СПИСОК ПАТЕНТОВ С УПОМИНАНИЕМ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ
-
- 2017751 Способ получения гиалурона
- 2192150 БАД для профилактики йодной недостаточности
- 2112542 Препарат для лечения патологий соединительных тканей
- 2225206 Препарат для лечения рака молочной железы
- 2299733 Лечение опорно-двигательного аппарата
- 2299732 Способ лечения глаукомы
- 2299726 Противоинфекционная губная помада
- 2299725 Косметическое средство для ухода за кожей
- 2198878 Ароматическое соединение
- 2198702 Способ подготовки трофических язв к аутодермапластике
- 2198653 Вагинальные суппозитории
- 2197946 Композиция для ухода за волосами
- 2197923 Фармацевтическая композиция для лечения отеков роговицы
- 2298410 Биотрансплантант и способ лечения ревматических и аутоиммунных заболеваний
- 2197501 Фотоотверженный гель на основе сшитой гиалуроновой кислоты
- 2197228 Твердые лекарственные формы
- 2197222 Водная компазиция для ухода за волосами, лица и тела
- 2297425 Полипептиды
- 2297240 Композиция с гиалуроновой кислотой
- 2297230 Фармацевтическая компазиция с ксантоновой смолой
- 2196588 Глазные капли
- 2195955 Применение биологически активных веществ
- 2195926 Дерматологические композиции
- 2295954 Микрочастицы для доставки нуклеиновых кислот
- 2295951 Косметика для ухода за кожей лица и век
- 2195262 Фармакологическое средство на основе гиалуроновой кислоты
- 2194512 Способ профилактики и коррекции процесса старения кожи
- 2194478 Лечение экземы
- 2294716 Расширяемый стент
- 2194055 Сшитые сополимеры
- 2099350 Ассоциаты депротонированной гиалуроновой кислоты
- 2293557 Средство для лечения кожи и слизистых
- 2292878 Приготовление микроцастиц, содержащих метопропол
- 2292746 БАД
- 2192256 Защита кишечника
- 2191782 Получение модифицированной гиалуроновой кислоты
- 2292219 Паратиреоидный гормон человека
- 2291686 Микроцастицы
- 2191000 Косметическая маска
- 2290921 Фармацевтические и косметические средства против старения кожи
- 2290900 Модифицированный биоматериал для использования в офтальмологии
- 2290899 Получение биоматерьяла
- 2290397 Новые инданилиденовые соединения
- 2290186 Лечение сирингомиелии
- 2288702 Иррингационный раствор для офтальмологии
- 2288699 Гель для лечения стоматологических заболеваний
- 2188011 Активирующая остеогенез фармацевтическая композиция
- 2187327 Средство с антисептиком
- 2187325 Средство с радиопротекторным действием
- 2287330 Композиции миноксидила
- 2186786 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2186593 Лечение раненого процесса кожи
- 2286801 Очищение воды
- 2286781 Лечение ожогов пищевода у детей
- 2286764 Средство лечения воспалений полости рта
- 2185840 Лечение инфекционных заболеваний
- 2286151 Альфа-2-Дельта-Лиганда
- 2185149 Ранозаживляющий гель
- 2285527 Лечение ИЛ-6 заболеваний
- 2184448 Раствор хранения роговицы, включающий гиалуроновую кислоту
- 2090179 Крем для кожи
- 2183961 Способ лечения кожи
- 2284331 Соли алифотических аминов
- 2284187 Производные амида
- 2089191 Снизить внутрение давление
- 2283320 Получение гликозаминогликанов
- 2283129 Лечение опухолей
- 2283098 Косметические средства с Q
- 2182574 Ароматические соединения
- 2088257 Средство с гипохолестеролемическим действием
- 2088218 Состав для гигиенических салфеток
- 2088206 Способ получения препарата, создающего исскуственный загар
- 2282462 Противомикробные средства
- 2182008 Интровагинальная компазиция
- 2181999 Препарат с отсроченным высвобождением
- 2181998 Новые композиции липидов
- 2181995 Лечение болевого синдрома
- 2181295 Вирионная вакцина
- 2087144 Витамин Е
- 2379336 Способ стирки
- 2379052 Вакцинация
- 2180855Композиция в виде ионного комплекса
- 2379025 Противоинфекционный гель
- 2180825 Лечение травм роговицы
- 2281082 Способ коррекции эстетических и возрастных проблем кожи
- 2180576 Биоактивная добавка для косметических средств
- 2280459 Средство для изменения скорости роста или репродукции клеток
- 2179981 Соли переходного металла
- 2378010 Жидкие вакцины
- 2378008 Комбинированные вакцины
- 2378007 Анаболическое средство
- 2377973 Растительные экстракты
- 2280041 Способ получения водорастворимых комплексов гиалурил
- 2280038 Биополимеры
- 2323733 Йодный обмен
- 2377260 Гель
- 2178693 Противовирусное средство на основе гиалуроновой кислоты
- 2178692 Облегчающие зуд косметическое средство
- 2377022 Гемостатические спреи
- 2376982 Увлажняющая сыворотка для лица
- 2376974 Трансдермальный гель для лица
- 2362784 Гипо-и гиперацетилированные менингокковые капсульные сахариды
- 2177789 Устройство для доставки лекарства к шейке матки
- 2277954 Крем для лица омолаживающий
- 2376378 Способ получения метионина
- 2177332 Биоматериал для предотвращения послеоперационных спаек, с производной гиалуроновой кислотой
- 2177310 Способ получения таблеток
- 2376011 Средство для позвоночника
- 2277410 Косметическое средство
- 2323748 Медицинская повязка
- 2276998 Гидрогелевые композиции
- 2082416 Способ получения препарата с коллагенном из животного сырья
- 2375081 Адсорбирующее изделие
- 2375049 Охлаждающий пластырь
- 2346049 Способ получения гиалурона
- 2275913 Фармацевтические средства
- 2174985 Полисахарид с антиоксидантом
- 2373957 Носитель для лекарственных средств и биологически активных веществ
- 2373941 Способ коррекции возрастных и патологических изменений кожных покров
- 2174845 Композиции и способы доставки генетического материала
- 2174830 Средство для укрепления волос
- 2373769 Синбиотическая композиция
- 2274472 Лечение апорно-двигательного аппарата и болевых синдромов
- 2372929 Профилактическая композиция на основе веществ фенольной природы в липосомной форме
- 2173563 Способ нанесения на поверхность предметов покрытия на основе гиалуроновой кислоты, её производных и полусинтетических полимеров
- 2079304 фармацевтическая композиция, обладающая иммуносупрессорной и антимикробной активностью
- 2273645 Полипептид ожирения
- 2173154 Фракция кератансульфатолигосахаридов и содержащий ее фармацевтический препарат
- 2173136 Грязная мазь
- 2173128 Способ хирургического лечения центральных разрывов сечатки
- 2078561 Косметическое средство предотвращающее старение кожи
- 2172490 Способ прогнозирования воспалительных заболеваний молочной железы при эндопластике
- 2272645 Способ лечения ЦМВ-Инфекции у детей раннего возроста
- 2272636 Фармацевтическая композиция для местного лечения воспаления
- 2272635 Фармацевтически активная субстанция для офтальмологии
- 2272599 Биоматерьял для стабилизации прогрессирующей миопии "Коллаплант"
- 2172168 Средство для заживления ран на основе гиалуроновой кислоты
- 2371172 Фармацевтическая композиция для лечения нервной системы на основе стефаглабрина
- 2171470 Способ прогнозирования послеоперационной трансформации доброкачественных опухолей нервной системы
- 2077317 Состав для ванн
- 2271213 Комбинированные композиции, содержащие экстракты из растений и морских животных
- 2076872 Способ получения окрашенной гиалуроновой кислоты
- 2076671 Раствор для защиты роговицы
- 2370281 Конъюгаты гидроксиалкилкрахмал
- 2370275 Способ лечения (коррекции) косметических и возрастных дефектов кожи
- 2370258 Фармацевтическая композиция для парентальной доставки в форме лиофилизата
- 2270023 Способ экстракции и очистки протеогликана хрящего типа (варианты)
