ЛАБОРАТОРИЯ КЛЕТОЧНОЙ КОСМЕТИКИ
English (United Kingdom)
estra-X

СПИСОК ПАТЕНТОВ С УПОМИНАНИЕМ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ

  • 95114061 Способ получения гиалурона
  • 2017751 Способ получения гиалурона
  • 2192150 БАД для профилактики йодной недостаточности
  • 2112542 Препарат для лечения патологий соединительных тканей
  • 2225206 Препарат для лечения рака молочной железы
  • 2299733 Лечение опорно-двигательного аппарата
  • 2299732 Способ лечения глаукомы
  • 2299726 Противоинфекционная губная помада
  • 2299725 Косметическое средство для ухода за кожей
  • 2198878 Ароматическое соединение
  • 2198702 Способ подготовки трофических язв к аутодермапластике
  • 2198653 Вагинальные суппозитории
  • 2197946 Композиция для ухода за волосами
  • 2197923 Фармацевтическая композиция для лечения отеков роговицы
  • 2298410 Биотрансплантант и способ лечения ревматических и аутоиммунных заболеваний
  • 2197501 Фотоотверженный гель на основе сшитой гиалуроновой кислоты
  • 2197228 Твердые лекарственные формы
  • 2197222 Водная компазиция для ухода за волосами, лица и тела
  • 2297425 Полипептиды
  • 2297240 Композиция с гиалуроновой кислотой
  • 2297230 Фармацевтическая компазиция с ксантоновой смолой
  • 2196588 Глазные капли
  • 2195955 Применение биологически активных веществ
  • 2195926 Дерматологические композиции
  • 2295954 Микрочастицы для доставки нуклеиновых кислот
  • 2295951 Косметика для ухода за кожей лица и век
  • 2195262 Фармакологическое средство на основе гиалуроновой кислоты
  • 2194512 Способ профилактики и коррекции процесса старения кожи
  • 2194478 Лечение экземы
  • 2294716 Расширяемый стент
  • 2194055 Сшитые сополимеры
  • 2099350 Ассоциаты депротонированной гиалуроновой кислоты
  • 2293557 Средство для лечения кожи и слизистых
  • 2292878 Приготовление микроцастиц, содержащих метопропол
  • 2292746 БАД
  • 2192256 Защита кишечника
  • 2191782 Получение модифицированной гиалуроновой кислоты
  • 2292219 Паратиреоидный гормон человека
  • 2291686 Микроцастицы
  • 2191000 Косметическая маска
  • 2290921 Фармацевтические и косметические средства против старения кожи
  • 2290900 Модифицированный биоматериал для использования в офтальмологии
  • 2290899 Получение биоматерьяла
  • 2290397 Новые инданилиденовые соединения
  • 2290186 Лечение сирингомиелии
  • 2288702 Иррингационный раствор для офтальмологии
  • 2288699 Гель для лечения стоматологических заболеваний
  • 2188011 Активирующая остеогенез фармацевтическая композиция
  • 2187327 Средство с антисептиком
  • 2187325 Средство с радиопротекторным действием
  • 2287330 Композиции миноксидила
  • 2186786 Способ получения гиалуроновой кислоты
  • 2186593 Лечение раненого процесса кожи
  • 2286801 Очищение воды
  • 2286781 Лечение ожогов пищевода у детей
  • 2286764 Средство лечения воспалений полости рта
  • 2185840 Лечение инфекционных заболеваний
  • 2286151 Альфа-2-Дельта-Лиганда
  • 2185149 Ранозаживляющий гель
  • 2285527 Лечение ИЛ-6 заболеваний
  • 2184448 Раствор хранения роговицы, включающий гиалуроновую кислоту
  • 2090179 Крем для кожи
  • 2183961 Способ лечения кожи
  • 2284331 Соли алифотических аминов
  • 2284187 Производные амида
  • 2089191 Снизить внутрение давление
  • 2283320 Получение гликозаминогликанов
  • 2283129 Лечение опухолей
  • 2283098 Косметические средства с Q
  • 2182574 Ароматические соединения
  • 2088257 Средство с гипохолестеролемическим действием
  • 2088218 Состав для гигиенических салфеток
  • 2088206 Способ получения препарата, создающего исскуственный загар
  • 2282462 Противомикробные средства
  • 2182008 Интровагинальная компазиция
  • 2181999 Препарат с отсроченным высвобождением
  • 2181998 Новые композиции липидов
  • 2181995 Лечение болевого синдрома
  • 2181295 Вирионная вакцина
  • 2087144 Витамин Е
  • 2379336 Способ стирки
  • 2379052 Вакцинация
  • 2180855Композиция в виде ионного комплекса
  • 2379025 Противоинфекционный гель
  • 2180825 Лечение травм роговицы
  • 2281082 Способ коррекции эстетических и возрастных проблем кожи
  • 2180576 Биоактивная добавка для косметических средств
  • 2280459 Средство для изменения скорости роста или репродукции клеток
  • 2179981 Соли переходного металла
  • 2378010 Жидкие вакцины
  • 2378008 Комбинированные вакцины
  • 2378007 Анаболическое средство
  • 2377973 Растительные экстракты
  • 2280041 Способ получения водорастворимых комплексов гиалурил
  • 2280038 Биополимеры
  • 2323733 Йодный обмен
  • 2377260 Гель
  • 2178693 Противовирусное средство на основе гиалуроновой кислоты
  • 2178692 Облегчающие зуд косметическое средство
  • 2377022 Гемостатические спреи
  • 2376982 Увлажняющая сыворотка для лица
  • 2376974 Трансдермальный гель для лица
  • 2362784 Гипо-и гиперацетилированные менингокковые капсульные сахариды
  • 2177789 Устройство для доставки лекарства к шейке матки
  • 2277954 Крем для лица омолаживающий
  • 2376378 Способ получения метионина
  • 2177332 Биоматериал для предотвращения послеоперационных спаек, с производной гиалуроновой кислотой
  • 2177310 Способ получения таблеток
  • 2376011 Средство для позвоночника
  • 2277410 Косметическое средство
  • 2323748 Медицинская повязка
  • 2276998 Гидрогелевые композиции
  • 2082416 Способ получения препарата с коллагенном из животного сырья
  • 2375081 Адсорбирующее изделие
  • 2375049 Охлаждающий пластырь
  • 2346049 Способ получения гиалурона
  • 2275913 Фармацевтические средства
  • 2174985 Полисахарид с антиоксидантом
  • 2373957 Носитель для лекарственных средств и биологически активных веществ
  • 2373941 Способ коррекции возрастных и патологических изменений кожных покров
  • 2174845 Композиции и способы доставки генетического материала
  • 2174830 Средство для укрепления волос
  • 2373769 Синбиотическая композиция
  • 2274472 Лечение апорно-двигательного аппарата и болевых синдромов
  • 2372929 Профилактическая композиция на основе веществ фенольной природы в липосомной форме
  • 2173563 Способ нанесения на поверхность предметов покрытия на основе гиалуроновой кислоты, её производных и полусинтетических полимеров
  • 2079304 фармацевтическая композиция, обладающая иммуносупрессорной и антимикробной активностью
  • 2273645 Полипептид ожирения
  • 2173154 Фракция кератансульфатолигосахаридов и содержащий ее фармацевтический препарат
  • 2173136 Грязная мазь
  • 2173128 Способ хирургического лечения центральных разрывов сечатки
  • 2078561 Косметическое средство предотвращающее старение кожи
  • 2172490 Способ прогнозирования воспалительных заболеваний молочной железы при эндопластике
  • 2272645 Способ лечения ЦМВ-Инфекции у детей раннего возроста
  • 2272636 Фармацевтическая композиция для местного лечения воспаления
  • 2272635 Фармацевтически активная субстанция для офтальмологии
  • 2272599 Биоматерьял для стабилизации прогрессирующей миопии "Коллаплант"
  • 2172168 Средство для заживления ран на основе гиалуроновой кислоты
  • 2371172 Фармацевтическая композиция для лечения нервной системы на основе стефаглабрина
  • 2171470 Способ прогнозирования послеоперационной трансформации доброкачественных опухолей нервной системы
  • 2077317 Состав для ванн
  • 2271213 Комбинированные композиции, содержащие экстракты из растений и морских животных
  • 2076872 Способ получения окрашенной гиалуроновой кислоты
  • 2076671 Раствор для защиты роговицы
  • 2370281 Конъюгаты гидроксиалкилкрахмал
  • 2370275 Способ лечения (коррекции) косметических и возрастных дефектов кожи
  • 2370258 Фармацевтическая композиция для парентальной доставки в форме лиофилизата
  • 2270023 Способ экстракции и очистки протеогликана хрящего типа (варианты)
  • 2369408 Гемостатическая композиция, включающая гиалуроновую кислоту
  • 2369387 Фармацевтическая композиция для лечения нервной системы
  • 2369379 Нетаблитированные жевательные формы для индивидуального введения
  • 2169136 Производное коричной кислоты
  • 70792 Медицинский аппликатор
  • 20741717 Способ стабилизации аскорбиновой кислоты
  • 2074712 Способ получения препарата, препятствующего преждевременной эякуляции
  • 2367954 Способ прогнозирования развития кожной патологии у женщин с синдромом склерополикистозных яичников (СПКЯ)
  • 2268075 Устройство для электрокинетической доставки
  • 2268052 Средство для лечения воспалительных и дегенеративных заболеваний суставов
  • 2167649 Способ получения твердой дисперсии умеренного водорастворимого лекарственного вещества
  • 2167647 Гель для бритья
  • 2073520 Лечение урологических инфекций
  • 2367476 Биопластический материал
  • 2367475 Мембрана для использования при направленной регенерации тканей
  • 2367469 Фармацевтическая композиция на основе лизоамидазы
  • 2367456 Фармацевтическая композиция обладающая антибактериальным и некролитическим действием
  • 2367455 Фармацевтическая композиция обладающая некролитическим и антибактериальным действием
  • 2267324 Применение антиадгезивных углеводов, препарат для уменьшения и /или блокирования адгезии патогенных веществ
  • 2166934 Композиции включающие биологический агент
  • 2166510 Псевдодипептиды
  • 2366460 Композиции, имеющие высокую противовирусную и антибактериальную активность
  • 2360901 Производные феноксиуксусной кислоты
  • 2165749 Способ восстановления эндотелия роговицы
  • 2265441 Способ укрепления склеры
  • 2365382 Композиции и способы для регуляции развития сосудов
  • 2070879 Соли гликозаминогликанов
  • 2164914 Циклические и гетероциклические N - замещенные - иминогидроксамовые карбоновые кислоты
  • 2264627 Хламидийный конъюктивит
  • 2364399 Фармацевтический препарат на основе стефаглабрина
  • 2264230 Препарат с замедленным высвобождением активного вещества
  • 2363497 Фармацевтические композиции
  • 2363496 Способ увеличения объема мягких тканей
  • 2363473 Способ антифлогистической активации в эксперементе
  • 2363461 Фармацевтический препарат на основе сигетина
  • 2363459 Средства для введения в роговицу глаз для предотвращения офтальмологических нарушений
  • 2363448 Фармацевтические композиции
  • 2163123 Глазные капли
  • 2162687 Усовершенствованнная лекарственная форма индуктора интерферана
  • 2162343 Биосовместимый полимерный материал и способ его получения
  • 2162327 Лечение рака
  • 2067841 Способ получения ароматизатора
  • 2161478 Способ консервированого лечения гонартроза
  • 2361617 Вольфрамовые частицы в качестве рентгеноконтрастных веществ
  • 2361552 Способы и устройства для дренирования жидкостей и понижения внутриглазного давления
  • 2066996 Способ изготовления пленочного материала для офтальмохирургии
