ферменты

ЛАБОРАТОРИЯ КЛЕТОЧНОЙ КОСМЕТИКИ

estra-X

СПИСОК ПАТЕНТОВ С УПОМИНАНИЕМ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ

95114061 Способ получения гиалурона
2017751 Способ получения гиалурона
2192150 БАД для профилактики йодной недостаточности
2112542 Препарат для лечения патологий соединительных тканей
2225206 Препарат для лечения рака молочной железы
2299733 Лечение опорно-двигательного аппарата
2299732 Способ лечения глаукомы
2299726 Противоинфекционная губная помада
2299725 Косметическое средство для ухода за кожей
2198878 Ароматическое соединение
2198702 Способ подготовки трофических язв к аутодермапластике
2198653 Вагинальные суппозитории
2197946 Композиция для ухода за волосами
2197923 Фармацевтическая композиция для лечения отеков роговицы
2298410 Биотрансплантант и способ лечения ревматических и аутоиммунных заболеваний
2197501 Фотоотверженный гель на основе сшитой гиалуроновой кислоты
2197228 Твердые лекарственные формы
2197222 Водная компазиция для ухода за волосами, лица и тела
2297425 Полипептиды
2297240 Композиция с гиалуроновой кислотой
2297230 Фармацевтическая компазиция с ксантоновой смолой
2196588 Глазные капли
2195955 Применение биологически активных веществ
2195926 Дерматологические композиции
2295954 Микрочастицы для доставки нуклеиновых кислот
2295951 Косметика для ухода за кожей лица и век
2195262 Фармакологическое средство на основе гиалуроновой кислоты
2194512 Способ профилактики и коррекции процесса старения кожи
2194478 Лечение экземы
2294716 Расширяемый стент
2194055 Сшитые сополимеры
2099350 Ассоциаты депротонированной гиалуроновой кислоты
2293557 Средство для лечения кожи и слизистых
2292878 Приготовление микроцастиц, содержащих метопропол
2292746 БАД
2192256 Защита кишечника
2191782 Получение модифицированной гиалуроновой кислоты
2292219 Паратиреоидный гормон человека
2291686 Микроцастицы
2191000 Косметическая маска
2290921 Фармацевтические и косметические средства против старения кожи
2290900 Модифицированный биоматериал для использования в офтальмологии
2290899 Получение биоматерьяла
2290397 Новые инданилиденовые соединения
2290186 Лечение сирингомиелии
2288702 Иррингационный раствор для офтальмологии
2288699 Гель для лечения стоматологических заболеваний
2188011 Активирующая остеогенез фармацевтическая композиция
2187327 Средство с антисептиком
2187325 Средство с радиопротекторным действием
2287330 Композиции миноксидила
2186786 Способ получения гиалуроновой кислоты
2186593 Лечение раненого процесса кожи
2286801 Очищение воды
2286781 Лечение ожогов пищевода у детей
2286764 Средство лечения воспалений полости рта
2185840 Лечение инфекционных заболеваний
2286151 Альфа-2-Дельта-Лиганда
2185149 Ранозаживляющий гель
2285527 Лечение ИЛ-6 заболеваний
2184448 Раствор хранения роговицы, включающий гиалуроновую кислоту
2090179 Крем для кожи
2183961 Способ лечения кожи
2284331 Соли алифотических аминов
2284187 Производные амида
2089191 Снизить внутрение давление
2283320 Получение гликозаминогликанов
2283129 Лечение опухолей
2283098 Косметические средства с Q
2182574 Ароматические соединения
2088257 Средство с гипохолестеролемическим действием
2088218 Состав для гигиенических салфеток
2088206 Способ получения препарата, создающего исскуственный загар
2282462 Противомикробные средства
2182008 Интровагинальная компазиция
2181999 Препарат с отсроченным высвобождением
2181998 Новые композиции липидов
2181995 Лечение болевого синдрома
2181295 Вирионная вакцина
2087144 Витамин Е
2379336 Способ стирки
2379052 Вакцинация
2180855Композиция в виде ионного комплекса
2379025 Противоинфекционный гель
2180825 Лечение травм роговицы
2281082 Способ коррекции эстетических и возрастных проблем кожи
2180576 Биоактивная добавка для косметических средств
2280459 Средство для изменения скорости роста или репродукции клеток
2179981 Соли переходного металла
2378010 Жидкие вакцины
2378008 Комбинированные вакцины
2378007 Анаболическое средство
2377973 Растительные экстракты
2280041 Способ получения водорастворимых комплексов гиалурил
2280038 Биополимеры
2323733 Йодный обмен
2377260 Гель
2178693 Противовирусное средство на основе гиалуроновой кислоты
2178692 Облегчающие зуд косметическое средство
2377022 Гемостатические спреи
2376982 Увлажняющая сыворотка для лица
2376974 Трансдермальный гель для лица
2362784 Гипо-и гиперацетилированные менингокковые капсульные сахариды
2177789 Устройство для доставки лекарства к шейке матки
2277954 Крем для лица омолаживающий
2376378 Способ получения метионина
2177332 Биоматериал для предотвращения послеоперационных спаек, с производной гиалуроновой кислотой
2177310 Способ получения таблеток
2376011 Средство для позвоночника
2277410 Косметическое средство
2323748 Медицинская повязка
2276998 Гидрогелевые композиции
2082416 Способ получения препарата с коллагенном из животного сырья
2375081 Адсорбирующее изделие
2375049 Охлаждающий пластырь
2346049 Способ получения гиалурона
2275913 Фармацевтические средства
2174985 Полисахарид с антиоксидантом
2373957 Носитель для лекарственных средств и биологически активных веществ
2373941 Способ коррекции возрастных и патологических изменений кожных покров
2174845 Композиции и способы доставки генетического материала
2174830 Средство для укрепления волос
2373769 Синбиотическая композиция
2274472 Лечение апорно-двигательного аппарата и болевых синдромов