- 2369408 Гемостатическая композиция, включающая гиалуроновую кислоту
- 2369387 Фармацевтическая композиция для лечения нервной системы
- 2369379 Нетаблитированные жевательные формы для индивидуального введения
- 2169136 Производное коричной кислоты
- 70792 Медицинский аппликатор
- 20741717 Способ стабилизации аскорбиновой кислоты
- 2074712 Способ получения препарата, препятствующего преждевременной эякуляции
- 2367954 Способ прогнозирования развития кожной патологии у женщин с синдромом склерополикистозных яичников (СПКЯ)
- 2268075 Устройство для электрокинетической доставки
- 2268052 Средство для лечения воспалительных и дегенеративных заболеваний суставов
- 2167649 Способ получения твердой дисперсии умеренного водорастворимого лекарственного вещества
- 2167647 Гель для бритья
- 2073520 Лечение урологических инфекций
- 2367476 Биопластический материал
- 2367475 Мембрана для использования при направленной регенерации тканей
- 2367469 Фармацевтическая композиция на основе лизоамидазы
- 2367456 Фармацевтическая композиция обладающая антибактериальным и некролитическим действием
- 2367455 Фармацевтическая композиция обладающая некролитическим и антибактериальным действием
- 2267324 Применение антиадгезивных углеводов, препарат для уменьшения и /или блокирования адгезии патогенных веществ
- 2166934 Композиции включающие биологический агент
- 2166510 Псевдодипептиды
- 2366460 Композиции, имеющие высокую противовирусную и антибактериальную активность
- 2360901 Производные феноксиуксусной кислоты
- 2165749 Способ восстановления эндотелия роговицы
- 2265441 Способ укрепления склеры
- 2365382 Композиции и способы для регуляции развития сосудов
- 2070879 Соли гликозаминогликанов
- 2164914 Циклические и гетероциклические N - замещенные - иминогидроксамовые карбоновые кислоты
- 2264627 Хламидийный конъюктивит
- 2364399 Фармацевтический препарат на основе стефаглабрина
- 2264230 Препарат с замедленным высвобождением активного вещества
- 2363497 Фармацевтические композиции
- 2363496 Способ увеличения объема мягких тканей
- 2363473 Способ антифлогистической активации в эксперементе
- 2363461 Фармацевтический препарат на основе сигетина
- 2363459 Средства для введения в роговицу глаз для предотвращения офтальмологических нарушений
- 2363448 Фармацевтические композиции
- 2163123 Глазные капли
- 2162687 Усовершенствованнная лекарственная форма индуктора интерферана
- 2162343 Биосовместимый полимерный материал и способ его получения
- 2162327 Лечение рака
- 2067841 Способ получения ароматизатора
- 2161478 Способ консервированого лечения гонартроза
- 2361617 Вольфрамовые частицы в качестве рентгеноконтрастных веществ
- 2361552 Способы и устройства для дренирования жидкостей и понижения внутриглазного давления
- 2066996 Способ изготовления пленочного материала для офтальмохирургии
- 2361417 Корм с глюкозамином и экстрактом ивы для профилактики артроза у животных
- 2161002 Пищевой общеукрепляющий лечебно-профилактический продукт из хрящевой ткани акул
- 2360928 Комплексная матрица для медико-биологического применения
- 2160574 Способ лечения глаукомы
- 2360688 Способ лечения повреждений переферических нервов
- 2360670 Фармацевтическая композиция при климактерических расстройствах
- 2360646 Эндолюминальный протез
- 2260445 Способ усовершенствования транспортировки через легко прспосабливаемый полупроницаемый барьер
- 2260007 Производные амида
- 2359975 Способ получения модифицированных арабиногалактанов
- 2359974 Антигенные Пептиды
- 2159775 Псевдопептидный продукт
- 2259833 Фармацевтическая композиция для лечения роговицы глаза
- 2259816 Ранозаживляющее средство
- 2259815 Способ коррекции возрастных изменений, связанных с процессами старения кожи
- 2359706 Способ сохранения офтальмологических растворов
- 2359704 Антисептическое средство
- 2359662 Микрокапсулы
- 2159253 Катионные полимеры
- 2159111 Средство для ухода за кожей лица
- 2159105 Композиция для защиты кожи от опасных химических веществ Получение
- 2158593 Биосовместимый водный раствор
- 2358728 Способ лечения и предупреждения потери костной ткани
- 2258517 Способ хирургического лечения травмотических повреждений селезенки пленкой на основе гиалуроновой кислоты
- 2357968 Кристалические формы производной имидазола
- 2357957 Ингибиторы P38 и их применение
- 2157647 Пищевая добавка и ее получение
- 2357758 Препараты для чрескожной и чересслизистой добавки
- 2063244 Способ стабилизации растворов
- 2063140 Способ получения препарата для консервирования мяса
- 2157381 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2257198 Композиции микроцастиц
- 2356909 Белковый комплекс
- 2356570 Косметическая композиция
- 2256434 Способ закрытия перфорации барабанной перепонки
- 2356520 Способ лечения постконтузионного повреждения сечатки глаза
- 2156133 Гель
- 2255945 Полимерная композиция
- 2355761 Средства повторной дифференцировки
- 2061043 Способ повышения устойчивости урокиназы к нагреванию
- 2061005 Способ получения красителей для гистологических исследований
- 2355420 Зубная паста
- 2355385 Композиции пролонгированного действия с контролируемым высвобождением
- 2355240 Способ получения пищевого препарата хондропротекторного действия
- 2155057 Пихтово репейный бальзам
- 2354409 Способ производства высвобождающих лекарственные средчтва медицинских устройств
- 2254145 Раневое покрытие на основе коллаген-хитозанового комплекса
- 2254133 Лечение и профилактика ВИЧ-инфекции у человека
- 2253439 Фармацевтическая композиция для защиты и улучшения оптических свойств роговици при проведении эндовитреальных вмешательств
- 2253437 Способ омоложения кожи
- 2153352 Фармацевтическая композиция обладающая ранозаживляющим и противовоспалительным действием
- 2353354 Фармацевтический препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2252787 Способ получения искусственной матрицы кожи
- 2252767 Способ нормализации иммунобиохимического гомеостаза коров в предродовом и послеродовом периодах
- 2352583 Фармацевтическая композиция содержащая Fc-область иммуноглобулина в качестве носителя
- 2152403 Модифицированные полисахариды
- 2352356 Иммуногенная композиция
- 2352342 Исскусственный физиологический солевый раствор Способ его получения
- 2352330 Фармацевтический препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2352323 Фармацевтический препарат с модифицированным высвобождением
- 2152027 Способ подготовки ткани мозга для определения гликозаминогликанов
- 2251842 Интектицидный состав для борьбы с личинками оводов
- 2151580 Способ активации пролиферации эндотелия роговицы
- 2351648 Дифференцировка стромальных клеток, полученных из жировой ткани, в эндокринные клетки поджелудочной железы и их использование
- 2351595 N - гидроксиформамидные соединения в качестве ингибиторов металлопротеина
- 2251411 Косметическое средство в лиофилизированной фармацевтической форме
- 2251405 Косметика...ее композиции для косметических препаратов
- 2251367 Средство со сшитой гиалуроновой кислотой для наращивания тканей
- 2351359 Косметика для профилактики и лечения избыточной массы тела
- 2351322 Препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2351153 Диета при остеортрите собак
- 2350958 Способ определения групповой принадлежности синовальной жидкости