  • 2361417 Корм с глюкозамином и экстрактом ивы для профилактики артроза у животных
  • 2161002 Пищевой общеукрепляющий лечебно-профилактический продукт из хрящевой ткани акул
  • 2360928 Комплексная матрица для медико-биологического применения
  • 2160574 Способ лечения глаукомы
  • 2360688 Способ лечения повреждений переферических нервов
  • 2360670 Фармацевтическая композиция при климактерических расстройствах
  • 2360646 Эндолюминальный протез
  • 2260445 Способ усовершенствования транспортировки через легко прспосабливаемый полупроницаемый барьер
  • 2260007 Производные амида
  • 2359975 Способ получения модифицированных арабиногалактанов
  • 2359974 Антигенные Пептиды
  • 2159775 Псевдопептидный продукт
  • 2259833 Фармацевтическая композиция для лечения роговицы глаза
  • 2259816 Ранозаживляющее средство
  • 2259815 Способ коррекции возрастных изменений, связанных с процессами старения кожи
  • 2359706 Способ сохранения офтальмологических растворов
  • 2359704 Антисептическое средство
  • 2359662 Микрокапсулы
  • 2159253 Катионные полимеры
  • 2159111 Средство для ухода за кожей лица
  • 2159105 Композиция для защиты кожи от опасных химических веществ Получение
  • 2158593 Биосовместимый водный раствор
  • 2358728 Способ лечения и предупреждения потери костной ткани
  • 2258517 Способ хирургического лечения травмотических повреждений селезенки пленкой на основе гиалуроновой кислоты
  • 2357968 Кристалические формы производной имидазола
  • 2357957 Ингибиторы P38 и их применение
  • 2157647 Пищевая добавка и ее получение
  • 2357758 Препараты для чрескожной и чересслизистой добавки
  • 2063244 Способ стабилизации растворов
  • 2063140 Способ получения препарата для консервирования мяса
  • 2157381 Способ получения гиалуроновой кислоты
  • 2257198 Композиции микроцастиц
  • 2356909 Белковый комплекс
  • 2356570 Косметическая композиция
  • 2256434 Способ закрытия перфорации барабанной перепонки
  • 2356520 Способ лечения постконтузионного повреждения сечатки глаза
  • 2156133 Гель
  • 2255945 Полимерная композиция
  • 2355761 Средства повторной дифференцировки
  • 2061043 Способ повышения устойчивости урокиназы к нагреванию
  • 2061005 Способ получения красителей для гистологических исследований
  • 2355420 Зубная паста
  • 2355385 Композиции пролонгированного действия с контролируемым высвобождением
  • 2355240 Способ получения пищевого препарата хондропротекторного действия
  • 2155057 Пихтово репейный бальзам
  • 2354409 Способ производства высвобождающих лекарственные средчтва медицинских устройств
  • 2254145 Раневое покрытие на основе коллаген-хитозанового комплекса
  • 2254133 Лечение и профилактика ВИЧ-инфекции у человека
  • 2253439 Фармацевтическая композиция для защиты и улучшения оптических свойств роговици при проведении эндовитреальных вмешательств
  • 2253437 Способ омоложения кожи
  • 2153352 Фармацевтическая композиция обладающая ранозаживляющим и противовоспалительным действием
  • 2353354 Фармацевтический препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
  • 2252787 Способ получения искусственной матрицы кожи
  • 2252767 Способ нормализации иммунобиохимического гомеостаза коров в предродовом и послеродовом периодах
  • 2352583 Фармацевтическая композиция содержащая Fc-область иммуноглобулина в качестве носителя
  • 2152403 Модифицированные полисахариды
  • 2352356 Иммуногенная композиция
  • 2352342 Исскусственный физиологический солевый раствор Способ его получения
  • 2352330 Фармацевтический препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
  • 2352323 Фармацевтический препарат с модифицированным высвобождением
  • 2152027 Способ подготовки ткани мозга для определения гликозаминогликанов
  • 2251842 Интектицидный состав для борьбы с личинками оводов
  • 2151580 Способ активации пролиферации эндотелия роговицы
  • 2351648 Дифференцировка стромальных клеток, полученных из жировой ткани, в эндокринные клетки поджелудочной железы и их использование
  • 2351595 N - гидроксиформамидные соединения в качестве ингибиторов металлопротеина
  • 2251411 Косметическое средство в лиофилизированной фармацевтической форме
  • 2251405 Косметика...ее композиции для косметических препаратов
  • 2251367 Средство со сшитой гиалуроновой кислотой для наращивания тканей
  • 2351359 Косметика для профилактики и лечения избыточной массы тела
  • 2351322 Препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
  • 2351153 Диета при остеортрите собак
  • 2350958 Способ определения групповой принадлежности синовальной жидкости
  • 2350625 Производные гиалуроновой кислоты с пониженной биодеградируемостью
  • 2150266 Крем после бритья
  • 2350354 Фармацевтическое средство содержащие антагонист и фактор некроза
  • 2350340 Способ коррекции процессов регенерации
  • 2350309 Способ лечения избыточной массы тела с помощью рефлексотерапии
  • 2250047 Профилактический продукт из хрящевой ткани гидробионтов
  • 2249467 Медицинский матерьял и изделия на его основе
  • 2055079 Способ получения препарата гиалуроновой кислоты
  • 2349599 Биоадгезив мидии
  • 2054903 Способ лечения коллагеноза у бычков на откорме
  • 2249210 Способ прогнозирования предрасположенности к развитию и тяжести течения деформирующего остеоартроза коленного сустава у взрослых
  • 2349339 Средство для соединительной ткани
  • 2148988 Человеческий интерферона
  • 2148399 Лечение атеросклероза
  • 2148396 Способ определения активного вещества в дифильных мазевых основах
  • 2148375 Способ диагностики близорукости
  • 2348415 Способ противоспаечной терапии после хирургического вмешательства
  • 2348400 Препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
  • 2348386 Способ непроникающего хирургического лечения первичной открытоугольной глаукомы
  • 2248213 Лечение Галактозидальной А недостаточности
  • 2347586 Микрофлюидизированные эмульсии типа "масло в воде" и вакцинные средства
  • 2147243 Контрастное средство
  • 2146526 Лечебный препарат дисбактериоза и урогенитальных инфекций
  • 2146148 Терапевтическое применение фактора роста кератиноцитов (ФРК)
  • 2146139 Способ повышения активности макрофагов и комбинации для его осуществления
  • 2346277 Способ диагностики специфического синовита
  • 2345793 Ультразвуковые контрастные вещества и их получение
  • 2345782 Терапевтические комбинации на основе PORIFERA для лечения и предотвращения кожных заболеваний
  • 2245131 Способ коррекции косметических недостатков кожи
  • 2245130 Способ активации восстановительных процессов в коже
  • 2144833 Хондроитиназа
  • 2344809 Получение твердых дозированных форм с использованием сшитого нетермопластичного носителя
  • 2244540 Косметический гель для ухода за кожей лица
  • 2244536 Способ лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний тазобедренного сустава
  • 2344167 Хмелевый экстракт
  • 2143884 Агент регулирования дифференциации клеток кожи, культурная среда для клеток или тканей и способ регулирования дифференциации клеток кожи
  • 2343932 Способ получения обладающих пониженной растворимостью в воде пленночных материалов
  • 2343903 Устройство доставки лекарств для контролируемого введения препаратов
  • 2048817 Способ получения материала для лечения ожогов и гнойно - некронических ран
  • 2048803 Гидратантный крем
  • 2242974 Средства и способы лечения воспалительных заболнваний
  • 2142816 Способ получения антигерпетической вакцины
  • 2342923 Средство для обработки рук с увлажняющим эффектом
  • 2142781 Косметика для макияжа ресниц и бровей и агент ингирирующий рост микроорганизмов в косметических средствах
  • 2242251 Трансплантируемые стенты с биоактивными покрытиями
  • 2142257 Способ обработки глазных имплантантов и контакных линз
  • 2342389 Мононатриевая соль
  • 2342107 Способ устранения западения верхнего века при анофтальме
  • 2141828 Средство, пролонгирующее эффективность чесночного порошка
  • 2241489 Косметическое средство матриксных протеинов для залечивания ран
  • 2241443 Средство для лечения герпеса
  • 2241414 Способ получения протезов кровеносных сосудов
  • 2341539 Гидрогель
  • 2141324 Регулятор скорости воздействия препарата для инъекций
  • 2141312 Косметическое средство для ухода за кожей лица
  • 2341296 Средства и способы покрытия медицинских имплантантов
  • 2341272 Средство для неспецифической иммунотерапии
  • 2341266 Стенты с нанесенным покрытием содержащим N - (5-(4-(4-
  • 2341257 Иммуномодулирующее средство
  • 2341255 Средство для лечения климактерических расстройств
  • 2240821 Способ лечения урологических инфекций
  • 2140786 Способ лечения лишая
  • 2140243 Способ хирургического лечения диабетической ретинопатии и отслоек сечатной оболочки
  • 2240140 Медицинская многослойная повязка и изделия на ее основе
  • 2240135 Культура клеток, содержащая клетки - предшественники остеонегеза, имплантант на ее основе и его использование для восстановления целостности кости
  • 2240123 Экзогенные биологически активные коньюгирующие вещества
  • 2139886 Фотоотвержаемое производное гликозаминогликата, сшитое производное гликозаминогликата и способы их получения, способ предотвращения клеточной и тканевой адгезии
  • 2139729 Вакцина. Способ стимулирования иммунной системы
  • 2339386 Средство обладающее радио - и химиозащитным действием
  • 2339369 Лечение офтальмологических нарушений с использованием мочевины и ее производных
  • 2139041 Гидратантный регенерирующий крем и способ его получения
  • 2139039 Косметический суперкрем для ухода за кожей
  • 2139017 Способ получения боисовместимого материала
  • 2138503 Производные камптотецина, способы их получения, уникальное средство
  • 2338556 Средство содержащие антагонист Р2Х - рецептора и нестероидное противоспалительное лекарственное средство
  • 2338514 Косметическое средство для профилактики старения кожи
  • 2138297 Медицинские устройства, подверженные вызываемому разложению
  • 2138295 Покрытие для ран
  • 2337906 Ингибиторы цитозольной фосфолипазы А2 Применение физиологически допустимого корпускулярного ферримагнитного или ферромагнитного материала. Способ формирования магнитометрического изображения
  • 2137501 Устройство формирования изображения
  • 2137477 Способ лечения заболеваний характеризующихся аутоиммунной агрессией
  • 2137467 Крем для кожи лица и тела
  • 2137449 Способ коррекции дефектов преломления в глазу млекопитающего
  • 2137402 Пищевая Добавка БАД
  • 2336899 Способ стимуляции миелопоэза
  • 2336862 Способ получения раствора для лечения роговицы
  • 2336830 Способ восстановления костных структур челюсти
  • 2136696 Новый полипептид и средство против ВИЧ - Инфекции
  • 2336092 Биоадгезивное средство, по существу свободное от воды