2372929 Профилактическая композиция на основе веществ фенольной природы в липосомной форме
2173563 Способ нанесения на поверхность предметов покрытия на основе гиалуроновой кислоты, её производных и полусинтетических полимеров
2079304 фармацевтическая композиция, обладающая иммуносупрессорной и антимикробной активностью
2273645 Полипептид ожирения
2173154 Фракция кератансульфатолигосахаридов и содержащий ее фармацевтический препарат
2173136 Грязная мазь
2173128 Способ хирургического лечения центральных разрывов сечатки
2078561 Косметическое средство предотвращающее старение кожи
2172490 Способ прогнозирования воспалительных заболеваний молочной железы при эндопластике
2272645 Способ лечения ЦМВ-Инфекции у детей раннего возроста
2272636 Фармацевтическая композиция для местного лечения воспаления
2272635 Фармацевтически активная субстанция для офтальмологии
2272599 Биоматерьял для стабилизации прогрессирующей миопии "Коллаплант"
2172168 Средство для заживления ран на основе гиалуроновой кислоты
2371172 Фармацевтическая композиция для лечения нервной системы на основе стефаглабрина
2171470 Способ прогнозирования послеоперационной трансформации доброкачественных опухолей нервной системы
2077317 Состав для ванн
2271213 Комбинированные композиции, содержащие экстракты из растений и морских животных
2076872 Способ получения окрашенной гиалуроновой кислоты
2076671 Раствор для защиты роговицы
2370281 Конъюгаты гидроксиалкилкрахмал
2370275 Способ лечения (коррекции) косметических и возрастных дефектов кожи
2370258 Фармацевтическая композиция для парентальной доставки в форме лиофилизата
2270023 Способ экстракции и очистки протеогликана хрящего типа (варианты)
2369408 Гемостатическая композиция, включающая гиалуроновую кислоту
2369387 Фармацевтическая композиция для лечения нервной системы
2369379 Нетаблитированные жевательные формы для индивидуального введения
2169136 Производное коричной кислоты
70792 Медицинский аппликатор
20741717 Способ стабилизации аскорбиновой кислоты
2074712 Способ получения препарата, препятствующего преждевременной эякуляции
2367954 Способ прогнозирования развития кожной патологии у женщин с синдромом склерополикистозных яичников (СПКЯ)
2268075 Устройство для электрокинетической доставки
2268052 Средство для лечения воспалительных и дегенеративных заболеваний суставов
2167649 Способ получения твердой дисперсии умеренного водорастворимого лекарственного вещества
2167647 Гель для бритья
2073520 Лечение урологических инфекций
2367476 Биопластический материал
2367475 Мембрана для использования при направленной регенерации тканей
2367469 Фармацевтическая композиция на основе лизоамидазы
2367456 Фармацевтическая композиция обладающая антибактериальным и некролитическим действием
2367455 Фармацевтическая композиция обладающая некролитическим и антибактериальным действием
2267324 Применение антиадгезивных углеводов, препарат для уменьшения и /или блокирования адгезии патогенных веществ
2166934 Композиции включающие биологический агент
2166510 Псевдодипептиды
2366460 Композиции, имеющие высокую противовирусную и антибактериальную активность
2360901 Производные феноксиуксусной кислоты
2165749 Способ восстановления эндотелия роговицы
2265441 Способ укрепления склеры
2365382 Композиции и способы для регуляции развития сосудов
2070879 Соли гликозаминогликанов
2164914 Циклические и гетероциклические N - замещенные - иминогидроксамовые карбоновые кислоты
2264627 Хламидийный конъюктивит
2364399 Фармацевтический препарат на основе стефаглабрина
2264230 Препарат с замедленным высвобождением активного вещества
2363497 Фармацевтические композиции
2363496 Способ увеличения объема мягких тканей
2363473 Способ антифлогистической активации в эксперементе
2363461 Фармацевтический препарат на основе сигетина
2363459 Средства для введения в роговицу глаз для предотвращения офтальмологических нарушений
2363448 Фармацевтические композиции
2163123 Глазные капли
2162687 Усовершенствованнная лекарственная форма индуктора интерферана
2162343 Биосовместимый полимерный материал и способ его получения
2162327 Лечение рака
2067841 Способ получения ароматизатора
2161478 Способ консервированого лечения гонартроза
2361617 Вольфрамовые частицы в качестве рентгеноконтрастных веществ
2361552 Способы и устройства для дренирования жидкостей и понижения внутриглазного давления
2066996 Способ изготовления пленочного материала для офтальмохирургии
2361417 Корм с глюкозамином и экстрактом ивы для профилактики артроза у животных
2161002 Пищевой общеукрепляющий лечебно-профилактический продукт из хрящевой ткани акул
2360928 Комплексная матрица для медико-биологического применения
2160574 Способ лечения глаукомы
2360688 Способ лечения повреждений переферических нервов
2360670 Фармацевтическая композиция при климактерических расстройствах
2360646 Эндолюминальный протез
2260445 Способ усовершенствования транспортировки через легко прспосабливаемый полупроницаемый барьер
2260007 Производные амида
2359975 Способ получения модифицированных арабиногалактанов
2359974 Антигенные Пептиды
2159775 Псевдопептидный продукт
2259833 Фармацевтическая композиция для лечения роговицы глаза
2259816 Ранозаживляющее средство
2259815 Способ коррекции возрастных изменений, связанных с процессами старения кожи
2359706 Способ сохранения офтальмологических растворов
2359704 Антисептическое средство