- 2350625 Производные гиалуроновой кислоты с пониженной биодеградируемостью
- 2150266 Крем после бритья
- 2350354 Фармацевтическое средство содержащие антагонист и фактор некроза
- 2350340 Способ коррекции процессов регенерации
- 2350309 Способ лечения избыточной массы тела с помощью рефлексотерапии
- 2250047 Профилактический продукт из хрящевой ткани гидробионтов
- 2249467 Медицинский матерьял и изделия на его основе
- 2055079 Способ получения препарата гиалуроновой кислоты
- 2349599 Биоадгезив мидии
- 2054903 Способ лечения коллагеноза у бычков на откорме
- 2249210 Способ прогнозирования предрасположенности к развитию и тяжести течения деформирующего остеоартроза коленного сустава у взрослых
- 2349339 Средство для соединительной ткани
- 2148988 Человеческий интерферона
- 2148399 Лечение атеросклероза
- 2148396 Способ определения активного вещества в дифильных мазевых основах
- 2148375 Способ диагностики близорукости
- 2348415 Способ противоспаечной терапии после хирургического вмешательства
- 2348400 Препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2348386 Способ непроникающего хирургического лечения первичной открытоугольной глаукомы
- 2248213 Лечение Галактозидальной А недостаточности
- 2347586 Микрофлюидизированные эмульсии типа "масло в воде" и вакцинные средства
- 2147243 Контрастное средство
- 2146526 Лечебный препарат дисбактериоза и урогенитальных инфекций
- 2146148 Терапевтическое применение фактора роста кератиноцитов (ФРК)
- 2146139 Способ повышения активности макрофагов и комбинации для его осуществления
- 2346277 Способ диагностики специфического синовита
- 2345793 Ультразвуковые контрастные вещества и их получение
- 2345782 Терапевтические комбинации на основе PORIFERA для лечения и предотвращения кожных заболеваний
- 2245131 Способ коррекции косметических недостатков кожи
- 2245130 Способ активации восстановительных процессов в коже
- 2144833 Хондроитиназа
- 2344809 Получение твердых дозированных форм с использованием сшитого нетермопластичного носителя
- 2244540 Косметический гель для ухода за кожей лица
- 2244536 Способ лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний тазобедренного сустава
- 2344167 Хмелевый экстракт
- 2143884 Агент регулирования дифференциации клеток кожи, культурная среда для клеток или тканей и способ регулирования дифференциации клеток кожи
- 2343932 Способ получения обладающих пониженной растворимостью в воде пленночных материалов
- 2343903 Устройство доставки лекарств для контролируемого введения препаратов
- 2048817 Способ получения материала для лечения ожогов и гнойно - некронических ран
- 2048803 Гидратантный крем
- 2242974 Средства и способы лечения воспалительных заболнваний
- 2142816 Способ получения антигерпетической вакцины
- 2342923 Средство для обработки рук с увлажняющим эффектом
- 2142781 Косметика для макияжа ресниц и бровей и агент ингирирующий рост микроорганизмов в косметических средствах
- 2242251 Трансплантируемые стенты с биоактивными покрытиями
- 2142257 Способ обработки глазных имплантантов и контакных линз
- 2342389 Мононатриевая соль
- 2342107 Способ устранения западения верхнего века при анофтальме
- 2141828 Средство, пролонгирующее эффективность чесночного порошка
- 2241489 Косметическое средство матриксных протеинов для залечивания ран
- 2241443 Средство для лечения герпеса
- 2241414 Способ получения протезов кровеносных сосудов
- 2341539 Гидрогель
- 2141324 Регулятор скорости воздействия препарата для инъекций
- 2141312 Косметическое средство для ухода за кожей лица
- 2341296 Средства и способы покрытия медицинских имплантантов
- 2341272 Средство для неспецифической иммунотерапии
- 2341266 Стенты с нанесенным покрытием содержащим N - (5-(4-(4-
- 2341257 Иммуномодулирующее средство
- 2341255 Средство для лечения климактерических расстройств
- 2240821 Способ лечения урологических инфекций
- 2140786 Способ лечения лишая
- 2140243 Способ хирургического лечения диабетической ретинопатии и отслоек сечатной оболочки
- 2240140 Медицинская многослойная повязка и изделия на ее основе
- 2240135 Культура клеток, содержащая клетки - предшественники остеонегеза, имплантант на ее основе и его использование для восстановления целостности кости
- 2240123 Экзогенные биологически активные коньюгирующие вещества
- 2139886 Фотоотвержаемое производное гликозаминогликата, сшитое производное гликозаминогликата и способы их получения, способ предотвращения клеточной и тканевой адгезии
- 2139729 Вакцина. Способ стимулирования иммунной системы
- 2339386 Средство обладающее радио - и химиозащитным действием
- 2339369 Лечение офтальмологических нарушений с использованием мочевины и ее производных
- 2139041 Гидратантный регенерирующий крем и способ его получения
- 2139039 Косметический суперкрем для ухода за кожей
- 2139017 Способ получения боисовместимого материала
- 2138503 Производные камптотецина, способы их получения, уникальное средство
- 2338556 Средство содержащие антагонист Р2Х - рецептора и нестероидное противоспалительное лекарственное средство
- 2338514 Косметическое средство для профилактики старения кожи
- 2138297 Медицинские устройства, подверженные вызываемому разложению
- 2138295 Покрытие для ран
- 2337906 Ингибиторы цитозольной фосфолипазы А2 Применение физиологически допустимого корпускулярного ферримагнитного или ферромагнитного материала. Способ формирования магнитометрического изображения
- 2137501 Устройство формирования изображения
- 2137477 Способ лечения заболеваний характеризующихся аутоиммунной агрессией
- 2137467 Крем для кожи лица и тела
- 2137449 Способ коррекции дефектов преломления в глазу млекопитающего
- 2137402 Пищевая Добавка БАД
- 2336899 Способ стимуляции миелопоэза
- 2336862 Способ получения раствора для лечения роговицы
- 2336830 Способ восстановления костных структур челюсти
- 2136696 Новый полипептид и средство против ВИЧ - Инфекции
- 2336092 Биоадгезивное средство, по существу свободное от воды
- 2336089 Средство и способ лечения заболеваний периодонтальных и пульпы
- 2336074 Средства и способы лечения заднего сегмента глаза
- 2235548 Ранозаживляющее средство
- 2135186 Способ лечения рефлекторных синдромов при остеохондрозе
- 2234945 Стабилизатор водного раствора и водосодержащего сырья
- 2334762 Растворимая ассоциативная карбоксиметилцеллюлоза
- 2234514 Макропористые хитозановые гранулы и способ их получения. Способ культивирования клеток
- 2133615 Средство для лечения неврологических заболеваний
- 2233164 Способ профилактики развития послеоперационных спаек брюшной полости
- 2133127 Неткатный материал, способ его получения и способ лечения
- 2333223 Альдегидные производные сиаловой кислоты и средства на их основе
- 2333007 Полипептидные вакцины для широкой защиты против рядов поколений менингококов с повышенной вирулентностью
- 2332985 Дозированные формы анестезирующих средств с длительным высвобождением для обезболивания
- 2132677 Косметическая маска
- 38603 Пленочный аппликатор
- 2232594 Средство содержащие ингибирующие остеокластогенез фактор и полисахарид
- 2332238 Средство для прокладок, раневых повязок и других изделий, контактирующих с кожей
- 2331668 Стромальные клетки, получение из жировой ткани, для заживления дефектов роговицы и внутриглазных дефектов и их использование