  • 2336089 Средство и способ лечения заболеваний периодонтальных и пульпы
  • 2336074 Средства и способы лечения заднего сегмента глаза
  • 2235548 Ранозаживляющее средство
  • 2135186 Способ лечения рефлекторных синдромов при остеохондрозе
  • 2234945 Стабилизатор водного раствора и водосодержащего сырья
  • 2334762 Растворимая ассоциативная карбоксиметилцеллюлоза
  • 2234514 Макропористые хитозановые гранулы и способ их получения. Способ культивирования клеток
  • 2133615 Средство для лечения неврологических заболеваний
  • 2233164 Способ профилактики развития послеоперационных спаек брюшной полости
  • 2133127 Неткатный материал, способ его получения и способ лечения
  • 2333223 Альдегидные производные сиаловой кислоты и средства на их основе
  • 2333007 Полипептидные вакцины для широкой защиты против рядов поколений менингококов с повышенной вирулентностью
  • 2332985 Дозированные формы анестезирующих средств с длительным высвобождением для обезболивания
  • 2132677 Косметическая маска
  • 38603 Пленочный аппликатор
  • 2232594 Средство содержащие ингибирующие остеокластогенез фактор и полисахарид
  • 2332238 Средство для прокладок, раневых повязок и других изделий, контактирующих с кожей
  • 2331668 Стромальные клетки, получение из жировой ткани, для заживления дефектов роговицы и внутриглазных дефектов и их использование
  • 2331438 Альфа - 2 - Дельта Лигант для лечения симптомов нижних мочевыводящих путей
  • 2331411Электропряденые аморфные фармоцевтические средства
  • 2331367 Способ профилактики образования спаек и их рецидива
  • 2130767 Масло в воде для получения косметических и дерматологических средств, способ косметической обработки
  • 2230752 Поперечносшитые гиалуроновые кислоты и их применение в медицине
  • 2230558 Способ восстановления и сохранения здоровья скмьи
  • 2230550 Средства длительного высвобождения, способ их получения и применения
  • 2230458 Поддержания здоровья суставов
  • 2330290 Способ определения состояния метаболических процессов в ткани суставного хряща
  • 2230073 Способ поперечного сшивания карбоксилированных полисахаридов
  • 2329059 Способ лечения полипозного риносинусита
  • 2329037 Комбинированная терапия для лечения иммуновоспалительных заболеваний
  • 2128666 Гиалуроновая кислота и ее соли, способ очистки гиалуроновой кислоты, способ получения гиалуроновой кислоты. Фармацевтический препарат с гиалуроновой кислотой и средства с гиалуроновой кислотой используемые в офтальмологии
  • 2328740 Способ экспресс - оценки действия зубных паст
  • 2128502 Косметический гель
  • 2328272 Суппозитории индуктора интерферона
  • 2328268 Косметика содержащая амфолитный сополимер
  • 2128057 Композиционная мембрана, способ ее получения и способ направленной регенерации тканей с ее применением
  • 2128055 Средство замедленного освобождения и способ его получения
  • 2128049 Свечи
  • 2227743 Полипептидные варианты с повышенной гепаринсвязывающей способностью
  • 2326893 Ковалентное и нековалентное сшивание гидрофильных полимеров
  • 2326697 Новый перевязочный материал для быстрого заживления раневой поверхности кожи
  • 2126264 Фармацевтическое средство с гиалуроновой кислотой
  • 2326137 Способ получения содержащих альгинат пористых формованных изделий
  • 2325902 Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани
  • 2225195 Репелленты против насекомых
  • 2325193 Сосудистый стент
  • 2325184 Улучшенные везикулы наружной мембраны бактерий
  • 2325153 Многокомпонентная фармацевтическая дозированная форма
  • 2325152 Удерживаемая в желудке система регулируемой доставки лекарственного средства
  • 2029955 Способ предоперационного определения помутнения задней капсулы хрусталика при экстракции катаракты
  • 2324688 Производные бисбензизоселеназолонила с противоопухолевым, противовоспалительным и антитромбоническим действием
  • 2323017 Устройство и способ контролируемый доставки активных веществ в кожу
  • 2323011 Содержащий Коллаген I и Коллаген II способный к рассасыванию внеклеточный матрикс, предназначенный для реконструирования хряща
  • 2322955 Способ изготовления имплантанта для пластики дефектов хрящевой ткани
  • 2322454 Антитело против CCR5
  • 2322263 Система продолжительного высвобождения растворимого лекарственного средства
  • 2221561 Витамин Е и его сложные эфиры
  • 2321634 Гены участвующие в метаболизме углерода и продуцировании энергии
  • 2321597 Биоматерьял, способ его приготовления и его применение, медицинское средство, имплантант и вкладыш
  • 2121340 Средство для похудения
  • 2220737 Средство для улучшения состояния опорно-двигательного аппарата
  • 2220729 Гель используемый в стоматологии
  • 2320720 Способ культивирования фибропластов для заместительной терапии
  • 2320378 Накожный аппликатор
  • 2320369 Средства, содержащие Альфа - 2 - Дельта Лиганды и ингибиторы обратного захвата серотонина/норадреналина
  • 2320362 Местные фармацевтические средства, содержащие проантоцианидины, для лечения дерматитов
  • 2320322 Биоадгезивная доставка лекарств
  • 2320318 Чувствительное к температуре изменяющие состояние средство гидрогеля
  • 2025120 Способ получения препарата, содержащего Фактор /G-CSF/, стимулирующий рост колоний гранулоцитов
  • 2319490 Средство для введения железа при лечении синдрома беспокойных ног
  • 25995 Содержащее адгезив приспособление для фиксации зубных протезов в полости рта
  • 2218907 Средство для ухода за кожей лица и веками
  • 2318830 Способ получения модифицированного дерматансульфата
  • 2118153 Косметика - туш для ресниц
  • 2217441 Способ получения полимера
  • 2317296 Изетионатная соль селективного ингибитора CDK4
  • 2217171 Мембрана для использования при направленной регенерации тканей
  • 2317095 Экстракты ECHINACEA ANGUSTIFOLIA
  • 2216332 Препарат для лечения астроза
  • 2216314 Крем - маска для обезвоженной кожи
  • 2316333 Средство оздоровительно-восстановительных косметических панто-магниевых ванн
  • 2021304 Способ получения биологически активного средства
  • 2115662 Способ получения гиалуроновой кислоты
  • 2315627 Впрыскиваемые имплантанты на керамической основе для заполнения морщин, кожных впадин, шрамов
  • 2315623 Средство получаемое путем лиофилизации препарата
  • 2114862 Способ получения гиалуроновой кислоты
  • 2314791 Лечебно-Косметическое средство
  • 2314791 Косметический крем-бальзам для ухода за кожей лица и шеи
  • 2214600 Способ оценки эффективности лечения неврологических проявлений
  • 2114602 Способ косметической обработки
  • 2114587 Раствор для защиты роговицы
  • 2214283 Имплантант для подкожного или внутрикожного введения
  • 2313370 Медицинские протезы, имеющие улучшенную биологическую совместимость
  • 2313356 Препарат для лечения демодекоза
  • 2313338 Средство на основе этиллинолеата и триэтилцитрата для лечения себореи и угрей
  • 2313328 Косметика содержащая тонкодисперный и пористый порошок
  • 2212880 Способ получения препарата содержащего антибиотик, с замедленным высвобождением активного вещества
  • 2312640 Способ лечения Блефароконьюнктивальной формы синдрома сухого глаза
  • 2017751 Способ получения гиалуроновой кислоты
  • 2312145 Гены CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM, кодирующие белки, участвующие в синтезе мембран и мембранном транспорте
  • 2311458 Белки вызывающие измененную иммуногенную реакцию. Способ их получения и использования
  • 2311183 Улучшенное разделение с использованием гталуроновой кислоты
  • 2311177 Ингибиторы интегрина для лечения заболевания глаз
  • 2300069 Косметическая маска
  • 2211024 Уход за сухой кожей
  • 2310440 Раствор для защиты роговицы от повреждений
  • 2309684 Лечение межфалангового остеоатроза узелковой формы
  • 2309406 Способ мониторинга фиброза печени у больных хроническим гепатитом с (ХГС)
  • 2209088 Опосредованная рецепторами доставка генов с использованием векторов на основе бактериофагов
  • 2308967 Уменьшение объема ткани
  • 2308962 Средство для опорно-дигательного аппарата
  • 2308957 Способ получения препарата для мезотерапии
  • 2308954 Средство для лечения ран, содержащее плазму или сыворотку крови
  • 2308951 Комплексный способ профилактики вагинальных дисбактериозов
  • 2308937 Косметическая биологически активная добавка и косметический литофитокомплекс на ее основе
  • 2208638 ДНК (варианты), способ получения белка
  • 2207885 Способ подачи небольшого объема лечебного раствора к целевому месту
  • 2207858 Лишенные побочных эффектов производные простагландинов для лечения глаукомы
  • 2207845 Твердая лекарственная форма пролонгированного действия
  • 2207844 Препарат для местного неинвазивного применения
  • 2207841 Средства с антиферментативным действием
  • 2306335 Стволовые клетки и решетки полученные из жировой ткани
  • 2306140 Новые рецепторы для Helicobacter pylori и их применение
  • 2205612 Способ эндотелизации IN VITRO протезов кровеносных сосудов
  • 2105540 Депигментирующее средство
  • 2304960 Косметическое средство для кожи
  • 2304616 Гены участвующие в гомеостазе и адаптации
  • 2204550Способ получения длинноцепочечной N-Ацилированной кислотой Аминокислот
  • 2204415 Способ получения изображения
  • 2204394 Средство для лечения грибковых инфекций, желудочных язв
  • 2204366 Способ хирургического лечения глаукомы
  • 2104034 Вагинальное увлажняющие средство, способ его получения
  • 2303991 Биологически активная добавка
  • 2303990 БАД
  • 2303973 Адсорбирующее изделие
  • 2203676 Средство обладающее иммунокорригирующим действием
  • 2203672 Способ предупреждения беременности
  • 2303635 Гены кодирующие белки резистентности и толерантности к стрессам
  • 2303529 Способ фиксации альгинатного геля на твердой фазе, способ получения клеточного чипа на его основе
  • 2203078 Способ лечения гнойных ран
  • 2302412 Гидразоно-малонитрилы
  • 2102400 Способ получения гиалуроновой кислоты
  • 2202356 Способ стимуляции репаративных процессов длительно незаживающих ран и трофических язв
  • 2202336 Средство для ухода за кожей
  • 2302231 Глазные капли
  • 2102082 Способ магнитометрического исследования тела человека или животного
  • 2301814 Полиакриламидный гидрогель
  • 2201765 Гибридные матричные имплантанты и эксплантанты
  • 2301677 Биотрансплантант для лечения дегенеративных и трвматических заболеваний хрящевой ткани и способ его получения
  • 2301676 Способ лечения ревматизма
  • 2301674 Способ лечения больных с переломами нижней челюсти
  • 2301661 Средство с регулируемым освобождением и способ его получения
  • 2005488 Средство для лечения болезней соединительной ткани
  • 2200001 Крем для кожи