2359662 Микрокапсулы
2159253 Катионные полимеры
2159111 Средство для ухода за кожей лица
2159105 Композиция для защиты кожи от опасных химических веществ Получение
2158593 Биосовместимый водный раствор
2358728 Способ лечения и предупреждения потери костной ткани
2258517 Способ хирургического лечения травмотических повреждений селезенки пленкой на основе гиалуроновой кислоты
2357968 Кристалические формы производной имидазола
2357957 Ингибиторы P38 и их применение
2157647 Пищевая добавка и ее получение
2357758 Препараты для чрескожной и чересслизистой добавки
2063244 Способ стабилизации растворов
2063140 Способ получения препарата для консервирования мяса
2157381 Способ получения гиалуроновой кислоты
2257198 Композиции микроцастиц
2356909 Белковый комплекс
2356570 Косметическая композиция
2256434 Способ закрытия перфорации барабанной перепонки
2356520 Способ лечения постконтузионного повреждения сечатки глаза
2156133 Гель
2255945 Полимерная композиция
2355761 Средства повторной дифференцировки
2061043 Способ повышения устойчивости урокиназы к нагреванию
2061005 Способ получения красителей для гистологических исследований
2355420 Зубная паста
2355385 Композиции пролонгированного действия с контролируемым высвобождением
2355240 Способ получения пищевого препарата хондропротекторного действия
2155057 Пихтово репейный бальзам
2354409 Способ производства высвобождающих лекарственные средчтва медицинских устройств
2254145 Раневое покрытие на основе коллаген-хитозанового комплекса
2254133 Лечение и профилактика ВИЧ-инфекции у человека
2253439 Фармацевтическая композиция для защиты и улучшения оптических свойств роговици при проведении эндовитреальных вмешательств
2253437 Способ омоложения кожи
2153352 Фармацевтическая композиция обладающая ранозаживляющим и противовоспалительным действием
2353354 Фармацевтический препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
2252787 Способ получения искусственной матрицы кожи
2252767 Способ нормализации иммунобиохимического гомеостаза коров в предродовом и послеродовом периодах
2352583 Фармацевтическая композиция содержащая Fc-область иммуноглобулина в качестве носителя
2152403 Модифицированные полисахариды
2352356 Иммуногенная композиция
2352342 Исскусственный физиологический солевый раствор Способ его получения
2352330 Фармацевтический препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
2352323 Фармацевтический препарат с модифицированным высвобождением
2152027 Способ подготовки ткани мозга для определения гликозаминогликанов
2251842 Интектицидный состав для борьбы с личинками оводов
2151580 Способ активации пролиферации эндотелия роговицы
2351648 Дифференцировка стромальных клеток, полученных из жировой ткани, в эндокринные клетки поджелудочной железы и их использование
2351595 N - гидроксиформамидные соединения в качестве ингибиторов металлопротеина
2251411 Косметическое средство в лиофилизированной фармацевтической форме
2251405 Косметика...ее композиции для косметических препаратов
2251367 Средство со сшитой гиалуроновой кислотой для наращивания тканей
2351359 Косметика для профилактики и лечения избыточной массы тела
2351322 Препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
2351153 Диета при остеортрите собак
2350958 Способ определения групповой принадлежности синовальной жидкости
2350625 Производные гиалуроновой кислоты с пониженной биодеградируемостью
2150266 Крем после бритья
2350354 Фармацевтическое средство содержащие антагонист и фактор некроза
2350340 Способ коррекции процессов регенерации
2350309 Способ лечения избыточной массы тела с помощью рефлексотерапии
2250047 Профилактический продукт из хрящевой ткани гидробионтов
2249467 Медицинский матерьял и изделия на его основе
2055079 Способ получения препарата гиалуроновой кислоты
2349599 Биоадгезив мидии
2054903 Способ лечения коллагеноза у бычков на откорме
2249210 Способ прогнозирования предрасположенности к развитию и тяжести течения деформирующего остеоартроза коленного сустава у взрослых
2349339 Средство для соединительной ткани
2148988 Человеческий интерферона
2148399 Лечение атеросклероза
2148396 Способ определения активного вещества в дифильных мазевых основах
2148375 Способ диагностики близорукости
2348415 Способ противоспаечной терапии после хирургического вмешательства
2348400 Препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
2348386 Способ непроникающего хирургического лечения первичной открытоугольной глаукомы
2248213 Лечение Галактозидальной А недостаточности
2347586 Микрофлюидизированные эмульсии типа "масло в воде" и вакцинные средства
2147243 Контрастное средство
2146526 Лечебный препарат дисбактериоза и урогенитальных инфекций
2146148 Терапевтическое применение фактора роста кератиноцитов (ФРК)
2146139 Способ повышения активности макрофагов и комбинации для его осуществления
2346277 Способ диагностики специфического синовита
2345793 Ультразвуковые контрастные вещества и их получение
2345782 Терапевтические комбинации на основе PORIFERA для лечения и предотвращения кожных заболеваний
2245131 Способ коррекции косметических недостатков кожи
2245130 Способ активации восстановительных процессов в коже
2144833 Хондроитиназа
2344809 Получение твердых дозированных форм с использованием сшитого нетермопластичного носителя
2244540 Косметический гель для ухода за кожей лица