- 2331438 Альфа - 2 - Дельта Лигант для лечения симптомов нижних мочевыводящих путей
- 2331411Электропряденые аморфные фармоцевтические средства
- 2331367 Способ профилактики образования спаек и их рецидива
- 2130767 Масло в воде для получения косметических и дерматологических средств, способ косметической обработки
- 2230752 Поперечносшитые гиалуроновые кислоты и их применение в медицине
- 2230558 Способ восстановления и сохранения здоровья скмьи
- 2230550 Средства длительного высвобождения, способ их получения и применения
- 2230458 Поддержания здоровья суставов
- 2330290 Способ определения состояния метаболических процессов в ткани суставного хряща
- 2230073 Способ поперечного сшивания карбоксилированных полисахаридов
- 2329059 Способ лечения полипозного риносинусита
- 2329037 Комбинированная терапия для лечения иммуновоспалительных заболеваний
- 2128666 Гиалуроновая кислота и ее соли, способ очистки гиалуроновой кислоты, способ получения гиалуроновой кислоты. Фармацевтический препарат с гиалуроновой кислотой и средства с гиалуроновой кислотой используемые в офтальмологии
- 2328740 Способ экспресс - оценки действия зубных паст
- 2128502 Косметический гель
- 2328272 Суппозитории индуктора интерферона
- 2328268 Косметика содержащая амфолитный сополимер
- 2128057 Композиционная мембрана, способ ее получения и способ направленной регенерации тканей с ее применением
- 2128055 Средство замедленного освобождения и способ его получения
- 2128049 Свечи
- 2227743 Полипептидные варианты с повышенной гепаринсвязывающей способностью
- 2326893 Ковалентное и нековалентное сшивание гидрофильных полимеров
- 2326697 Новый перевязочный материал для быстрого заживления раневой поверхности кожи
- 2126264 Фармацевтическое средство с гиалуроновой кислотой
- 2326137 Способ получения содержащих альгинат пористых формованных изделий
- 2325902 Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани
- 2225195 Репелленты против насекомых
- 2325193 Сосудистый стент
- 2325184 Улучшенные везикулы наружной мембраны бактерий
- 2325153 Многокомпонентная фармацевтическая дозированная форма
- 2325152 Удерживаемая в желудке система регулируемой доставки лекарственного средства
- 2029955 Способ предоперационного определения помутнения задней капсулы хрусталика при экстракции катаракты
- 2324688 Производные бисбензизоселеназолонила с противоопухолевым, противовоспалительным и антитромбоническим действием
- 2323017 Устройство и способ контролируемый доставки активных веществ в кожу
- 2323011 Содержащий Коллаген I и Коллаген II способный к рассасыванию внеклеточный матрикс, предназначенный для реконструирования хряща
- 2322955 Способ изготовления имплантанта для пластики дефектов хрящевой ткани
- 2322454 Антитело против CCR5
- 2322263 Система продолжительного высвобождения растворимого лекарственного средства
- 2221561 Витамин Е и его сложные эфиры
- 2321634 Гены участвующие в метаболизме углерода и продуцировании энергии
- 2321597 Биоматерьял, способ его приготовления и его применение, медицинское средство, имплантант и вкладыш
- 2121340 Средство для похудения
- 2220737 Средство для улучшения состояния опорно-двигательного аппарата
- 2220729 Гель используемый в стоматологии
- 2320720 Способ культивирования фибропластов для заместительной терапии
- 2320378 Накожный аппликатор
- 2320369 Средства, содержащие Альфа - 2 - Дельта Лиганды и ингибиторы обратного захвата серотонина/норадреналина
- 2320362 Местные фармацевтические средства, содержащие проантоцианидины, для лечения дерматитов
- 2320322 Биоадгезивная доставка лекарств
- 2320318 Чувствительное к температуре изменяющие состояние средство гидрогеля
- 2025120 Способ получения препарата, содержащего Фактор /G-CSF/, стимулирующий рост колоний гранулоцитов
- 2319490 Средство для введения железа при лечении синдрома беспокойных ног
- 25995 Содержащее адгезив приспособление для фиксации зубных протезов в полости рта
- 2218907 Средство для ухода за кожей лица и веками
- 2318830 Способ получения модифицированного дерматансульфата
- 2118153 Косметика - туш для ресниц
- 2217441 Способ получения полимера
- 2317296 Изетионатная соль селективного ингибитора CDK4
- 2217171 Мембрана для использования при направленной регенерации тканей
- 2317095 Экстракты ECHINACEA ANGUSTIFOLIA
- 2216332 Препарат для лечения астроза
- 2216314 Крем - маска для обезвоженной кожи
- 2316333 Средство оздоровительно-восстановительных косметических панто-магниевых ванн
- 2021304 Способ получения биологически активного средства
- 2115662 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2315627 Впрыскиваемые имплантанты на керамической основе для заполнения морщин, кожных впадин, шрамов
- 2315623 Средство получаемое путем лиофилизации препарата
- 2114862 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2314791 Лечебно-Косметическое средство
- 2314791 Косметический крем-бальзам для ухода за кожей лица и шеи
- 2214600 Способ оценки эффективности лечения неврологических проявлений
- 2114602 Способ косметической обработки
- 2114587 Раствор для защиты роговицы
- 2214283 Имплантант для подкожного или внутрикожного введения
- 2313370 Медицинские протезы, имеющие улучшенную биологическую совместимость
- 2313356 Препарат для лечения демодекоза
- 2313338 Средство на основе этиллинолеата и триэтилцитрата для лечения себореи и угрей
- 2313328 Косметика содержащая тонкодисперный и пористый порошок
- 2212880 Способ получения препарата содержащего антибиотик, с замедленным высвобождением активного вещества
- 2312640 Способ лечения Блефароконьюнктивальной формы синдрома сухого глаза
- 2017751 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2312145 Гены CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM, кодирующие белки, участвующие в синтезе мембран и мембранном транспорте
- 2311458 Белки вызывающие измененную иммуногенную реакцию. Способ их получения и использования
- 2311183 Улучшенное разделение с использованием гталуроновой кислоты
- 2311177 Ингибиторы интегрина для лечения заболевания глаз
- 2300069 Косметическая маска
- 2211024 Уход за сухой кожей
- 2310440 Раствор для защиты роговицы от повреждений
- 2309684 Лечение межфалангового остеоатроза узелковой формы
- 2309406 Способ мониторинга фиброза печени у больных хроническим гепатитом с (ХГС)
- 2209088 Опосредованная рецепторами доставка генов с использованием векторов на основе бактериофагов
- 2308967 Уменьшение объема ткани
- 2308962 Средство для опорно-дигательного аппарата
- 2308957 Способ получения препарата для мезотерапии
- 2308954 Средство для лечения ран, содержащее плазму или сыворотку крови
- 2308951 Комплексный способ профилактики вагинальных дисбактериозов
- 2308937 Косметическая биологически активная добавка и косметический литофитокомплекс на ее основе
- 2208638 ДНК (варианты), способ получения белка
- 2207885 Способ подачи небольшого объема лечебного раствора к целевому месту
- 2207858 Лишенные побочных эффектов производные простагландинов для лечения глаукомы
- 2207845 Твердая лекарственная форма пролонгированного действия
- 2207844 Препарат для местного неинвазивного применения
- 2207841 Средства с антиферментативным действием
- 2306335 Стволовые клетки и решетки полученные из жировой ткани
- 2306140 Новые рецепторы для Helicobacter pylori и их применение