 

 
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
 Патент №2146148

(54) ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ФАКТОРА РОСТА КЕРАТИНОЦИТОВ (ФРК)

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины. На основе многочисленных экспериментов на животных in vivo было показано, что ФРК стимулирует пролиферацию, рост и дифференцировку различных клеток эпителиальной ткани, отличных от кератиноцитов. Лучшее понимание биологического действия ФРК in vivo позволяет использовать этот полипептид в качестве терапевтического агента, входящего в состав различных фармацевтических композиций, предназначенных для специфического лечения заболеваний и болезненных состояний, затрагивающих такие ткани и органы, как печень, легкие, пищеварительный тракт и экстраэмбриональные структуры кожи. Сущность изобретения состоит в том, что разработан способ стимулирования образования некератиноцитных эпителиальных клеток путем контактирования этих клеток с эффективным количеством ФРК. Некератиноцитные клетки выбраны из группы: себоциты, клетки волосяных фолликулов, гепатоциты, пневмоциты типа II, муцинпродуцирующие бокаловидные клетки и другие эпителиальные клетки и их предшественники, обнаруживаемые в коже, легких, печени и желудочно-кишечном тракте. Техническим результатом изобретения является расширение арсенала способов регенерации поврежденных или больных клеток и тканей. 2 с. и 6 з.п.ф-лы, 24 ил. Изобретение относится к применению фактора роста кератиноцитов (ФРК) для стимулирования пролиферации, роста и дифференцировки клеток, отличных от кератиноцитов, а также предусматривает введение ФРК пациентам, для которых указанные биологические эффекты могут быть полезны при регенерации поврежденных или больных клеток и тканей. Достижения биотехнологии в последние годы привели к разработке и терапевтическому применению новых рекомбинантных полипептидов, включая эритропоэтин и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, что принесло реальную пользу многим больным. Был открыт ряд и других полипептидов, обладающих биологическими эффектами in vitro. Однако для выяснения потенциальных терапевтических применений таких факторов необходимо установить, какие клетки являются мишенями их действия и определить биологические эффекты данных факторов in vivo. ФРК - известный митоген, первоначально идентифицированный как специфический ростовой фактор эпителиальных клеток, в частности кератиноцитов. Rubin et al. , Proc. Natl.Acad.Sci.USA 86:802-806 (1989); Finch et al., Science, 245: 752-755 (1989); Marchese et al., J.Cell. Phys. 144:326-332 (1990). Экспрессия мРНК ФРК была обнаружена в нескольких линиях стромальных фибробластов, полученных из эмбриональных, неонатальных и тканей взрослого человека. Эта РНК была выделена из нормальной взрослой почки и желудочно-кишечного тракта. Подобная РНК не была обнаружена в глиальных клетках, легких, мозге или же различных клеточных линиях эпителиальной природы, таких как чешуеклеточные карциномы, эпителиальные клетки молочной железы, иммортализованные клетки эпителия бронхов, иммортализованные кератиноциты, а также в культурах первичных кератиноцитов (Finch et al. Science, см. выше). Однако ФРК митогенно активен в отношении клеток перевиваемой мышиной линии BALB/MK. Weismaim and Aaronson, Cell, 32:599 (1983), см. также PNAS и Science выше. Это наблюдение свидетельствует в пользу паракринного действия ФРК в коже с образованием ФРК в дермисе (но не в эпидермисе) и влияния ФРК на кератиноциты. Кроме того, экспрессией генов филагрина и кератинов было показано влияние ФРК на дифференцировку и созревание кератиноцитов. Cм. J.Cell.Phys. выше. Большинство упомянутых работ по исследованию биологической активности ФРК было выполнено с использованием рекомбинантного ФРК, доступность которого позволила значительно расширить изучение данного фактора. В опубликованной заявке PCT (WO) 90/08711 описана очистка ФРК из кондиционированной среды линии клеток эмбриональных фибробластов человека, частичная аминокислотная последовательность выделенного полипептида, клонирование гена и его экспрессия в бактериальных клетках (E.coli) для получения рекомбинантного, биологически активного ФРК. Поскольку роль ФРК как стимулирующего агента для кератиноцитов in vitro была точно установлена, предстояло изучить, на какие другие типы клеток ФРК может воздействовать как ростовой фактор и охарактеризовать эти возможные воздействия in vivo. Для понимания возможной роли ФРК как терапевтического препарата подобная информация была особенно необходима. Вкратце, настоящее изобретение основано на обнаружении стимулирующего воздействия ФРК на эпителиальные клетки, отличные от кератиноцитов. В частности, в настоящее время установлено, что in vivo ФРК индуцирует пролиферацию и дифференцировку в таких нормальных экстраэмбриональных структурах, как себоциты (клетки сальных желез) и клетки волосяного фолликула, гепатоциты и клетки слизистого дыхательного эпителия (пневмоциты типа II). Имеются также серьезные указания на то, что ФРК стимулирует пролиферацию и рост клеток слизистой оболочки пищеварительного тракта, таких как муцинобразующие бокаловидные клетки железистой части желудка и тонкого кишечника, клетки крипт прямой кишки и другие эпителиальные клетки пищеварительного тракта. Данные наблюдения, послужившие основой настоящего изобретения, могут иметь существенное значение для коррекции нарушений, связанных с повреждением или недостаточностью указанных типов клеток. Далее описаны заболевания и медицинские показания, по которым может быть применен ФРК согласно настоящему изобретению. Стимуляция пролиферации и дифференцировки таких экстраэмбриональных структур, как волосяные фолликулы, потовые железы и сальные железы, являются чрезвычайно важными для регенерации эпидермиса и дермы у пациентов с ожогами и другими повреждениями кожи различной глубины. В настоящее время поверхностные повреждения заживляются путем образования шрамов с выходом на поверхность кератиноцитов; полная регенерация кожи все еще невозможна. Репопуляции волосяных фолликулов, потовых желез и сальных желез на всю толщину дефектов кожи, включая ожоги, все еще не происходит. Использование ФРК делает возможной эту репопуляцию. Буллозный эпидермолиз (болезнь Гольдшейдера) представляет собой нарушение прикрепления эпидермиса к подлежащей дерме, что проявляется в образовании открытых болезненных волдырей. Ускоренная реэпителизация таких повреждений, достигаемая применением ФРК, привела бы к снижению риска инфицирования, снижению болезненности и меньшей частоте перевязок. В ходе химиотерапии неоплазий у большого числа больных наблюдается облысение как результат такой терапии. В настоящее время нет терапевтических средств, которые предотвращали бы гибель клеток волосяных фолликулов, приводящую к временной потере волос. ФРК может служить таким терапевтическим средством. Облысение у мужчин широко распространено и практически не поддается лечению. Прогрессирующая утрата волос у мужчин и женщин является серьезной косметологической проблемой. Это нарушение могло бы излечиваться системным или же местным применением ФРК при абсорбции препарата кожей головы или путем распыляющих инъекций в кожу головы при помощи воздушного пистолета или других подобных методов введения. Язвы желудка, хотя и поддающиеся лечению H2-антагонистами, широко распространены и часто возобновляются снова и снова. Их заживление происходит через образование рубца на слизистой оболочке. Возможность ускоренной регенерации железистой слизистой оболочки благодаря применению ФРК стала бы значительным усовершенствованием терапии язв желудка. Как и язвы желудка, язвы двенадцатиперстной кишки поддаются лечению, однако разработка терапевтического агента для более полной и более быстрой регенерации слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки явилась бы значительным достижением. Безусловно, терапевтический агент для регенеративного заживления таких язв и снижения частоты их рецидивов был бы весьма полезен. ФРК обладает таким потенциалом. Воспалительные заболевания кишечника, такие как болезнь Крона (затрагивающая в основном тонкий кишечник) и язвенный колит (поражающий в основном толстый кишечник), а также эрозия желудка и пищевода, эрозивный гастрит, эзофагит или эзофагитный рефлюкс - это хронические заболевания невыясненной этиологии, приводящие к разрушению слизистой оболочки, воспалению, образованию рубцов и спаек при заживлении. Частота этих заболеваний довольно высока. Существующая на сегодня терапия в основном направлена на сдерживание воспаления. Такие терапевтические средства как ФРК, стимулирующие восстановление слизистой оболочки и приводящие к более быстрому заживлению, могут оказаться чрезвычайно полезными при лечении подобных заболеваний. Основным ограничением для различных схем химио- и радиотерапии является токсичность соответствующих терапевтических факторов для клеток пищеварительного тракта. Предварительное введение ФРК может иметь протективный эффект в отношении слизистой оболочки тонкого кишечника, что позволит увеличить дозы химио- и радиотерапии с уменьшением нежелательных побочных эффектов. Воздействие ФРК приводит к значительному увеличению образования слизи в пищеварительном тракте. Эта особенность может иметь существенное значение для защиты слизистой оболочки от повреждающих веществ, попадающих в пищеварительный тракт, или же препятствовать распространению повреждений в случае воспалительных процессов в кишечнике. Поражения гиалиновых мембран у недоношенных младенцев приводят к отсутствию поверхностного образования пневмоцитов типа II в легких, что в свою очередь ведет к разрушению альвеол. Хотя кортикостероиды могут в значительной степени ускорять созревание пневмоцитов у плода, начиная с двадцативосьминедельного возраста, подобной терапии для эмбрионов более раннего возраста не разработано, что приводит к значительной смертности. Такой терапевтический агент как ФРК, индуцирующий пролиферацию и дифференцировку пневмоцитов типа II, значительно облегчил бы лечение подобных заболеваний. Отравление дымом через дыхательные пути является серьезной причиной смертности в первую неделю ведения послеожоговых больных, что обусловлено некрозом бронхиолярного эпителия и альвеол. Такой ростовой фактор как ФРК, способный индуцировать пролиферацию и дифференцировку указанных структур, может внести существенный прогресс в лечение отравлений такого рода. При эмфиземе легких наблюдается прогрессирующая утрата альвеол. ФРК может стимулировать рост новых альвеол и защищать оставшиеся, что безусловно имеет терапевтическое значение. В настоящее время эффективная терапия эмфизем не разработана. Цирроз печени, развившийся как следствие вирусного гепатита или хронического употребления алкоголя, имеет высокую частоту и является серьезной причиной смертности. Пролиферация и дифференцировка гепатоцитов, индуцированная ФРК, может улучшить работу печени и затормозить или предотвратить развитие цирроза. Острая печеночная недостаточность, развивающаяся на конечной стадии цирроза, представляет угрозу для жизни. Препарат, который подобно ФРК способен индуцировать пролиферацию оставшихся гепатоцитов, будет оказывать терапевтический эффект в случае острой печеночной недостаточности, единственным методом лечения которой на сегодня является пересадка печени. Острый вирусный гепатит часто имеет субклиническое и непродолжительное течение. Однако у небольшой части больных острое поражение печени может наблюдаться в течение нескольких недель. Цитопротективный агент, подобный ФРК, способен предотвратить гепатоцеллюлярную дегерацию. Печеночные отравления, вызванные ацетаминофеном, галотаном, четыреххлористым углеродом и другими ядами, могут быть облегчены применением ростового фактора (ФРК), цитопротективного по отношению к гепатоцитам. Таким образом, настоящее изобретение посвящено терапевтическому (а в отдельных случаях и профилактическому) применению ФРК при указанных болезненных состояниях, а также фармакологическим препаратам, содержащим ФРК в терапевтических дозах. На фиг.1 представлена нуклеотидная последовательность синтетического олигонуклеотида, использованного для получения рекомбинантного ФРК, который в свою очередь был использован в описанных ниже экспериментах in vivo. На фиг.2 представлено модельное повреждение уха кролика на неполную толщину дермы, затрагивающее хрящ и которое позволяет количественно оценить рост новой ткани. На фиг. 3 отражена реэпителизация обработанных ФРК и контрольных модельных повреждений, описанных на фиг.2. Слева показана общая площадь регенерирующего эпителия после обработки ФРК, а справа - процент реэпителизации ран. На фиг.4 показана пролиферация базальных и супрабазальных кератиноцитов на краях раны на пятый день после обработки ФРК с использованием той же модельной системы. На фиг. 5 приведен гистологический анализ обработанных бромдезоксиуридином (BrdU) волосяных фолликулов в контрольных и обработанных ФРК ранах. Видна пролиферация клеток. На фиг.6 представлена окраска красным масляным красителем сальных желез в контрольных и обработанных ФРК ранах. На фиг. 7 и 8 показано микрососочковое разрастание эпителиальных клеток перегородок альвеол в легких здоровых крыс, интратрахеально обработанных ФРК. На фиг.9 и 10 показан кубоидальный рост эпителиальных клеток в альвеолах больших сегментов легких после интратрахеального введения ФРК тем же здоровым крысам. На фиг. 11 и 12 видно, что гиперпластические эпителиальные клетки, выстилающие перегородки альвеол, у крыс, обработанных ФРК, содержат пластинчатые включения различного размера и формы. На фиг. 13A показано гиперпластическое воздействие ФРК на бронхиальный эпителий после интратрахеального введения здоровым крысам. На фиг.13B показан бронхиальный эпителий крыс контрольной (по отношению к представленным на фиг.13A) группы. На фиг. 14 представлены результаты теста защиты от РНКазы РНК рецептора ФРК в легких взрослой крысы. На фиг.15 показано увеличение веса органов пищеварительного тракта и печени в зависимости от дозы применяемого в течение четырех дней ФРК. На фиг.16 показано увеличение синтеза белка в печени крыс, обработанных ФРК в течение четырех дней. Фиг. 17 демонстрирует увеличение пролиферации гепатоцитов в печени животных, получавших ФРК от одного до семи дней. Уровень пролиферации определяли путем мечения BrdU (A) или подсчетом митозов (B). На фиг.18 и 19 показано восстановление массы печени после обработки ФРК у крыс, перенесших частичную гепатоэктомию. На фиг. 20 показано увеличение уровня сывороточной глутаматоксалоацетат трансаминазы (СГОТ) в сыворотке отравленных четыреххлористым углеродом крыс. Увеличение наступило в результате обработки ФРК. На фиг.21 показано увеличение длины желудочных желез и количества слизи, образуемой в железистом желудке крыс, получавших ФРК от одного до семи дней. На фиг.22 показано увеличение длины дуоденальных крипт и количества слизи, образуемой в тонком кишечнике крыс, получавших ФРК от одного до семи дней. На фиг. 23 показано увеличение доли гиперпластических крипт в толстом кишечнике крыс, получавших ФРК от одного до семи дней. На фиг. 24 показано увеличение глубины крипт в толстом кишечнике крыс, получавших ФРК от одного до семи дней. Для определения специфических типов эпителиальных клеток, на которые ФРК оказывает значительный биологический эффект, обусловливающий возможное терапевтическое применение, были предприняты широкие исследования на животных с введением ФРК in vivo и тщательным анализом полученных результатов. Рекомбинантный ФРК, использованный в каждом из приведенных ниже примеров, получали следующим образом:

Рекомбинантный ген ФРК был синтезирован полимеразной цепной реакцией на основе РНК фибробластов крайней плоти человека (AG1523) и полученная ДНК был встроена в вектор экспрессии pCFM1156 между сайтами рестрикции NdeI и BamHI. Плазмида pCFM1156 может быть получена из плазмиды pCFM836, описанной в патенте США N 4,710,473, путем удаления двух эндогенных сайтов рестрикции NdeI с заполнением концов при помощи T4-полимеразы, последующим лигированием по тупым концам и замещением небольшого фрагмента ДНК между уникальными сайтами рестрикции ClaI и KpnI следующим олигонуклеотидным дуплексом, состоящим из последовательности N 1 и последовательности N 2:



Плазмида pCFM1156KGF была затем введена в клетки FM5 при помощи стандартной процедуры электротрансформации (прибор BioRad Gene Pulser). Для снижения внутренней инициации трансляции последовательность ДНК в гене ФРК между сайтами рестрикции KpnI и EcoRI была заменена синтетическим олигонуклеотидом, сконструированным таким образом, чтобы снизить возможность использования внутреннего сайта связывания рибосом (фиг.1). После лигирования и трансформации клеток FM5 был отобран клон, содержащий плазмиду pCFM1156KGF-dsd. Правильность последовательности нуклеотидов гена ФРК в данной плазмиде была подтверждена секвенированием. Клетки затем культивировали при 30oC в 10-литровых ферментерах в стандартной ростовой среде, что позволяло клеткам достичь экспоненциальной фазы роста в условиях дефицита глюкозы, предотвращающего накопление токсичных побочных продуктов. При средне-экспоненциальной плотности клеток температуру кратковременно поднимали до 42oC, чтобы индуцировать транскрипцию гена ФРК, а затем поддерживали на уровне 37oC на протяжении всего оставшегося времени ферментации. Клеточную массу собирали и хранили в замороженном состоянии. Биологически активный ФРК очищали из механически лизированных бактерий стандартными хроматографическими методами, используя тот факт, что белок имеет очень высокую изоэлектрическую точку (колонки с S-сефарозой Fast Flow фирмы Pharmacia) и размер (Superdex 75 Pharmacia). Очищенный рекомбинантный ФРК проверяли на наличие эндотоксинов и на биологическую активность в митогенном тесте, как описано Rubin с coaвт (см. PNAS, выше). Пример 1. ФРК-СТИМУЛИРУЕМЫЕ ПРОЛИФЕРАЦИЯ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ЭКСТРАЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТРУКТУР НА МОДЕЛИ ЗАЖИВЛЕНИЯ РАН IN VIVO

В настоящем Примере была использована раневая модель с повреждением уха кролика на неполную толщину дермы. Модель кожной язвы на ухе кролика, описанная Mustoe et al., (J.Clin. Invest., 87:694-703, 1991), была модифицирована с образованием раны через хрящ до дермиса с обратной стороны уха с помощью 6 мм трепана. В результате заживление раны происходило распространением эпителиальных элементов под хрящом, сжатие раны в процессе заживления было невелико, что давало возможность точно оценить размеры вновь образуемых тканей (см. фиг.2). В качестве терапевтического агента для заживления ран был использован рекомбинантный ФРК, полученный описанным выше способом. Материалы и методы

ФРК или, в контроле, растворитель (фосфатный буферный раствор) наносились однократно в день операции и раны (площадью 0.25 см кв.) закрывали специальным защитным покрытием Tegaderm (3М Company, St.Paul, MN). Перед забоем каждому животному внутривенно вводили BrdU (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) в количестве 50 мг на килограмм веса тела. Введение BrdU давало возможность количественно оценить степень пролиферации базальных кератиноцитов и кинетику миграции базальных клеток по направлению к сосочковому слою и роговому слою. После забоя из каждой раны было приготовлено два образца, один образец замораживали в "среде оптимального охлаждения" (COO, Miles Inc., Elkhardt, IN), второй образце фиксировали в среде Omnifix (AI-Con, Genetics Inc., Melville, NY), а затем подвергали обработке согласно стандартным гистологическим методам. Срезы толщиной 3 мкм, приготовленные из каждой раны, окрашивали Masson Trichrome, масляным красным, а также иммуногистохимически. Измерение реэпителизации

Измерения полного просвета раны и эпителиального просвета для каждой раны производили с помощью калиброванного стационарного микрометра. Процент реэпителизации для каждой раны рассчитывали, деля разницу в площади между полным просветом и эпителиальным просветом на площадь полного просвета. Данные для двух срезов каждой раны усредняли. Отклонения в измерениях эпителиального просвета и в проценте реэпителизации анализировали по распределению Стьюдента. Для каждой использованной дозы ФРК рассчитывали площадь вновь образованного эпителия в опыте и в контроле. Результаты этих экспериментов были обработаны по методам Даннетта и ANOVA (вероятностные тесты). Измерение пролиферации и дифференцировки эпителиальных клеток

Парафиновые срезы тканей толщиной 3 мкм окрашивали антителами против BrdU (Dako Corp. Carpinteria.CA), авидинбиотиновым комплексом (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) и диаминобензидином (ДАБ, Sigma Chemical Co., St. Louis, МО). Срезы обрабатывали 0,1% раствором протеазы, а затем 2н. HCl. Эндогенную пероксидазу подавляли обработкой 3%-ной перекисью водорода. Срезы обрабатывали 10%-ным раствором нормальной лошадиной сыворотки в фосфатном буферном растворе, а затем инкубировали с анти-BrdU антителами в разведении 1: 400 в 1%-ном бычьем сывороточном альбумине. После отмывания срезы инкубировали 20 минут в конъюгированном с пероксидазой авидинбиотиновом комплексе в разведении 1:100 в 1%-ном бычьем сывороточном альбумине. Затем срезы обрабатывали ДАБ (10 мг ДАБ, 20 мл фосфатного буферного раствора, 20 мкл 30% перекиси водорода) в течение 10 минут. Фоновую окраску срезов проводили гематоксилином. Гистологический анализ волосяных фолликулов, обработанных BrdU