2244536 Способ лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний тазобедренного сустава
2344167 Хмелевый экстракт
2143884 Агент регулирования дифференциации клеток кожи, культурная среда для клеток или тканей и способ регулирования дифференциации клеток кожи
2343932 Способ получения обладающих пониженной растворимостью в воде пленночных материалов
2343903 Устройство доставки лекарств для контролируемого введения препаратов
2048817 Способ получения материала для лечения ожогов и гнойно - некронических ран
2048803 Гидратантный крем
2242974 Средства и способы лечения воспалительных заболнваний
2142816 Способ получения антигерпетической вакцины
2342923 Средство для обработки рук с увлажняющим эффектом
2142781 Косметика для макияжа ресниц и бровей и агент ингирирующий рост микроорганизмов в косметических средствах
2242251 Трансплантируемые стенты с биоактивными покрытиями
2142257 Способ обработки глазных имплантантов и контакных линз
2342389 Мононатриевая соль
2342107 Способ устранения западения верхнего века при анофтальме
2141828 Средство, пролонгирующее эффективность чесночного порошка
2241489 Косметическое средство матриксных протеинов для залечивания ран
2241443 Средство для лечения герпеса
2241414 Способ получения протезов кровеносных сосудов
2341539 Гидрогель
2141324 Регулятор скорости воздействия препарата для инъекций
2141312 Косметическое средство для ухода за кожей лица
2341296 Средства и способы покрытия медицинских имплантантов
2341272 Средство для неспецифической иммунотерапии
2341266 Стенты с нанесенным покрытием содержащим N - (5-(4-(4-
2341257 Иммуномодулирующее средство
2341255 Средство для лечения климактерических расстройств
2240821 Способ лечения урологических инфекций
2140786 Способ лечения лишая
2140243 Способ хирургического лечения диабетической ретинопатии и отслоек сечатной оболочки
2240140 Медицинская многослойная повязка и изделия на ее основе
2240135 Культура клеток, содержащая клетки - предшественники остеонегеза, имплантант на ее основе и его использование для восстановления целостности кости
2240123 Экзогенные биологически активные коньюгирующие вещества
2139886 Фотоотвержаемое производное гликозаминогликата, сшитое производное гликозаминогликата и способы их получения, способ предотвращения клеточной и тканевой адгезии
2139729 Вакцина. Способ стимулирования иммунной системы
2339386 Средство обладающее радио - и химиозащитным действием
2339369 Лечение офтальмологических нарушений с использованием мочевины и ее производных
2139041 Гидратантный регенерирующий крем и способ его получения
2139039 Косметический суперкрем для ухода за кожей
2139017 Способ получения боисовместимого материала
2138503 Производные камптотецина, способы их получения, уникальное средство
2338556 Средство содержащие антагонист Р2Х - рецептора и нестероидное противоспалительное лекарственное средство
2338514 Косметическое средство для профилактики старения кожи
2138297 Медицинские устройства, подверженные вызываемому разложению
2138295 Покрытие для ран
2337906 Ингибиторы цитозольной фосфолипазы А2 Применение физиологически допустимого корпускулярного ферримагнитного или ферромагнитного материала. Способ формирования магнитометрического изображения
2137501 Устройство формирования изображения
2137477 Способ лечения заболеваний характеризующихся аутоиммунной агрессией
2137467 Крем для кожи лица и тела
2137449 Способ коррекции дефектов преломления в глазу млекопитающего
2137402 Пищевая Добавка БАД
2336899 Способ стимуляции миелопоэза
2336862 Способ получения раствора для лечения роговицы
2336830 Способ восстановления костных структур челюсти
2136696 Новый полипептид и средство против ВИЧ - Инфекции
2336092 Биоадгезивное средство, по существу свободное от воды
2336089 Средство и способ лечения заболеваний периодонтальных и пульпы
2336074 Средства и способы лечения заднего сегмента глаза
2235548 Ранозаживляющее средство
2135186 Способ лечения рефлекторных синдромов при остеохондрозе
2234945 Стабилизатор водного раствора и водосодержащего сырья
2334762 Растворимая ассоциативная карбоксиметилцеллюлоза
2234514 Макропористые хитозановые гранулы и способ их получения. Способ культивирования клеток
2133615 Средство для лечения неврологических заболеваний
2233164 Способ профилактики развития послеоперационных спаек брюшной полости
2133127 Неткатный материал, способ его получения и способ лечения
2333223 Альдегидные производные сиаловой кислоты и средства на их основе
2333007 Полипептидные вакцины для широкой защиты против рядов поколений менингококов с повышенной вирулентностью
2332985 Дозированные формы анестезирующих средств с длительным высвобождением для обезболивания
2132677 Косметическая маска
38603 Пленочный аппликатор
2232594 Средство содержащие ингибирующие остеокластогенез фактор и полисахарид
2332238 Средство для прокладок, раневых повязок и других изделий, контактирующих с кожей
2331668 Стромальные клетки, получение из жировой ткани, для заживления дефектов роговицы и внутриглазных дефектов и их использование
2331438 Альфа - 2 - Дельта Лигант для лечения симптомов нижних мочевыводящих путей
2331411Электропряденые аморфные фармоцевтические средства
2331367 Способ профилактики образования спаек и их рецидива
2130767 Масло в воде для получения косметических и дерматологических средств, способ косметической обработки
2230752 Поперечносшитые гиалуроновые кислоты и их применение в медицине