- 2205612 Способ эндотелизации IN VITRO протезов кровеносных сосудов
- 2105540 Депигментирующее средство
- 2304960 Косметическое средство для кожи
- 2304616 Гены участвующие в гомеостазе и адаптации
- 2204550Способ получения длинноцепочечной N-Ацилированной кислотой Аминокислот
- 2204415 Способ получения изображения
- 2204394 Средство для лечения грибковых инфекций, желудочных язв
- 2204366 Способ хирургического лечения глаукомы
- 2104034 Вагинальное увлажняющие средство, способ его получения
- 2303991 Биологически активная добавка
- 2303990 БАД
- 2303973 Адсорбирующее изделие
- 2203676 Средство обладающее иммунокорригирующим действием
- 2203672 Способ предупреждения беременности
- 2303635 Гены кодирующие белки резистентности и толерантности к стрессам
- 2303529 Способ фиксации альгинатного геля на твердой фазе, способ получения клеточного чипа на его основе
- 2203078 Способ лечения гнойных ран
- 2302412 Гидразоно-малонитрилы
- 2102400 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2202356 Способ стимуляции репаративных процессов длительно незаживающих ран и трофических язв
- 2202336 Средство для ухода за кожей
- 2302231 Глазные капли
- 2102082 Способ магнитометрического исследования тела человека или животного
- 2301814 Полиакриламидный гидрогель
- 2201765 Гибридные матричные имплантанты и эксплантанты
- 2301677 Биотрансплантант для лечения дегенеративных и трвматических заболеваний хрящевой ткани и способ его получения
- 2301676 Способ лечения ревматизма
- 2301674 Способ лечения больных с переломами нижней челюсти
- 2301661 Средство с регулируемым освобождением и способ его получения
- 2005488 Средство для лечения болезней соединительной ткани
- 2200001 Крем для кожи
|
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
|
Патент №2320720 |
(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ФИБРОБЛАСТОВ ДЛЯ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ
(57) Реферат:
Изобретение относится к биологии и к технологии получения клеток, используемых в косметических целях (например, с целью омоложения и/или улучшения состояния кожи пациентов). В частности, изобретение касается культивирования аутологичных фибробластов для последующего использования в качестве средства для заместительной терапии. Способ включает выделение клеток фибробластов из биоптатов кожи человека путем ферментативной обработки в растворе DMEM/5% ЭБС/0,2% диспазы/0.1 мг/мл коллагеназы I типа, центрифугирование суспензии клеток, ресуспендирование осевших клеток в среде DMEM/10% ЭБС/100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 100 ед/мл фунгизона и длительное культивирование фибробластов в среде с собственной сывороткой крови пациента: DMEM/10% ССКП/100 ед/мл стрептомицина, 100 ед/мл фунгизона или в терапевтической среде AIM-V. Изобретение позволяет избежать возможного иммунного ответа, а также достичь лучшей приживаемости клеток при заместительной терапии, 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.
Изобретение относится к биологии и к технологии получения клеток, используемых в косметических целях (например, с целью омоложения и/или улучшения состояния кожи пациентов). В частности, изобретение касается культивирования фибробластов, выделенных из биоптатов кожи, для последующего использования в качестве средства для регенеративной терапии в косметологии.
Клетки, выращенные in vitro, способны при культивировании в соответствующих условиях сохранять свои физиологические функции и могут использоваться при замещении, восстановлении, корректировке функций поврежденных тканей или в косметических целях для омоложения или улучшения состояния кожи.
Известен способ внутрикожного введения эмбриобласта с целью омоложения и биостимуляции кожи (RU 2197952, 2001). Однако недостатком данного способа является аллогенность вводимого препарата, включающего клеточные экстракты эмбрионов овцы, и соответственно возможность побочных эффектов в виде иммунной реакции в организме пациента.
Известен штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека - штамм ЛЭЧ-4(81) и способ его культивирования. (RU 2213775, 2003). Способ заключается в том, что культура клеток в виде монослоя используется для получения гомогенной взвеси клеток, которую наносят на специально подготовленную рану. Как правило, взвесь клеток стимулирует собственные процессы заживления в ране, а затем отторгается. Недостатком этого способа является недостаточная эффективность в результате невозможности интеграции имплантанта в окружающие ткани из-за аллогенности наносимых клеток.
Также известен способ введения гиалуроновой кислоты внутрикожно (RU 2194512, 2001), который используется для улучшения структуры кожи. Недостатком данного способа является уникальность вводимого компонента внеклеточного матрикса, в то время как в состав компонентов внеклеточного матрикса, который обеспечивает нормальные обменные процессы и поддерживает тургор кожи, входят десятки компонентов. Предлагаемый способ существенно расширяет спектр компонентов внеклеточного матрикса, которые начинают синтезироваться при введении фибробластов.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ омоложения кожи (патент WO 2004048557), включающий терапию аутологическими недифференцированными мезенхимальными клетками, кератиноцитами и фибробластами. В данном способе предлагается вводить охарактеризованную культуру фибробластов. Недостатком способа является культивирование клеток в среде, содержащей эмбриональную сыворотку быка, с последующей отмывкой в бессывороточной среде в течение 12 часов перед введением пациенту. Такая кратковременная отмывка не может обеспечивать полноценное избавление от чужеродных белков эмбриональной сыворотки, что может вызывать иммунную реакцию пациента на вводимые клетки.
Технический результат, достигаемый предлагаемым способом, заключается в повышении эффективности и тканеспецифичности получаемого продукта, улучшении качества получаемых клеток, повышении эффективности способа их получения и эффективности терапии в целом.
Для достижения указанного технического результата в способе культивирования фибробластов, включающем выделение клеток и инкубирование в питательной среде, выделение фибробластов осуществляют из биоптатов кожи путем ферментативной обработки. Для этого биоптат кожи после выделения в стерильных условиях обрабатывают раствором DMEM (Sigma)/5% ЭБС/0,2% диспазы (Gibco)/0.1 мг/мл коллагеназы I типа (Worthington Biochemical) и при постоянном помешивании и пипетировании инкубируют кусочки кожи при температуре 37°С в течение 1,5 часов. Полученную суспензию центрифугируют 5 мин при 200 g, супернатант сливают, осевшие клетки ресуспендируют в новой порции стандартной среды для фибробластов (DMEM/10% ЭБС /100 ед/мл пенициллина (Gibco), 100 ед/мл стрептомицина (Gibco), 100 ед/мл фунгизона (Gibco)) и высевают на чашки. После достижения монослоя фибробласты переводят на культивирование в среде с собственной сывороткой крови пациента (ССКП) (DMEM/10% ССКП/100 ед/мл стрептомицина (Gibco), 100 ед/мл фунгизона (Gibco)) или в терапевтической среде AIM-V (Gibco). AIM-V среда предназначена для культивирования клеток и тканей человека ex vivo и не содержит животных эмбриональных добавок, которые могли бы вызывать иммунный ответ при введении клеток пациентам.