После включения BrdU и IHC-окрашивания определяли общее число фолликулов в раневом ложе и данные обрабатывали по компаративному тесту Kruskall-Wallis. Дальнейший анализ включал определение для каждой группы животных количества ран (в процентах), в которых были фолликулы с десятью или более пролиферирующими клетками (Chi-square тест). Кроме того, для всех фолликулов, имеющих более пяти пролиферирующих клеток, определяли число клеток, положительных по окраске на BrdU. Окрашивание сальных желез масляным красным

Для идентификации себоцитов и сальных желез была применена окраска масляным красным, нейтральным красителем, специфичным для нейтральных липидов. Окрашивание проводили на замороженных срезах по методу, описанному F.L.Carson: Histotechnology: A Self- Instuctional Text; ASCP Press, Chicago (1990). Вкратце, замороженные срезы толщиной 7 мкм высушивали на воздухе и фиксировали в цинк-формалине в течение 10 минут. Затем препараты погружали в 0,3% (вес/объем) раствор масляного красного (Sigma Chemical Co., St. Louis.MO), затем в 60%-ный изопропанол на 30 минут при комнатной температуре, обесцвечивали в 60%-ном изопропаноле и окрашивали гематоксилином Лернера. Определяли размер сальных желез и число клеток в железе. При обработке ран ФРК в дозах 4-40 мкг/см.кв. наблюдалась ускоренная реэпителизация и увеличение толщины эпителия. На пятый день после обработки в ранах отмечена усиленная в сравнении с контролем реэпителизация (76,7% против 52,5%, 1 мкг ФРК). К пятому и седьмому дню после обработки плотность эпителия увеличивалась в зависимости от дозы ФРК и при дозе 10 мкг на рану площадь эпителия в два раза превышала таковую в контроле (фиг.3). Гистологический анализ дает основания считать, что регенерация эпителия происходит в основном за счет распространения в дерме экстраэмбриональных элементов, а именно сальных желез, потовых желез и волосяных фолликулов. Анализ пролиферации базальных кератиноцитов и миграции базальных клеток показал увеличение числа пролиферирующих базальных кератиноцитов по краям раны уже на первый день после обработки ФРК (фиг.4). Ко второму дню после обработки ФРК возросшее число пролиферирующих кератиноцитов в супрабазальном слое указывает на сокращение времени перехода пролиферирующих клеток в сторону сосочкового слоя. К пятому дню после обработки пролиферация клеток в базальном слое уменьшается, что указывает на самоограничивающееся ускорение восстановления эпителия и дифференцировки (фиг.4). Кератиноциты претерпевают нормальное созревание по мере их миграции вверх и образования рогового слоя. Неожиданно была обнаружена усиленная пролиферация себоцитов и волосяных фолликулов. В ранах, обработанных ФРК, по сравнению с контрольными и волосяные фолликулы, и сальные железы были многочисленней и крупнее (фиг.3 и 6 соответственно). Анализ гистологических препаратов, окрашенных масляным красным для дифференциального выявления сальных желез, показал значительно возросшее число таких желез и увеличение их размеров, что указывает на усиленную пролиферацию и дифференцировку себоцитов в зрелые салопродуцирующие клетки. В обработанных ФРК ранах отмечено также дозозависимое увеличение числа пролиферирующих клеток в волосяных фолликулах. Ранее на раневой модели уха кролика были проверены эпидермальный фактор роста (EGF) и основной фактор роста фибробластов (FGF) (J.Clin.Invest.,87:694-704,1991 и Pierce et al. Amer.J.Pathol. 140: 1375-1388, 1992). Хотя известно, что оба эти фактора стимулируют реэпителизацию, ни EGF, ни основной FGF не влияют на пролиферацию и дифференцировку таких экстраэмбриональных структур, как сальные железы и волосяные фолликулы. Способность ФРК стимулировать пролиферацию и последующую дифференцировку в коже эпителиальных клеток различных типов вместе с тем фактом, что он был первоначально выделен из фибробластов, дают основания считать ФРК мощным паракринным стимулятором регенеративных процессов в коже. Пример 2

ФРК-СТИМУЛИРОВАННЫЕ ПРОЛИФЕРАЦИЯ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ПНЕВМОЦИТОВ ТИПА II IN VIVO

Настоящие эксперименты были проведены с целью оценки воздействия ФРК на эпителиальные клетки респираторного тракта здоровых крыс. Материалы и методы

Самцам крыс Lewis весом 200-250 г однократно интратрахеально вводили различные дозы ФРК, разведенного в физиологическом растворе или фосфатном буферном растворе согласно протоколу, описанному Ulich et al., Amer.J.Pathol. , 138: 1485-1496, 1991. ФРК вводили в дозах 0,1, 1,0, 5,0 и 10,0 мг/кг веса. Контрольные крысы получали интратрахеальные инъекции растворителя. Через шесть часов, один, два, три, четыре, пять и шесть дней после введения ФРК животных забивали, через интратрахеальный катетер легкие заполняли фиксатором Буэна, саггитальные срезы легких заключали в парафин и гистологические препараты окрашивали гематоксилинэозином. ФРК в дозе 0,1 мг/кг не вызывает гистологически различимой гиперплазии эпителиальных клеток альвеол. ФРК в дозе 1,0 мг/кг вызывает незначительное, но различимое увеличение числа альвеолярных эпителиальных клеток. Значительная гиперплазия этих клеток отмечена при дозах ФРК, равных 5,0 и 10,0 мг/кг. ФРК не вызывал гистологически различимой гиперплазии эпителиальных клеток на сроках 6 и 24 часа после интратрахеального введения. На второй день после введения ФРК в легких крыс отмечены островковые микрососочковые разрастания эпителиальных клеток перегородок альвеол (фиг.7,8). На третий день в больших сегментах легких в выстилке целых альвеол отмечен низко-кубический и кубический рост альвеолярных эпителиальных клеток. При этом некоторые области легких сохраняют нормальную гистологическую картину. Гистологическая картина гиперпластического альвеолярного эпителия у крысы на третий день после введения ФРК практически совпадает с картиной реактивной гиперплазии пневмоцитов типа II в легких человека. На четвертый и пятый день после интратрахеального введения ФРК количество гиперпластического альвеолярного эпителия в легких крыс заметно снижается. На шестой день легкие контрольных и ФРК-обработанных крыс были неразличимы. Легкие ФРК-обработанных крыс подвергли ультраструктурному анализу на третий день после интратрахеального введения ФРК. Гиперпластические альвеолярные эпителиальные клетки, выстилающие перегородки альвеол, неизменно содержали одно или более пластинчатое включение различных форм и размеров (фиг.11, 12). На третий день после введения ФРК бронхиальный эпителий у крыс был также гиперпластичен, но эта гиперплазия была не столь явной, как в случае альвеолярных эпителиальных клеток. Проявлениями бронхиальной гиперплазии считают псевдорасслоение (псевдостратификацию) эпителиальной выстилки малых дистальных бронхов, которые в норме выстланы однослойным эпителием, пучковый или сосочковый рост бронхиального эпителия, а также увеличение числа митозов в бронхиальном эпителии (фиг.13A, 13B). Введенный интратрахеально ФРК вызывает резкую гиперплазию альвеолярных эпителиальных клеток. Наличие пластинчатых цитоплазматических включений в этих клетках подтверждает предположение о том, что эти клетки являются пневмоцитами типа II. Эти пластинчатые включения немногочисленны и не окрашиваются осмием, в отличие от подобных включений, описанных в некоторых случаях экспериментальной гиперплазии пневмоцитов типа II у крыс. Они гораздо больше напоминают пластинчатые включения, встречающиеся в клетках легких нормальных крыс. Кроме гиперплазии альвеолярного эпителия ФРК вызывает гиперплазию бронхиального эпителия. Возможно, что гиперпластический альвеолярный эпителий представляет собой прорастание бронхиального эпителия из терминальных бронхиол в альвеолярную паренхиму. Однако более вероятно, что ФРК действует прямо на пневмоциты типа II, о чем свидетельствует многофокусный микрососочковый характер роста пневмоцитов в перегородках альвеол на второй день после введения ФРК. Такой рост предшествует образованию непрерывной выстилки альвеол кубическими клетками на третий день после введения ФРК. Кроме того, пневмоциты типа II считают митотически активными клетками эпителия альвеол и именно эти клетки должны отвечать пролиферацией на такой эндогенный медиатор роста альвеолярных клеток, каким является ФРК. Наконец, идентификация пластинчатых включений в гиперпластических клетках дает основания считать что эти клетки не только дифференцируются в пневмоциты типа II, но и происходят из этих пневмоцитов. Стимулирующий эффект ФРК на пневмоциты типа II подтверждается еще и данными о том, что количество мРНК рецептора ФРК на эквивалентное количество общей РНК в легких в два-три раза выше по сравнению с другими органами молодых взрослых крыс. В этих опытах количество мРНК рецептора ФРК определяли модифицированным методом защиты от РНКазы Ambion (RPA II, N 1410). "Антисмысловая"-РНК, использованная в этих экспериментах, имела следующую последовательность (SEQ. ID N. :3):

5' GAAUACGAAUUCCUUGCUGUUUGGGCAGGACAGUGA-

GCCAGGCAGACUGGUUGGCCUGCCCUAUAUAAUUGG-

AGACCUUACAUAUAUAUUCCCCAGCAUCCAUCUCCG-

UCACAUUGAACAGAGCCAGCACUUCUGCAUUGGAGC-

UAUUUAUCCCCGAGUGGAUC 3'

"Антисмысловая" проба была приготовлена с помощью набора Riboprobe Gemini II фирмы Promega (#2020) на матрице линеаризованной ДНК, кодирующей соответствующую последовательность, описанную выше. Проба РНК была выделена из содержащего мочевину полиакриламидного геля путем вырезания полосы соответствующего размера и элюции РНК в растворе Ambion F. "Смысловая" РНК, кодирующая последовательность, комплементарную "антисмысловой" пробе, имеет следующую структуру (SEQ. ID N.:4):

5' GGGAGACAAGCUUGCAUGCCUGCAGGUCGACUCUAG-

AGGAUCCACUCGGGGAUAAAUAGCUCCAAUGCAGAA-

GUGCUGGCUCUGUUCAAUGUGACGGAGAUGGAUGCU-

GGGGAAUAUAUAUGUAAGGUCUCCAAUUAUAUAGGG-

CAGGCCAACCAGUCUGCCUGGCUCACUGUCCUGCCCA-

AACAGCAAGG 3'