2230558 Способ восстановления и сохранения здоровья скмьи
2230550 Средства длительного высвобождения, способ их получения и применения
2230458 Поддержания здоровья суставов
2330290 Способ определения состояния метаболических процессов в ткани суставного хряща
2230073 Способ поперечного сшивания карбоксилированных полисахаридов
2329059 Способ лечения полипозного риносинусита
2329037 Комбинированная терапия для лечения иммуновоспалительных заболеваний
2128666 Гиалуроновая кислота и ее соли, способ очистки гиалуроновой кислоты, способ получения гиалуроновой кислоты. Фармацевтический препарат с гиалуроновой кислотой и средства с гиалуроновой кислотой используемые в офтальмологии
2328740 Способ экспресс - оценки действия зубных паст
2128502 Косметический гель
2328272 Суппозитории индуктора интерферона
2328268 Косметика содержащая амфолитный сополимер
2128057 Композиционная мембрана, способ ее получения и способ направленной регенерации тканей с ее применением
2128055 Средство замедленного освобождения и способ его получения
2128049 Свечи
2227743 Полипептидные варианты с повышенной гепаринсвязывающей способностью
2326893 Ковалентное и нековалентное сшивание гидрофильных полимеров
2326697 Новый перевязочный материал для быстрого заживления раневой поверхности кожи
2126264 Фармацевтическое средство с гиалуроновой кислотой
2326137 Способ получения содержащих альгинат пористых формованных изделий
2325902 Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани
2225195 Репелленты против насекомых
2325193 Сосудистый стент
2325184 Улучшенные везикулы наружной мембраны бактерий
2325153 Многокомпонентная фармацевтическая дозированная форма
2325152 Удерживаемая в желудке система регулируемой доставки лекарственного средства
2029955 Способ предоперационного определения помутнения задней капсулы хрусталика при экстракции катаракты
2324688 Производные бисбензизоселеназолонила с противоопухолевым, противовоспалительным и антитромбоническим действием
2323017 Устройство и способ контролируемый доставки активных веществ в кожу
2323011 Содержащий Коллаген I и Коллаген II способный к рассасыванию внеклеточный матрикс, предназначенный для реконструирования хряща
2322955 Способ изготовления имплантанта для пластики дефектов хрящевой ткани
2322454 Антитело против CCR5
2322263 Система продолжительного высвобождения растворимого лекарственного средства
2221561 Витамин Е и его сложные эфиры
2321634 Гены участвующие в метаболизме углерода и продуцировании энергии
2321597 Биоматерьял, способ его приготовления и его применение, медицинское средство, имплантант и вкладыш
2121340 Средство для похудения
2220737 Средство для улучшения состояния опорно-двигательного аппарата
2220729 Гель используемый в стоматологии
2320720 Способ культивирования фибропластов для заместительной терапии
2320378 Накожный аппликатор
2320369 Средства, содержащие Альфа - 2 - Дельта Лиганды и ингибиторы обратного захвата серотонина/норадреналина
2320362 Местные фармацевтические средства, содержащие проантоцианидины, для лечения дерматитов
2320322 Биоадгезивная доставка лекарств
2320318 Чувствительное к температуре изменяющие состояние средство гидрогеля
2025120 Способ получения препарата, содержащего Фактор /G-CSF/, стимулирующий рост колоний гранулоцитов
2319490 Средство для введения железа при лечении синдрома беспокойных ног
25995 Содержащее адгезив приспособление для фиксации зубных протезов в полости рта
2218907 Средство для ухода за кожей лица и веками
2318830 Способ получения модифицированного дерматансульфата
2118153 Косметика - туш для ресниц
2217441 Способ получения полимера
2317296 Изетионатная соль селективного ингибитора CDK4
2217171 Мембрана для использования при направленной регенерации тканей
2317095 Экстракты ECHINACEA ANGUSTIFOLIA
2216332 Препарат для лечения астроза
2216314 Крем - маска для обезвоженной кожи
2316333 Средство оздоровительно-восстановительных косметических панто-магниевых ванн
2021304 Способ получения биологически активного средства
2115662 Способ получения гиалуроновой кислоты
2315627 Впрыскиваемые имплантанты на керамической основе для заполнения морщин, кожных впадин, шрамов
2315623 Средство получаемое путем лиофилизации препарата
2114862 Способ получения гиалуроновой кислоты
2314791 Лечебно-Косметическое средство
2314791 Косметический крем-бальзам для ухода за кожей лица и шеи
2214600 Способ оценки эффективности лечения неврологических проявлений
2114602 Способ косметической обработки
2114587 Раствор для защиты роговицы
2214283 Имплантант для подкожного или внутрикожного введения
2313370 Медицинские протезы, имеющие улучшенную биологическую совместимость
2313356 Препарат для лечения демодекоза
2313338 Средство на основе этиллинолеата и триэтилцитрата для лечения себореи и угрей
2313328 Косметика содержащая тонкодисперный и пористый порошок
2212880 Способ получения препарата содержащего антибиотик, с замедленным высвобождением активного вещества
2312640 Способ лечения Блефароконьюнктивальной формы синдрома сухого глаза
2017751 Способ получения гиалуроновой кислоты
2312145 Гены CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM, кодирующие белки, участвующие в синтезе мембран и мембранном транспорте
2311458 Белки вызывающие измененную иммуногенную реакцию. Способ их получения и использования