Целесообразно культивированные фибробласты дополнительно обрабатывать путем добавления rhTGF- 1 (R@D Systems) в концентрации 5 нг/мл в среду культивирования.
Известно что часть фибробластов экспрессирует а-актин - сократительный белок, который характерен для миофибробластов - фибробластов сократительного фенотипа. Обычно миофибробласты появляются в коже при ее повреждении и способствуют стягиванию краев раны и ее заживлению. По мере культивирования фибробластов количество а-актин позитивных клеток увеличивается и достигает 30% при монослое, количество а-актин позитивных клеток не зависит от пассажа. Введение миофибробластов в кожу пациентам способствует эффекту подтягивания. Для увеличения количества миофибробластов и увеличения «эффекта подтягивания» при введении в кожу пациентам культуру клеток дополнительно обрабатывали добавлением rhTGF-1 (R@D Systems) в среду культивирования в концентрации 5 нг/мл, что повышало количество миофибробластов в культуре (фиг.1) и увеличивало эффект подтягивания.
Клетки несколько раз отмывали от среды в буфере Krebs-Ring (Sigma), обрабатывали раствором 0,25% трипсина /0,02% ЭДТА для снятия клеток с подложки, добавляли 1 мл Krebs-Ringer, суспендировали клетки и центрифугировали 5 мин при 200 g. Супернатант сливали, а клетки ресуспендировали в новой порции раствора Krebs-Ringer для введения пациентам.
Длительное культивирование клеток на среде, не содержащей животных эмбриональных добавок (культивирование на среде с собственной сывороткой крови пациента или на терапевтической среде AIM-V (Gibco)), позволяет избежать возможного иммунного ответа, а также достичь лучшей приживаемости клеток при заместительной терапии. Существенным фактором изобретения является характеристики используемых клеток, а именно их фенотип, секреция компонентов внеклеточного матрикса и факторов роста, что подтверждается нижеприведенным примером осуществления изобретения и результатами лабораторных исследований.
Пример.
Культуру дермальных фибробластов получали из биоптатов кожи размером 2×3×4 мм. Используя стерильные инструменты, биоптат кожи после выделения помещали в одноразовую пробирку со средой: DMEM (Sigma)/ 100 ед/мл пенициллина (Gibco), 100 ед/мл стрептомицина (Gibco), 100 ед/мл фунгизона (Gibco). Далее в стерильных условиях культурального бокса биоптат переносили в раствор DMEM/5% ЭСВ/0,2% диспазы (Gibco) 0.1 Мг/мл коллагеназы I типа (Worthington Biochemical) и при постоянном помешивании и пипетировании инкубировали кусочки кожи при 37°C в течение 1,5 часов. Далее полученную суспензию центрифугировали 5 мин при 200 g, супернатант сливали, осевшие клетки ресуспендировали в новой порции стандартной среды для фибробластов стандартной среды для фибробластов (DMEM/10% ЭСБ /100 ед/мл пенициллина (Gibco), 100 ед/мл стрептомицина (Gibco), 100 ед/мл фунгизона (Gibco)) и высевали на чашки. При достижении конфлюента клетки пассировали: монослой клеток обрабатывали раствором 0,25% трипсина/0,02% ЭДТА для снятия с подложки и рассаживали в соотношении 1:3. При достижении монослоя клетки переводили на культивирование в среде, содержащей собственную сыворотку крови пациента (ССКП): DMEM/10% ССКП/100 ед/мл пенициллина (Gibco), 100 ед/мл стрептомицина (Gibco), 100 ед/мл фунгизона (Gibco), или в терапевтической среде AIM-V (Gibco). Клетки несколько раз отмывали от среды в буфере Krebs-Ring (Sigma), обрабатывали раствором 0,25% трипсина/0,02% ЭДТА для снятия клеток с подложки, добавляли 1 мл Krebs-Ringer, суспендировали клетки и центрифугировали 5 мин при 200 g. Супернатант сливали, а клетки ресуспендировали в новой порции раствора Krebs-Ringer для введения пациентам.
Для длительного хранения клетки замораживали в среде культивирования с добавлением 15-20% ЭБС и 10% ДМСО.
Для увеличения количества миофибробластов и увеличения "эффекта подтягивания" культуру клеток дополнительно обрабатывали добавлением rhTGF-1 в концентрации 5 нг/мл в среду культивирования. Перед введением в кожу пациентам аликвоту клеток в среде культивирования собирали и тестировали на присутствие инфекции методом ОТ-ПЦР и в случае отрицательного результата использовали для подготовки к введению. Клетки несколько раз отмывали от среды в буфере Krebs-Ring (Sigma), обрабатывали раствором 0,25% трипсина/0,02% ЭДТА для снятия клеток с подложки, добавляли 1 мл Krebs-Ringer, суспендировали клетки и центрифугировали 5 мин при 200 g. Супернатант сливали, а клетки ресуспендировали в новой порции раствора Krebs-Ringer для введения пациентам.
При введении фибробластов в кожу пациентам необходимо, чтобы количество вводимых фибробластов, полученных вышеописанным способом, было достаточно для достижения максимального терапевтического эффекта, но не превышало оптимальную дозу и не вызывало их склеивания или травмирования ни в капсуле, ни при прохождении через иглу. Оптимальная концентрация, по нашим данным, соответствует 1 миллиону фибробластов в 1 мл физиологического раствора или буфера Krebs-Ring (Sigma). За один сеанс в соответствии с медицинскими показаниями во избежание побочных явлений объем вводимой жидкости при косметических процедурах не должен превышать 10 мл (физ. раствора). Поэтому при на основании поученных данных оптимальная доза вводимых клеток не должна превышать 10 млн клеток в 10 мл физ. раствора за один сеанс.
Для профилактики и коррекции процесса старения кожи могут использоваться различные способы введения.
Мультиинъекция - интродермальные инъекции с образованием мелкой папулы диаметром 0,1-0,2 мм для создания «депо» фибробластов с целью удержания их в эпидерме и последующим распределением в ней. Подобная микротравма активизирует процессы микровоспаления в эпидерме, которые в свою очередь стимулируют экспрессию и секрецию факторов роста, синтезируемых вводимыми фибробластами, а также стимулируют синтез гликозоамингликанов и, следовательно, гиалуроновой кислоты, рецепция к которой повышена у фибробластов, полученных заявляемым способом. Подобные инъекции можно выполнять на любых участках кожи, где имеются следы возрастных изменений - морщины, дряблость ткани, провисание, а также в местах с тенденцией к образованию морщин для предупреждения их развития. Папулы делаются на расстоянии примерно 0,5 см друг от друга.
Инъекции под мелкие морщины рекомендуется делать с меньшим интервалом между уколами. Папулы должны быть расположены в непосредственной близости друг от друга, практически касаясь одна другой. Подобная частота введения фибробластов сама по себе стимулирует фиброз, который дает эффект «подтирания морщины», что дает дополнительный положительный результат и клинический эффект от вводимых в эту зону фибробластов.