"Смысловой" стандарт РНК приготавливали немеченым (без радиоактивной метки) с использованием набора Riboprobe Gemini II, Promega (#2020) и очищали на колонке G50 Sephadex Quick spin. Согласно стандартному протоколу Ambion (RPA II #1410), 50 мкг тотальной РНК инкубировали с 100 000 cpm пробы сначала при 95oC четыре минуты, затем от двенадцати до восемнадцати часов при 45oC. РНКаза (в разведении 1:500 в растворе Ambion R) была добавлена к гибридизационной смеси на сорок минут при 37oC, а затем был добавлен инактивирующий и осаждающий агент (раствор Dx). Фрагменты РНК, защищенные от РНКазы, разделяли по размеру электрофорезом в полиакриламидном геле с мочевиной, а затем весь гель экспонировали с пленкой Phosphorimager. Количественную оценку содержания РНК в полосах проводили при помощи прибора Phosphorimager фирмы Molecular Dynamics. Результаты представлен на фиг.14. Идентификация ФРК как ростового фактора пневмоцитов типа II открывает возможности терапевтического применения ФРК, который подобно кортикостероидам может быть использован для стимулирования созревания легких эмбриона. Другое возможное клиническое применение ФРК состоит в стимулировании бронхоальвеолярной регенерации после повреждения легких у взрослых. Пролиферативное действие ФРК на пневмоциты типа II дает основания предполагать его важную роль в регуляции синтеза и секреции слизи. Пример 3

ФРК-СТИМУЛИРОВАННЫЕ ПРОЛИФЕРАЦИЯ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ГЕПАТОЦИТОВ

Оценивали эффекты систематического введения ФРК на эпителиальные ткани печени взрослых крыс. Материалы и методы

Самцы крыс получали воду и пищу ad libitum. Всем животным ежедневно интраперитонеально вводили ФРК или фосфатный буферный раствор в течение одного, четырех или семи дней. Во всех экспериментах из каждой группы анализировали по крайней мере пять животных. Всех животных умерщвляли с помощью CO2, сразу же после гибели забирали кровь путем сердечной пункции для получения сыворотки, которую хранили замороженной до использования. Сыворотку анализировали обычным методом на содержание химических веществ и электролитов. Печень взвешивали слепым способом и вес выражали в граммах по отношению к 100 граммам веса тела (процент к весу тела). Образцы тканей помещали в 10%-ный забуференный формалин для последующего гистологического исследования. Срезы печени окрашивали гематоксилином и эозином (Г и Э). За час до умерщвления крысам интраперитонеально вводили 50 мг/кг BrdU. Для визуального выявления BrdU, включившегося в ДНК реплицирующихся клеток, использовали иммуногистохимический метод, основанный на использовании антител к BrdU. Индекс мечения (ИМ) печени определяли с помощью калиброванной окулярной сетки. Для каждого животного подсчитывали и усредняли десять полей зрения. Определяли общее число ядер и число меченых ядер на единицу площади. Для стандартизации подсчета все поля зрения на препаратах выбирали таким образом, чтобы они прилегали к портальной триаде. Все данные анализировали по распределению Стьюдента или тесту ANOVA для множественных групп сравнения. Для определения эффективной дозы ФРК использовали методику дозозависимого ответа. ФРК инъецировали ежедневно в течение четырех дней и забирали органы. Вес печени, выраженный в процентах к весу тела, значительно отличался от контрольного только при самой высокой ежедневной дозе ФРК (5 мг/кг) при сравнении методом ANOVA (фиг.15). Примечательно, что содержание сывороточных белков, холестерина и триглицеридов, синтезируемых печенью, было значительно выше по сравнению с контрольным при дозах ФРК 1,0 и 5,0 мг/кг (фиг.16). Исследовали животных, которым ежедневно в течение одного, четырех или семи дней вводили ФРК в дозе 5 мг/кг. Как показали исследования органов, печень была значительно увеличена в размерах по состоянию на седьмой день эксперимента. Вес печени у получавших ФРК крыс был существенно увеличен во всех исследуемых временных точках (седьмой день, ФРК: 4,08 0,08%; контроль: 3,49 0,06%, p=0,0003). Подсчет BrdU-положительных ядер показал трех- четырехкратное превышение их числа у ФРК-обработанных крыс по сравнению с контрольными через день после введения ФРК (фиг.17). Митотический индекс, выраженный как число митозов в поле зрения при большом увеличении микроскопа, был существенно выше по сравнению с контролем на первый день после введения ФРК, что согласуется с подсчетом BrdU-положительных ядер. Приведенные результаты указывают на сильное митогенное и дифференцировочное воздействие ФРК на печень. Быстрое увеличение веса печени на первый день после введения ФРК в сочетании с увеличенным митотическим индексом и доли BrdU-положительных клеток указывают на быстрое и мощное воздействие ФРК на эту преимущественно эпителиальную ткань. Хотя митотическое воздействие ФРК быстро спадает, вес печени, выраженный в процентах к весу тела, продолжает возрастать в ходе экспериментов. Возрастание веса первоначально обусловлено увеличением числа клеток, гистологически различимым уже через день после введения ФРК. Это же увеличение веса сохраняется на четвертый и седьмой дни эксперимента. Поскольку при регенерации масса печени может увеличиваться более чем в два раза менее чем за две недели, не удивительно, что столь существенные различия обнаруживаются уже через день после введения ФРК. Повышенный уровень альбумина не связан с каким-либо болезненным состоянием за исключением дегидратации. По-видимому, ФРК индуцирует повышение уровня альбумина (и других белков) в сыворотке за счет увеличения числа функционирующих гепатоцитов. Индуцируемое ФРК усиление синтеза белков может иметь исключительное значение для пациентов с терминальными стадиями заболеваний печени, в частности циррозом. Пример 4

ФРК-СТИМУЛИРОВАННЫЕ ПРОЛИФЕРАЦИЯ И ВОССТАНОВЛЕНИЕ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ IN VIVO ПОСЛЕ ЧАСТИЧНОЙ ГЕПАТЭКТОМИИ

В настоящих экспериментах в качестве подопытных животных были использованы самцы крыс Spraque-Dawley весом 300-340 г. Материалы и методы

Каждой из крыс удаляли до двух третей печени по методике Higgins и Anderson, Archives of Pathology, Volume 12, page 186 (1931). Начиная с восьми часов после операции и затем ежедневно крысам подкожно вводили фосфатный буферный раствор (контроль) или ФРК в дозе 1 мг/кг. Контрольных и ФРК-обработанных крыс взвешивали и забивали на четвертый, седьмой, десятый и четырнадцатый день после операции. Удаляли и взвешивали остатки печени. Установлено, что обработка ФРК крыс, перенесших частичную гепатэктомию, приводит к значительному ускорению восстановления массы печени как в абсолютных, так и в относительных величинах, как показано соответственно на фиг.18 и 19. У обработанных ФРК крыс масса печени возвращалась к исходному значению в течение семи дней. Напротив, в контрольной группе ни абсолютная, ни относительная масса печени не восстанавливались полностью даже к четырнадцатому дню после гепатэктомии. Пример 5

ПОЛОЖИТЕЛЬНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ ФРК ПРИ ХИМИЧЕСКОМ ОТРАВЛЕНИИ ПЕЧЕНИ

Самцы крыс Spraque-Dawley весом 300-340 г были использованы для оценки терапевтического воздействия ФРК на печень при введении химического токсина. Группам из двенадцати самцов крыс Spraque-Dawley перорально вводили четырех-хлористый углерод (CCl4) в растительном масле в дозах 1 мг/кг и 2 мг/кг. Каждая группа была разделена на две подгруппы по шесть крыс в каждой. Через три часа после введения CCl4 и затем ежедневно крысам соответствующей подгруппы вводили фосфатный буферный раствор или ФРК в дозе 1 мг/кг/день. Через 24, 72 и 144 часа после введения CCl4 у каждой крысы брали пробу крови и определяли уровень сывороточной глутамат-оксалоацетат трансаминазы (СГОТ). Как видно из фиг.20, подкожное введение ФРК после перорального введения CCl4 значительно увеличивает в сыворотке содержание фермента СГОТ, являющегося индикатором повреждения печени. Эффект особенно выражен при дозе 2 мг/кг на первый день после введения ФРК. Пример 6

ФРК-СТИМУЛИРОВАННЫЕ ПРОЛИФЕРАЦИЯ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ КИШЕЧНИКА

В данном примере оценивается биологическое воздействие ФРК на эпителиальные клетки слизистой оболочки кишечника здоровых крыс. Материалы и методы

