - -25

С, -25 - -45

С и –45 -65

С. Исследование в сканирующем электронном микроскопе показало, что размер пор пористых хитозановых гранул составляет от 10 до 70 мкм. Производили измерение размеров пор гранул, и результаты представлены в таблице 7.

Как видно из таблицы 7, хитозановые гранулы, полученные из раствора водорастворимого хитозана, имеют размеры пор менее размеров пор хитозановых гранул, полученных из раствора хитозана. Кроме того, размер пор этих хитозановых гранул не подвергается большому изменению в зависимости от температуры, в отличие от хитозановых гранул, полученных из раствора хитозана. Пример 9. Получение пористых гранул с использованием водорастворимого хитозана и различных органических растворителей Хитозановые гранулы получали методом, подобным таковому из примера 1, за исключением того, что использовали 1% (мас.) раствор водорастворимого хитозана в деионизированной воде и различные органические растворители, такие как хлорпентан, н-гексан, дихлорпентан, хлороформ и этилацетат, выдерживаемые при -5 - -25°С. Исследование в сканирующем электронном микроскопе показало, что размер пор пористых хитозановых гранул составляет от 20 до 200 мкм. При изготовлении из водорастворимого хитозана проводили измерения размеров пор хитозановых гранул в соответствии с видами органических растворителей. Результаты представлены в таблице 8.

В хитозановых гранулах, полученных из раствора гранулы большего размера образуются, когда в качестве органического растворителя используется хлороформ, чем при использовании других органических растворителей. С другой стороны, хитозановые гранулы, изготовленные из хитозанового раствора, имели наибольшие размеры пор при использовании хлорпентана (таблица 2). Из этих результатов видно, что на размеры пор хитозановых гранул, полученных из раствора хитозана или раствора водорастворимого хитозана, влияет вид органического растворителя. Экспериментальный пример 1. Культура гепатоцитов Пористые хитозановые гранулы размером 1-4 мм с порами 50-150 мкм, полученные в примере 1, нейтрализовали 5 N раствором гидроксида натрия в этаноле для удаления оставшихся кислот и органических растворителей с последующей стерилизацией 70% этанолом. После внесения в культуральную среду (DMEM, рН 7,4, Gibco BRL, USA) хитозановые гранулы лиофилизировали. В культуральную среду погружали лиофилизированные хитозановые гранулы, к которым затем прикреплялись гепатоциты крыс. Для этого прикрепления проводили предварительное культивирование в течение 4-6 часов. Чтобы удалить клетки, оставшиеся несвязанными, среду заменяли свежей. С этого времени среду заменяли каждые два или три дня за 1-10 дней, в течение которых гепатоциты, прикрепленные к хитозановым гранулам, культивировали при 37

С. Когда клетки агломерировали, в сканирующем электронном микроскопе наблюдали клетки, которые росли в порах хитозановых гранул, а также на поверхности хитозановых гранул, что показано на фиг.3. Экспериментальный пример 2. Культура клеток NIH3T3 Используя клетки NIH3T3, которые являются фибробластными клетками (АТСС НВ-11601, США), производили ту же процедуру в отношении культуры клеток, что и в экспериментальном примере 1. Исследование в сканирующем электронном микроскопе показало, что клетки прочно прикреплялись к хитозановым гранулам, а также росли в порах. Кроме того, фибробластные клетки, как оказалось, росли быстро и прочно контактировали друг с другом. Экспериментальный пример 3. Культура клеток МСЗТЗ-Е1 Используя клетки МСЗТЗ-Е1, которые являются клетками остеобластов (Korean Cell Line Bank in Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea), проводили ту же самую процедуру, что и в экспериментальном примере 1 в отношении культуры клеток. В сканирующем электронном микроскопе наблюдали, что эти клетки прочно связаны с хитозановыми гранулами и хорошо растут. Экспериментальный пример 4. Культура клеток СНО-К1 Используя клетки СНО-К1, которые являются эпителиальными клетками (АТСС CCL-61, США), проводили ту же самую процедуру, что и в экспериментальном примере 1 в отношении культуры клеток. В сканирующем электронном микроскопе наблюдали, что эти клетки прочно связаны с хитозановыми гранулами, а также растут в порах. Экспериментальный пример 5. Культура клеток РТ67 Используя клетки РТ67, которые являются упаковочными клетками (Korean Cell Line Bank in Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea), проводили ту же самую процедуру, что и в экспериментальном примере 1 в отношении культуры клеток. В сканирующем электронном микроскопе наблюдали, что эти клетки не только прочно связаны с хитозановыми гранулами, секретируя в то же время внеклеточный матрикс в большом количестве, но также и быстро растут. ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ Как описано выше, пористые хитозановые гранулы согласно изобретению имеют одинаковые поры снаружи и внутри, так что они могут быть пригодными в качестве матрикса, который обеспечивает трехмерные структуры, используемые для помощи клеткам в осуществлении их функций. Кроме того, в отличие от общеизвестных матриц для клеточной культуры, в пористых хитозановых гранулах согласно изобретению достигнуто превосходство в прикреплении клеток, биосовместимости и биодеградируемости, а также в отношении роста клеток, ангиогенеза и диффузии питательных веществ. С такими преимуществами пористые хитозановые гранулы согласно изобретению пригодны в качестве матрикса для культивирования животных и растительных клеток. В дополнение к этому пористые хитозановые гранулы могут быть эффективно использованы для исследований по замещению метаболических тканей, таких как печень и поджелудочная железа, или хряща или кости, а также по продукции биологически полезных веществ, включая белки, антибиотики, противораковые средства, полисахариды, биологически активные материалы и гормоны растений и животных. Данное изобретение было описано иллюстративным способом, и должно быть ясно, что использованная терминология предназначена для его описания, а не ограничения. Возможны многие модификации и варианты данного изобретения в свете вышеприведенных указаний. Поэтому должно быть понятно, что в рамках прилагаемой формулы данное изобретение может быть осуществлено на практике и иначе, чем конкретно описано.