Линейный способ заполнения морщин. Этот способ заключается во введении всей иглы подкожно вдоль морщины и инъекции фибробластов по мере извлечения иглы. Этот способ может быть использован не только при коррекции глубоких мимических морщин, но также при введении фибробластов по контуру овала лица и в местах выраженного прободения ткани.
В местах прободения эпидермы, как правило, в зонах боковых поверхностей лица под скулой, целесообразно вводить фибробласты по параллельным, а затем по перпендикулярным линиями по всей длине иглы, формируя «сетку». Ширина между линиями введения зависит от размера восстанавливаемой области и может быть от 0,2-0,4 мм и более.
Комбинированный метод - это сочетание одновременно нескольких способов введения фибробластов. Такой подход приводит к хорошим результатам при терапии глубоких мимических морщин при терапии в нижней части лица, в местах «провисания» кожи и в области декольте.
Все перечисленные методы введения фибробластов могут применяться для любых участков дермы. Исключения составляют невусы, новообразования, келоидные рубцы.
Введение фибробластов совместно с гиалуроновой кислотой.
При введении в кожу пациентам выращенные заявляемым способом фибробласты могут быть смешаны с гиалуроновой кислотой и физраствором в определенных пропорциях или только с гиалуроновой кислотой или введение фибробластов может сопровождаться инъекциями гиалуроновой кислоты. Культивируемые в условиях in vitro фибробласты обладают повышенной экспрессией рецептора к гиалуроновой кислоте (экспрессируют рецептор CD44 на поверхности мембраны). Гиалуроновая кислота участвует в процессах регуляции клеточной пролиферации, миграции и регенерации тканей, а также является важным регулятором ангиогенеза и участвует в удержании воды в эпидерме. За счет своей вязкости гиалуроновая кислота может «задерживать» фибробласты в зоне инъекции, а также обеспечивать лучшее взаимодействие фибробластов с компонентами внеклеточного матрикса, тем самым повышая выживаемость вводимых клеток в условиях in situ. Совместное введение фибробластов с гиалуроновой кислотой возможно по всем перечисленным выше методикам.
Исследования проводились на добровольцах в возрасте от 35 до 60 лет. Положительный результат при введении фибробластов в кожу пациентов описанным способом с целью предупреждения и коррекции возрастных изменений проявляется не сразу, а спустя 3-5 недель после инъекции. При введении суммарной дозы фибробластов 5-7 млн в объеме 5-7 мл на лицо у большинства пациентов омолаживающий эффект сохранялся в течение 1,5-2 года (общий срок наблюдений составил 2 года). Учитывая особенности биохимических процессов в коже (активность факторов ангиогенеза и интенсивность обменных процессов во внеклеточном матриксе), повторную процедуру введения фибробластов целесообразно проводить не ранее чем через 4 месяца. Процедуру рекомендуется повторять только пациентам с выраженными возрастными изменениями в коже, при глубоких морщинах и выраженной дряблости, используя описанные оптимизированные концентрации фибробластов в соответствующем объеме физ. раствора.
Для подтверждения достигаемого эффекта нами были проведены исследования, при которых клетки выделяли из биоптатов кожи с внутренней поверхности предплечья у 10 здоровых женщин в возрасте от 30 до 60 лет. Выделенные клетки культивировали вышеописанным способом и анализировали на ранних и поздних пассажах. Оценка фенотипа, экспрессии и секреции различных факторов проводилась методом иммуногистохимии с использованием панели специфических антител. Типирование клеток, анализ экспрессионной активности в этих клетках и в среде культивирования проводили на разных пассажах, начиная с 5 и до 15 пассажа.
Перед окрашиванием клетки фиксировали в 4% формалине (Sigma) 4 мин при комнатной температуре, затем обрабатывали 0,2% Triton X100 в течение 10 минут. Затем промывали PBS буфером (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na2HPO4·2H2O, 1,4 мМ KH2PO4) и инкубировали в 1% растворе БСА (бычий сывороточный альбумин), содержащего 10% сыворотки донора вторых антител для забивки неспецифического связывания (60 минут). Далее на клетки наносили соответствующие первые антитела против исследуемого антигена на 60 минут. После отмывки в PBS клетки помещали в раствор вторых антител, конъюгированных с флюорохромом Alexa 595 (Molecular Probes), на 1% растворе БСА и инкубировали в течение 60 мин. Для визуализации ядер клетки докрашивали флюоресцентым красителем DAPI (Dako). После отмывки в PBS клетки заключали в среду Mounting Medium Vectashield (Vector Laboratories Inc.). Готовые препараты хранили при +4°С в темноте. Полученные препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Axiovert 200M (Zeiss). Документирование изображений производили с помощью цифровой видеокамеры Ахюсат HRC (Zeiss, Германия) и обработки изображения в программе Axiovision 3.1.
Культивируемые клетки были протестированы с помощью панели маркеров, характерных для разных типов клеток. Основной тип выделяемых клеток соответствует фибробластам клеткам мезенхимального происхождения, так как культивируемые клетки экспрессируют два стандартных маркера фибробластов - CD90 и виментин. Результаты исследований приведены в Таблице и на фиг.2.
Как видно из Таблицы, получаемая популяция является гетерогенной. Анализ клеточных популяций на присутствие зрелых кератиноцитов и стволовых клеток базального слоя эпидермиса показал, что в целом ряде образцов присутствуют 1-интегрин-позитивные клетки, которые представляют собой либо стволовые клетки базального слоя эпидермиса, либо гематопоэтические предшественники.
Тестируя культуру клеток на наличие гемопоэтических и эндотелиальных предшественников разной степени дифференцировки, были проанализированы антигены CD34, CD 105 и VE-кадгерин. В одном случае были обнаружены CD34 и VE-кадгерин-позитивные клетки; клетки из этого образца отличались высокой степенью роста в культуре, а терапия фибробластами была высоко эффективной. Все исследованные образцы были CD105 негативны, то есть не содержали эндотелиальных предшественников, экспрессирующих CD105. Эти данные показывают, что получаемая при длительном пассировании культура клеток гетерогенна и в ней могут присутствовать стволовые клетки базального слоя эпидермиса и гематопоэтические предшественники, а также, возможно, зрелые эндотелиальные клетки.
Для характеристики функциональной активности культивируемых клеток фибробласты тестировались на способность продуцировать компоненты внеклеточного матрикса: коллаген I типа, тропоэластин, коллаген IV типа и фибронектин (Таблица).
Нами было выявлено, что культивируемые предлагаемым способом фибробласты активно синтезируют предшественник коллагена I типа - проколлаген I типа (фиг.3). Наиболее интенсивное окрашивание соответствует локализации аппарата Гольджи в цитоплазме и во внеклеточном матриксе. Известно, что старение кожи связанно со старением коллагена, что выражается в увеличении количества поперечных сшивок между фибриллами коллагена. Введение культивированных фибробластов в кожу позволяет активизировать процесс синтеза коллагена, что позитивно влияет на состояние внеклеточного матрикса и упругость кожи.
Широко известно, что синтез эластина постепенно прекращается по мере старения организма, что является одной из причин потери эластичности кожи и сосудов. Тропоэластин является компонентом эластиновых волокон и продуцируется при синтезе эластина de novo. Нами впервые было обнаружено, что культивируемые клетки синтезируют значительные количества тропоэластина (фиг.3). Эти данные свидетельствуют о том, что позитивный эффект, который оказывают фибробласты при введении в кожу, обусловлен также накоплением эластина во внеклеточном матриксе.