Самцы крыс получали воду и пищу ad libitum. Животным вводили ФРК или фосфатный буферный раствор (контроль) интраперитонеально в течение одного, четырех или семи дней. Анализировали не менее пяти животных в каждой группе. Всех крыс умерщвляли при помощи CO2. Главные органы взвешивали слепым методом и их вес выражали в граммах на 100 граммов веса тела (процент к весу тела). Пищеварительный тракт разделяли на нежелезистый желудок, железистый желудок, тонкий кишечник и толстый кишечник. Образцы тканей помещали в 10%-ный забуференный формалин для последующего стандартного гистологического исследования. Срезы всех отобранных органов окрашивали гематоксилином и эозином (Г и Э). За час до забоя крысам интраперитонеально вводили 50 мг/кг BrdU. Для визуализации включения BrdU в ДНК реплицирующихся клеток был использован иммуногистохимический метод с антителами к BrdU. Отдельные ткани были окрашены перийодат-Шиффом (PAS), альциановым голубым при pH 2,5 и Мессон-трихромом. Для измерения толщины слизистой желудка и глубины ее прокрашивания PAS использовали калиброванный окуляр. Аналогично определяли длину ворсинок и глубину кишечных крипт в двенадцатиперстной кишке и глубину крипт ободочной кишки. Чтобы оценить количественные изменения в образовании бокаловидных клеток подсчитывали PAS-положительные бокаловидные клетки на 100 мкм длины дуоденальной ворсинки, начиная с основания. Для всех отделов пищеварительного тракта измерения проводили только на тех железах или ворсинках, которые были перпендикулярны подстилающим мышцам. Результаты выражали в микронах или, в случае бокаловидных клеток тонкого кишечника, средним числом на единицу площади. Кроме того, для ободочной кишки определяли число обычных и гиперпластических (бифурцированных и трифурцированных) крипт на единицу длины кишки. Для каждого животного проводили от пяти до десяти повторных измерений и результаты усредняли. Все данные обрабатывали по распределению Стьюдента или тесту ANOVA для множественных групп сравнения (Statview II, Abacus Concepts, Berkeley, CA). Для определения эффективной дозы ФРК первоначально были поставлены эксперименты по типу "доза-ответ". ФРК вводили ежедневно в течение четырех дней, и органы опытных животных забирали для обследования. Выраженный ответ на введение ФРК наблюдался в отношении железистого желудка, тонкого кишечника и ободочной кишки (фиг.15). Животных обследовали после одного, четырех и семи дней ежедневных введений ФРК в дозе 5 мг/кг. Согласно данным патологоанатомического обследования, на четвертый и седьмой дни введения ФРК нежелезистый желудок был значительно утолщен с образованием складок слизистой оболочки. На четвертый и седьмой дни обработки ФРК, но не на первый день, нежелезистый желудок, железистый желудок, двенадцатиперстная кишка и ободочная кишка имели значительное увеличение по весу по сравнению с контролем. На седьмой день железистый желудок весил 0.650,01 г у животных, обработанных ФРК, и 0,480,02 г у контрольных (p=0,0001). На четвертый и седьмой дни обработки ФРК нежелезистый желудок значительно превышал по весу контрольный. Гистологически у ФРК-обработанных животных чешуйчатый эпителий нежелезистого желудка был слегка (на четвертый день) или значительно (на седьмой день) гиперпластирован. В кардии характер эпителия резко менялся от чешуйчатого эпителия пищевода до пролиферирующего эпителия обработанного ФРК нежелезистого желудка. После одного дня обработки ФРК слизистая оболочка железистого желудка выглядела гистологически нормальной. На четвертый и седьмой дни гистологически выявлялось возросшее число бокаловидных клеток, различимых по обширной прозрачной цитоплазме. У животных, получавших ФРК в течение четырех и семи дней, отмечено умеренное увеличение толщины слизистой оболочки (фиг.21). На седьмой день слой слизистых клеток оказывается расширенным и смещенным к поверхности серозной оболочки. Окраска PAS на четвертый и седьмой дни выявляет значительное возрастание числа PAS-положительных (муцинпродуцирующих) бокаловидных клеток. Окрашивание срезов BrdU также подтверждает, что указанные клетки образуют пролиферирующий клеточный слой в железистом желудке. Кроме того, число делящихся клеток возрастает при обработке ФРК. Толщина PAS-положительного слоя на люминальной поверхности слизистой оболочки желудка на четвертый и седьмой дни обработки ФРК также значительно увеличивается (фиг.21). Во все временные точки тонкий кишечник оставался в основном нормальным. Окраска PAS выявляла возросшее число бокаловидных клеток, продуцирующих слизь. Эти было особенно заметно на четвертый и седьмой дни (фиг.22). Длина ворсинок оставалась одинаковой, а глубина крипт была значительно больше на первый и седьмой дни (фиг.22). К седьмому дню обработки слизистая оболочка ободочной кишки образовывала морщинистые складки, которые значительно увеличивали общую площадь поверхности. Признаки гиперплазии (бифурцированные и трифурцированные крипты ободочной кишки) имели место во всех группах животных, включая контрольных, но они были более выраженными и многочисленными в тех группах, которые получали ФРК в течение коротких временных интервалов (один и четыре дня), причем число гиперпластических крипт уменьшалось с увеличением сроков обработки (фиг. 23). Соответственно глубина крипт ободочной кишки возрастала с увеличением сроков обработки (фиг.24). Окраска препаратов PAS и альциановым голубым показала возрастание числа продуцирующих слизь бокаловидных клеток в ободочной кишке после обработки ФРК. Кроме того, у всех обработанных ФРК животных к седьмому дню отмечали возрастание числа окрашиваемых альциановым голубым бокаловидных клеток на люминальной поверхности кишки. Обработка животных ФРК уже к четвертому дню приводила к заметному увеличению числа PAS-положительных клеток в верхних трех четвертях крипт ободочной кишки. Приведенные результаты показывают, что ФРК обладает сильным митогенным и дифференцировочным действием на эпителиальные ткани желудочно-кишечного тракта. Из опытов по включению BrdU очевидно, что ФРК инициирует пролиферацию слизистых клеток в слизистой оболочке желудка. В железистом желудке эти клетки являются клетками-предшественниками. По мере деления они мигрируют наверх, по направлению к просвету желудка, и образуют поверхностные клетки или же перемещаются вниз и образуют клетки, формирующие железы желудка (Toner et al. , 1989, in Gastrointestinal and Esophageal Pathology, Churchill Livingstone, New York, NY, at pages 13-28). Кроме того, ФРК ускоряет селективную дифференцировку слизистых клеток желудка в клетки, которые мигрируют наверх и становятся бокаловидными клетками. На четвертый и седьмой дни обработки общая толщина слизистой оболочки желудка значительно увеличивается. Аналогичные эффекты отмечаются также для тонкого и толстого кишечника. Стимулируя клетки-предшественники, ФРК ускоряет клеточное деление и приводит к удлинению крипт. Кроме того, ФРК индуцирует дифференцировку делящихся клеток крипт, что приводит к увеличению образования слизи и возрастанию числа бокаловидных клеток в ворсинках и криптах. При том, что указаны отдельные применения данного изобретения и оно раскрыто в конкретных примерах, следует понимать, что приведенное описание не является исчерпывающим. Так, например, любая из форм ФРК, обладающая усиленными биологическими свойствами природного ФРК, может быть использована для решения перечисленных в данной заявке задач. Эти формы могут включать очищенный природный ФРК, синтезированный химическим путем ФРК, рекомбинантный ФРК, полученный в системах экспрессии, отличных от описанной в данной заявке, а также аналоги, варианты, химеры и т.п., основанные на природной аминокислотной последовательности. Все эти формы должны применяться на практике с учетом настоящего изобретения. Опытному исследователю очевидно, что различные системы "вектор-хозяин" могут быть использованы для экспрессии белоккодирующей последовательности ФРК. Эти системы могут не ограничиваться клетками млекопитающих, инфицированными вирусами (например, вирусом осповакцины, аденовирусами и т.д.); клетками насекомых, инфицированными вирусами, в частности бакуловирусами; дрожжами, содержащими дрожжевые векторы, а также бактериями, отличными от E. coli, трансформированными фаговыми, плазмидными или космидными ДНК. Элементы, контролирующие экспрессию, в этих векторах могут отличаться по силе и специфичности. В зависимости от использованной системы "хозяин-вектор" могут быть применены те или иные транскрипционные и трансляционные элементы. Будучи выделен, очищен и проверен на активность с использованием описанных в данной заявке или других методов, белковый продукт экспрессии кДНК ФРК может быть включен в состав различных фармакологических композиций. Как правило, такие композиции включают удобный, обычно химически определенный носитель или растворитель для терапевтического агента (ФРК) и, в зависимости от способа применения, другие компоненты. Композиции могут включать водный растворитель или же могут быть твердофазными, в которых ФРК включен в состав неводных носителей, таких как коллагены, гиалуроновая кислота и различные полимеры. Состав такой композиции может быть подобран в соответствии с методом введения, включая инъекции, пероральное введение, наружное и назальное введение, а также введение в легкие. Как понятно опытному специалисту, дозировка ФРК будет меняться в зависимости от заболевания и метода введения, но эффективными могут оказаться дозы в интервале от 0,01 мг до 500 мг на килограмм веса тела. В зависимости от заболевания и состояния пациента ФРК может применяться однократно или многократно. ФРК может быть использован в сочетании с другими препаратами, например цитокинами и ростовыми факторами, и с другими фармакологическими препаратами, применяемыми для лечения заболеваний кожи, легких, печени и пищеварительного тракта. СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

(1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ:

(i) ЗАЯВИТЕЛЬ: Amgen Inc. (ii) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Терапевтические применения фактора роста кератиноцитов

(iii) ЧИСЛО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 4

(iv) АДРЕС ДЛЯ ПЕРЕПИСКИ:

(A) АДРЕСАТ: Amgen Inc. (B) УЛИЦА: Amgen Center, 1840 Dehavilland Drive

(C) ГОРОД: Thousand Oaks

(D) ШТАТ: California

(E) СТРАНА: USA

(F) ПОЧТОВЫЙ КОД: 91320-1789

(v) ФОРМА ДЛЯ РАБОТЫ С КОМПЬЮТЕРОМ:

(A) НОСИТЕЛЬ ИНФОРМАЦИИ: Дискета, 3,5 дюйма, DS, 2,0 Mb

(B) КОМПЬЮТЕР: IBM-совместимый

(C) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: MS-DOS

(D) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: Microsoft Word Version 5.1 a

(vi) ТЕКУЩИЕ ДАННЫЕ ПО ЗАЯВКЕ:

(A) НОМЕР ЗАЯВКИ:

(B) ДАТА ПОДАЧИ: 26-03-1993

(C) КЛАССИФИКАЦИЯ:

(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 1:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 55 пар оснований

(B) ТИП: нуклеиновая кислота

(C) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна

(D) ТОПОЛОГИЯ: линейная

(xi) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 1:

CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GGTAC

(3) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID N0:2:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 49 пар оснований

(B) ТИП: нуклеиновая кислота

(C) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна

(D) ТОПОЛОГИЯ: линейная

(xi) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 2:

CGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGTTATT CCTCCTTCTA GAATCAAAT

(4) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 3:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 164 пары оснований

(B) ТИП: нуклеиновая кислота

(C) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна

(D) ТОПОЛОГИЯ: линейная

(xi) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 3:

GAAUACGAAU UCCUUGCUGU UUGGGCAGGA CAGUGAGCCA

GGCAGACUGG

UUGGCCUGCC CUAUAUAAUU GGAGACCUUA CAUAUAUAUU

CCCCAGCAUC

CAUCUCCGUC ACAUUGAACA GAGCCAGCAC UUCUGCAUUG

GAGCUAUUUA

UCCCCGAGUG GAUC

(5) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID N0:4:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 191 пара оснований

(B) ТИП: нуклеиновая кислота

(C) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна

(D) ТОПОЛОГИЯ: линейная

(xi) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID N: 4:

GGGAGACAAG CUUGCAUGCC UGCAGGUCGA CUCUAGAGGA

UCCACUCGGG

GAUAAAUAGC UCCAAUGCAG AAGUGCUGGC UCUGUUCAAU

GUGACGGAGA

UGGAUGCUGG GGAAUAUAUA UGUAAGGUCU CCAAUUAUAU

AGGGCAGGCC

AACCAGUCUG CCUGGCUCAC UGUCCUGCCC AAACAGCAAG Gю


Формула изобретения

1. Способ стимулирования образования некератиноцитных эпителиальных клеток, заключающийся в контактировании указанных клеток с эффективным количеством фактора роста кератиноцитов (ФРК). 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что некератиноцитные эпителиальные клетки выбирают из группы, содержащей себоциты, клетки волосяных фолликулов, гепатоциты, пневмациты типа II, муцинпродуцирующие бокаловидные клетки и другие эпителиальные клетки и их предшественники, обнаруживаемые в коже, легких, печени и желудочно-кишечном тракте. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что осуществляют in vivo. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что ФРК представляет собой рекомбинатный ФРК. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что рекомбинатный ФРК продуцируется бактериальными клетками. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что бактериальные клетки представляют собой E. coli. 7. Способ лечения заболеваний и болезненных состояний, таких, как кожные повреждения, буллезный эпидермолиз, облысение, вызванное химиотерапией, облысение по мужскому типу, язва желудка, язва двенадцатиперстной кишки, эрозия желудка и пищевода, воспалительные заболевания кишечника, интоксикация кишечника, вызванная облучением или химиотерапией, эрозивный гастрит, эзофагит или эзофагитный рефлюкс, геалиново-мембранная болезнь, некроз эпителия дыхательных путей, вызванных вдыханием дыма, эмфизема, воспаление и фиброз легких, цирроз печени, быстро развивающаяся печеночная недостаточность, острый вирусный гепатит, заключающийся в том, что больному вводят терапевтически эффективное количество ФРК. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что кожное повреждение является ожогом.

 
Copyright© 2006-2010 Cell Cosmetics Laboratories Ltd. Все материалы оригинальные. Перепечатка возможна со ссылкой на http://www.placenta-lab.ru