Формула изобретения

1. Матрикс для применения в культивировании клеток, причем указанный матрикс сформирован из материала, выбранного из группы, состоящей из хитозана, водорастворимого хитозана и их смеси, матрикс имеет форму пористых гранул, имеющих одинаковые поры снаружи и внутри, причем размер пор заключен в пределах 30 - 150 мкм, и клетки, которые нужно культивировать, прикрепляются к матриксу путем абсорбции и затем растут во внутренних порах, а также на его поверхности. 2. Матрикс по п.1, где клетки являются клетками животных, выбранными из группы, состоящей из гепатоцитов, фибробластных клеток, остеобластных клеток, эпителиальных клеток и упаковочных клеток, или растительных клеток, выбранных из группы, состоящей из клеток CEL, UV18 и К-1. 3. Способ получения пористых хитозановых гранул, включающий в себя получение раствора хитозана, где хитозан растворен в водном растворе уксусной кислоты, водном растворе хитозана, где водорастворимый хитозан растворен в деионизированной воде, или их смеси; добавление по каплям раствора хитозана, водного раствора или их смеси в органический растворитель с низкой температурой -5 ~ -65

С с получением гранул; и лиофилизацию хитозановых гранул. 4. Способ по п.3, где хитозан имеет средний молекулярный вес 30000-100000 и водный хитозан имеет средний молекулярный вес 100000-400000. 5. Способ по п.3, где водный раствор уксусной кислоты имеет концентрацию 1,0-4,0 мас.%. 6. Способ по п.3, где раствор хитозана имеет концентрацию хитозана 0,5 - 2,0 мас.%. 7. Способ по п.3, где водный раствор хитозана имеет концентрацию хитозана 0,5 - 1,54 мас.%. 8. Способ по п.3, где смесь имеет массовое отношение раствора хитозана к водному раствору хитозана в пределах 2:8 - 8:2. 9. Способ по п.3, где органический растворитель выбран из группы хлорциклогексана, хлорпентана, н-гексана, дихлорметана, хлороформа и этилацетата. 10. Способ по п.3, где органический растворитель выдерживают при -5 ~ -25

С. 11. Способ по п.10, где органический растворитель охлаждают с помощью этанола, поддерживаемого при -5 - -65

С с использованием сухого льда или морозильника. 12. Способ культивирования клеток животных или клеток растений, включающий в себя получение раствора хитозана, где хитозан растворен в водном растворе уксусной кислоты, водного раствора хитозана, где водорастворимый хитозан растворен в деионизированной воде, или их смеси; добавление по каплям раствора хитозана, водного раствора или их смеси в органический растворитель с низкой температурой -5 ~ -65

С с получением гранул; и лиофилизацию хитозановых гранул; нейтрализацию пористых гранул для удаления кислот и органических растворителей с последующей стерилизацией пористых гранул; проведение с пористыми хитозановыми гранулами предварительного культивирования в течение 4-6 ч для прикрепления клеток к пористым хитозановым гранулам; и периодическое освежение культуральной среды клеток, прикрепленных к хитозановым гранулам. 13. Способ по п.12, где клетки культивируют для замещения метаболических тканей, включая печень и поджелудочную железу, или хряща или кости, и для получения биологически применимых веществ, включая белки, антибиотики, противораковые вещества, полисахариды, биологически активные вещества и гормоны животных и растений. 14. Способ культивирования клеток, который включает в себя проведение предварительного культивирования на матриксе по п.1 в течение 4-6 ч для прикрепления клеток к матриксу и смену культуральной среды клеток, так что клетки растут во внутренних порах, а также на его поверхности.