Обнаружено, что фибробласты в культуре синтезируют коллаген IV типа (фиг.3), который является основным компонентом базальной мембраны. Старение часто сопровождается нарушением состава или целостности базальной мембраны, поэтому синтез и секреция коллагена IV типа при введении в кожу культивируемых фибробластов способствует поддержанию нормальной организации дермы и эпидермиса.
Из литературы известно, что нарушения синтеза фибронектина возникают при старении кожи, а также в культуре при длительном культивировании фибробластов. Фибробласты, культивируемые до 15 пассажа, синтезируют фибронектин во внеклеточный матрикс Вероятно, фибронектин, синтезируемый во внеклеточный матрикс, стимулирует миграцию макрофагов и лимфоцитов, клеток, секретирующих большое количество цитокинов и факторов роста, что активизирует обменные процессы в коже.
Суммируя полученные данные в Таблице, можно сделать вывод о том. что фибробласты в культуре синтезируют компоненты внеклеточного матрикса: коллагены I и IV типа, фибронектин. Особенно следует подчеркнуть важность синтеза тропоэластина в условиях in vitro, так как синтез тропоэластина de novo в нормальных условиях практически отсутствует и активируется в коже только при повреждении.
Исследуя далее функциональную активность культивируемых предложенным способом кожных фибробластов, мы оценили их способность экспрессировать рецептор гиалуроновой кислоты CD44. Оказалось, что во всех образцах обнаружена 100% окраска на этот антиген (фиг.4). Известно, что гиалуроновая кислота является важнейшим компонентом внеклеточного матрикса, участвующим в поддержании тургора кожи, и ее содержание в коже снижается по мере старения. Введение клеток, экспрессирующих рецептор к гиалуроновой кислоте, способствует удержанию гиалуроновой кислоты в дерме в зоне введения и увлажнению кожи. Совместное введение культивируемых фибробластов и гиалуроновой кислоты в кожу пациентов повышает выживаемость фибробластов в коже в условиях in situ.
Методом электрофореза с последующим иммуноблоттингом мы оценивали экспрессию рецептора к трансформирующему фактору роста бета (TGF-1) - ключевому регулятору синтеза белков матрикса. Оказалось, что культивируемы фибробласты не имеют рецептора TGF-1, что позволяет предполагать, что стимуляция синтеза компонентов внеклеточного матрикса запускается в фибробластах через другой рецептор. Известно, что TGF-1 стимулирует формирование фиброза в коже. В фетальной коже TGF-1 практически не обнаруживается, что обуславливает безрубцовое заживление ран. Отсутствие рецептора к TGF-1 на фибробластах позволяет предполагать, что введение этих клеток в кожу пациентам не будет приводить к осложнениям в виде фиброза.
Обобщая полученные результаты можно заключить, что:
1. Клетки, полученные из кожных биоптатов и культивированные до 5-15 пассажей, по морфологическим характеристикам и экспрессии антигенов в подавляющем большинстве соответствуют фибробластам. Часть клеток имеет выраженный сократительный фенотип и соответствуют миофибробластам. Небольшое количество клеток имеет характеристики клеток-предшественников.
2. Клетки имеют высокий уровень секреторной активности и продуцируют проколлаген I типа, коллаген IV типа, фибронектин и тропоэластин - компоненты адгезивной системы клетки и внеклеточного матрикса, участвующие в поддержании тургора и эластичности кожи.
3. Практически все клетки экспрессируют рецептор гиалуроновой кислоты (CD44).
4. В процессе культивирования, начиная с 5 и по 15 пассаж, изменений в уровне экспрессии изучаемых антигенов нет.
5. Введение аутологических фибробластов, выделенных из кожных биоптатов и культивируемых in vitro в кожу пациентов для коррекции морщин и с целью омоложения, оказывает позитивный эффект и может быть использовано для терапии возрастных изменений кожи в косметологии.
Полученные результаты позволяют предполагать, что терапевтический (омолаживающий) эффект при аутотрансплантации кожных фибробластов обусловлен тем, что в течение определенного времени после введения в кожу фибробласты сохраняют способность синтезировать компоненты внеклеточного матрикса - коллагены, тропоэластин и фибронектин, а также способность удерживать гиалуроновую кислоту за счет высокого уровня экспрессии рецептора CD44 на поверхности. Определенный вклад в терапевтический эффект может вносить и присутствие в культуре клеток-предшественников - стволовых клеток базального слоя эпидермиса и CD34 позитивных клеток.
| Таблица |
| CD90 |
Маркер фибробластов |
+ |
| виментин |
Стандартный маркер цитоскелета клеток мезенхимального происхождения |
+ |
| пан-кератин |
Накапливается в кератиноцитах при созревании |
± |
| 1 интегрин |
Экспрессируется на стволовых клетках базального слоя эпидермиса |
± |
| CD 105 |
Рецептор TGF; экспессируется на незрелых эндотелиальных клетках |
- |
 -актин |
Характерен для клеток сократительного фенотипа |
± |
| проколлаген I типа |
Синтезируется и секретируется фибробластами во внеклеточный матрикс |
+ |
| тропоэластин |
Синтезируется фибробластами и образует эластин |
+ |
| коллаген IV типа |
Основной компонент базальных мембран |
± |
| фибронектин |
Компонент внеклеточного матрикса; его количество увеличивается при повреждении, старении кожи и длительном культивировании фибробластов |
+ |
| HGF- |
Фактор роста - стимулирует ангиогенез, предотвращает апоптоз |
- |
| CD44 |
Рецептор гиалуроновой кислоты, компонента внеклеточного матрикса |
+ |
| TGF1 рецептор |
Рецептор, регулирующий экспрессию внеклеточного матрикса. Фактор фиброза |
- |
| CD34 |
Маркер гематопоэтических и эндотелиальных клеток-предшественников; может выявляться в разных типах стволовых клеток в норме и при патологии |
± |
| VE-кадгерин |
Маркер зрелых эндотелиальных клеток |
± |
Формула изобретения
1. Способ культивирования фибробластов для заместительной терапии, включающий выделение клеток и инкубирование в питательной среде, отличающийся тем, что выделение фибробластов осуществляют из биоптатов кожи человека путем ферментативной обработки в растворе DMEM/5% ЭБС/0,2% диспазы/0.1 мг/мл коллагеназы I типа при постоянном помешивании и пипетировании при температуре 37°С в течение 1,5 ч в стерильных условиях, полученную суспензию клеток центрифугируют 5 мин при 200 g, супернатант сливают, осевшие клетки ресуспендируют в среде DMEM/10% ЭБС/100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 100 ед/мл фунгизона и высевают на чашки, затем фибробласты переводят на длительное культивирование в среде с собственной сывороткой крови пациента: DMEM/10% ССКП/100 ед/мл стрептомицина, 100 ед/мл фунгизона или в терапевтической среде AIM-V, перед введением пациентам клетки несколько раз отмывают в буфере Krebs-Ring, обрабатывают раствором 0,25% трипсина/0,02% ЭДТА для снятия клеток с подложки, добавляют 1 мл Krebs-Ringer, центрифугируют 5 мин при 200 g, супернатант сливают, клетки ресуспендируют в новой порции раствора Krebs-Ringer для введения пациентам.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивированные фибробласты дополнительно обрабатывали добавлением rhTGF-1 в концентрации 5 нг/мл в среду культивирования.
|