2311183 Улучшенное разделение с использованием гталуроновой кислоты
2311177 Ингибиторы интегрина для лечения заболевания глаз
2300069 Косметическая маска
2211024 Уход за сухой кожей
2310440 Раствор для защиты роговицы от повреждений
2309684 Лечение межфалангового остеоатроза узелковой формы
2309406 Способ мониторинга фиброза печени у больных хроническим гепатитом с (ХГС)
2209088 Опосредованная рецепторами доставка генов с использованием векторов на основе бактериофагов
2308967 Уменьшение объема ткани
2308962 Средство для опорно-дигательного аппарата
2308957 Способ получения препарата для мезотерапии
2308954 Средство для лечения ран, содержащее плазму или сыворотку крови
2308951 Комплексный способ профилактики вагинальных дисбактериозов
2308937 Косметическая биологически активная добавка и косметический литофитокомплекс на ее основе
2208638 ДНК (варианты), способ получения белка
2207885 Способ подачи небольшого объема лечебного раствора к целевому месту
2207858 Лишенные побочных эффектов производные простагландинов для лечения глаукомы
2207845 Твердая лекарственная форма пролонгированного действия
2207844 Препарат для местного неинвазивного применения
2207841 Средства с антиферментативным действием
2306335 Стволовые клетки и решетки полученные из жировой ткани
2306140 Новые рецепторы для Helicobacter pylori и их применение
2205612 Способ эндотелизации IN VITRO протезов кровеносных сосудов
2105540 Депигментирующее средство
2304960 Косметическое средство для кожи
2304616 Гены участвующие в гомеостазе и адаптации
2204550Способ получения длинноцепочечной N-Ацилированной кислотой Аминокислот
2204415 Способ получения изображения
2204394 Средство для лечения грибковых инфекций, желудочных язв
2204366 Способ хирургического лечения глаукомы
2104034 Вагинальное увлажняющие средство, способ его получения
2303991 Биологически активная добавка
2303990 БАД
2303973 Адсорбирующее изделие
2203676 Средство обладающее иммунокорригирующим действием
2203672 Способ предупреждения беременности
2303635 Гены кодирующие белки резистентности и толерантности к стрессам
2303529 Способ фиксации альгинатного геля на твердой фазе, способ получения клеточного чипа на его основе
2203078 Способ лечения гнойных ран
2302412 Гидразоно-малонитрилы
2102400 Способ получения гиалуроновой кислоты
2202356 Способ стимуляции репаративных процессов длительно незаживающих ран и трофических язв
2202336 Средство для ухода за кожей
2302231 Глазные капли
2102082 Способ магнитометрического исследования тела человека или животного
2301814 Полиакриламидный гидрогель
2201765 Гибридные матричные имплантанты и эксплантанты
2301677 Биотрансплантант для лечения дегенеративных и трвматических заболеваний хрящевой ткани и способ его получения
2301676 Способ лечения ревматизма
2301674 Способ лечения больных с переломами нижней челюсти
2301661 Средство с регулируемым освобождением и способ его получения
2005488 Средство для лечения болезней соединительной ткани
2200001 Крем для кожи

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ

Патент №2144833

(54) ХОНДРОИТИНАЗА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ВКЛЮЧАЮЩИЕ ЕЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и касается фермента хондроитиназы, применяемой в химико-фармацевтической промышленности, высокоочищенной хондроитиназы и способа получения фермента и фармацевтических композиций, содержащих фермент. Сущность изобретения включает фермент хондроитиназу АВС из клеток Proteus vulgaris с молекулярным весом 100000, изоэлектрической точкой 8,3-8,5, аланин в качестве N-концевой аминокислоты и пролин в качестве С-концевой аминокислоты. Способ получения включает экстракцию клеток указанного микроорганизма, удаление нуклеиновой кислоты, а также хроматографию с использованием сильной и слабой катионообменных смол. Очищенный фермент хондроитиназы АВС представляет собой иглообразные и призматические кристаллы с определенной структурой кристаллической решетки. Фармацевтические композиции представляют собой очищенный фермент и дополнительно неионный ПАВ, а также стабилизаторы. Технический результат заключается в повышении степени очистки и стабильности препарата. 6 с. и 14 з.п. ф-лы, 21 табл., 12 ил. Изобретение касается очищенной хондроитиназы ABC и кристаллической хондроитиназы ABC предельно высокой чистоты и превосходной стабильности, способа получения хондроитиназы ABC и кристаллов хондроитиназы ABC и фармацевтической композиции, включающей хондроитиназу в качестве эффективного компонента. Хондроитиназа ABC (EC 4.2.2.4) является ферментом, разрушающим гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат, хондроитин, дерматансульфат или подобное в смесь ненасыщенных дисахаридов и олигосахаридов. Известно, что этот фермент продуцируют такие бактерии как Proteus vulgaris. Известен способ получения хондроитиназы ABC, включающий постепенное воздействие стрептомицина на суспензию разрушенных бактериальных клеток, фракционирование сульфатом аммония, хроматографию на DEAE-целлюлозе и хроматографию на фосфоцеллюлозе (J.Biol. Chem. 243, (7), 1523-1535 (1968)), способ? включающий постепенное хроматографирование суспензии разрушенных бактериальных клеток на DEAE-целлюлозе, хроматографию на оксиапатите, хроматографию на цинк-иммобилизованной агарозе, и гель-проникающую хроматографию (Agric. Biol. Chem. 50, (4), 1057-1059 (1986); открытый патент Японии (Kokai) N 122588/1987) и подобные. С другой стороны, разработан способ разрушения межпозвоночных дисков (внутридисковая терапия: хемонуклеолиз) для лечения образования грыжи, которую считают причиной болей в пояснице человека. В этом способе в полость межпозвоночных дисков вводят химопапаин, который является производным протеазы из папайи, или производное колагеназы из бактерий для снятия припухлости дисков. Химопапаин продается в Европе и США в виде коммерческого препарата - лекарства с торговой маркой Химодиактин (Chymodiactin - лаборатории Smith) или Discase (Травенол - Travenol). Однако внутридисковая терапия, использующая указанную протеазу, разрушает не только грыжу на диске, но и протеины в окружающих тканях. Это может являться причиной побочных эффектов, таких как нейропаралич, аллергия и подобное. Mark R. Brown изучал ферменты, которые могут избирательно воздействовать на образование дисковой грыжи, и обратил свое внимание на разрушение протеогликана, являющегося основной частью диска с образованной грыжей. Результатом его исследования стали внутридисковая терапия с использованием хондроитиназы ABC или хондроитиназы AC (патент США N 4696816, A 61 K 37/48). В частности, считают, что хондроитиназа ABC, производимая Proteus vulgaris, подходит для медицинского и коммерческого применения из-за ее способности селективно убирать боковые цепи хондроитинсульфата или дерматансульфата из протеогликана, ее неактивности по отношению к кератансульфату, гепарину и гепаринсульфату и ее высокой производительности. Поэтому получают ферменты, обладающие активностью хондроитиназы ABC, описанными ранее способами из культур Proteus vulgaris. Однако эти ферментативные препараты не подходят для использования в качестве лекарства для лечения дисковой грыжи или для использования в качестве реагента высокой чистоты, так как они обладают протеазной активностью или эндотоксинной активностью и содержат нуклеиновую кислоту. Они нестабильны как ферментные белки (J. Biol. Chem. 243, (7), 1523-1535 (1968); патент Великобритании 1067253, Agris. Biol. Chem. 50, (4), 1057-1059 (1986); открытый патент Японии (Kokai) NN 122588/1987 и 57180/1990). По-видимому, причиной серьезных проблем использования хондроитиназы ABC в качестве лекарства является, главным образом, наличие примесей и нестабильность. Краткое содержание изобретения. Следовательно, предметом настоящего изобретения является обеспечение новой хондроитиназы ABC высокой чистоты и кристаллической хондроитиназы ABC, не содержащей примесей, имеющей высокую специфическую активность и превосходную стабильность, и полезной в качестве лекарства, а также способа получения хондроитиназы ABC и кристаллической хондроитиназы ABC с хорошим выходом. Другим предметом настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции, включающей хондроитиназу в качестве эффективного компонента. Для разрушения этой проблемы заявители настоящего изобретения приложили усилия по очистке хондриэтиназы ABC и обнаружили, что очищенную хондроитиназу ABC получают, применяя способ, включающий экстракцию фермента из клеток микроорганизмов, удаление нуклеиновой кислоты из экстракта, содержащего фермент, хроматографирование экстракта, комбинируя слабую катионообменную смолу с сильной катионообменной смолой, при этом из хондроитиназы ABC полностью удаляют такие примеси как эндотоксин, нуклеиновая кислота, протеаза и подобные, и препарат демонстирует одну полосу в SDS-PAGE (додецилсульфат натрия - полиакриламид-гель - электрофорез) и один пик в HPLC-жидкостной хроматографии высокого давления (CPC - гель-проникающая хроматография; катионный обмен). Обнаружено, что полученная таким образом хондроитиназа ABC кристаллизуется в кристаллическую хондроитиназу ABC, которая имеет специфическую активность в три раза больше, чем активность препаратов хондроитиназы, полученных обычным способом, сохраняет свою активность при хранении в течение длительного времени и высокоактивна в качестве лекарственного препарата. Эти полученные данные привели к завершению настоящего изобретения. В соответствии с этим предметом настоящего изобретения является обеспечение хондроитиназы ABC высокой чистоты и стабильности, характеристики которой обсуждаются здесь далее. Другим предметом настоящего изобретения является обеспечение способа получения хондроитиназы ABC высокой чистоты и стабильности, отличающегося тем, что включает:

(i) стадию получения экстракта, содержащего фермент, из клеток микроорганизма, продуцирующего хондроитиназу ABC (стадия 1),

(ii) стадию удаления нуклеиновой кислоты из эстракта, содержащего фермент (стадия 2),

(iii) стадию хроматографирования, которая включает:

а) адсорбцию хондроитиназы ABC при хроматографировании указанного экстракта, содержащего фермент, при использовании слабой катионообменной смолы, элюирование адсорбированного фермента, абсорбцию фермента в элюате и элюирование адсорбированного фермента при хроматографировании с использованием сильной катионообменной смолы (стадия 3-1) или

б) адсорбцию хондроитиназы ABC при хроматографировании указанного экстракта, содержащего фермент, с использованием сильной катионообменной смолы, элюирование адсорбированного фермента, адсорбция фермента в элюате и элюирование адсорбированного фермента при хроматографии с использованием слабой катионообменной смолы (стадия 3-2). В предпочтительном варианте настоящего изобретения указанный экстракт хондроитиназы ABC получают способом, который включает добавление буферного раствора с pH, близким к нейтральному, к увлажненным клеткам для получения суспензии клеток и физическую обработку клеток для их размельчения; или способом, который включает добавление раствора поверхностно-активного вещества с pH, близким к нейтральному, к увлажненным клеткам для получения суспензии клеток и перемешивание суспензии. Указанное двухступенчатое хроматографирование при комбинации слабой и сильной катионообменных смол после удаления нуклеиновой кислоты из экстракта клеток, содержащего хондроитиназу ABC, дает хондроитиназу ABC высокой чистоты, более чистую и более стабильную, чем обычные препараты хондроитиназы ABC, и имеющую специфическую активность, которая более чем в три раза выше активности препаратов хондроитиназы ABC, полученных обычным способом. Еще одним предметом настоящего изобретения является обеспечение кристаллической хондроитиназы ABC с иглообразными или призматическими кристалалми и характеристиками указанной очищенной хондроитиназы ABC, которую получают кристаллизацией указанной очищенной хондроитиназы ABC в полиэфире, имеющем гидроксильные группы на обоих концах (например, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль). Такая хондроитиназа ABC и ее кристаллы имеют высокую гомогенность, стабильные характеристики и высокую специфическую активность и демонтирует превосходную стабильность при хранении (например, ее активность слегка понижается при хранении в течение месяца при температуре 25-40oC). Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение композиций, содержащих хондроитиназу. В частности, настоящее изобретение обеспечивает композицию, включающую хондроитиназу и сывороточный альбумин или желатин. Настоящее изобретение обеспечивает, кроме того, композицию, включающую хондроитиназу и неионное поверхностно-активное вещество. Кроме того, предметом настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции для лечения смещения межпозвоночных дисков, включающей хондроитиназу. Для этих композиций можно использовать не только упомянутую выше очищенную хондроитиназу, но также обычную хондроитиназу ABC или хондроитиназу AC. Такие композиции включают раствор, который предотвращает абсорбцию хондроитиназы на стенках контейнера и, кроме того, предотвращает образование нерастворимых веществ при механических воздействиях, сохраняя, таким образом, высокую активность и применимость в качестве лекарства. Другие и дополнительные объекты, признаки и преимущества настоящего изобретения проявятся более полно из следующего описания. Краткое описание чертежей. Фиг. 1 представляет микроскопическую фотографию кристаллов хондроитиназы ABC настоящего изобретения. Фиг. 2 показывает соотношение между активностью и реактивным pH хондроитиназы ABC настоящего изобретения. Фиг. 3 показывает соотношение между pH и остаточной активностью хондроитиназы ABC настоящего изобретения, когда фермент оставляют стоять при 25oC в течение 24 часов в различных буферных растворах при определенном pH; на чертеже линия, соединяющая белые кружочки, показывает остаточную активность для случая хранения фермента в ацетатном буферном растворе; штриховая линия, соединяющая крестики, - хранение в буферном растворе трисуксусная кислота; штриховая линия, соединяющая треугольники, - хранение в буферном растворе трис-HCl; и линия, соединяющая черные кружочки, - глицериновый буферный раствор. Фиг. 4 показывает соотношение между остаточной активностью и реактивной температурой хондроитиназы ABC настоящего изобретения. Фиг. 5 показывает соотношение между остаточной активностью хондроитиназы ABC настоящего изобретения и температурой, когда фермент хранили при различных температурах в течение 1 часа. Фиг. 6 показывает хроматограмму, когда хондроитиназу ABC настоящего изобретения хроматогарфируют гель-проникающим методом при HPLC. Фиг. 7 показывает SDS-PAGE полосы на различных стадиях процесса для очистки хондроитиназы ABC примера 1, где полоса A соответствует супернатанту обработки протамином; полоса B соответствует жидкости обработки CM-сефарозой (CM-Sepharose); полоса C соответствует жидкости (невосстановленной) после обработки S-сефарозой; и полоса D соответствует жидкости (восстановленной) после обработки S-сефарозой. Фиг. 8 показывает соотношение между временем экстракции хондроитиназы ABC из клеток бактерий и активностью хондроитиназы ABC в примере 3. Фиг. 9 показывает соотношение между временем, необходимым для экстракции клеток бактерий с использованием буферного раствора, содержащего Triton X-100, с различной концентрацией и активностью хондроитиназы ABC в примере 4, где кривая 1 соответствует экстракции с использованием буферного раствора при концентрации поверхностно-активного вещества 2% при 25oC; кривая 2 соответствует использованию буферного раствора с концентрацией поверхностно-активного вещества 2% при 37oC; кривая 3 соответствует использованию буферного раствора с концентрацией поверхностно-активного вещества 5% при 25oC; и кривая 4 соответствует использованию буферного раствора с концентрацией поверхностно-активного вещества 5% при 37oC. Фиг. 10 показывает соотношение между временем, необходимы для экстракции клеток бактерий при использовании буферного раствора, содержащего Brij-35, с различными концентрациями и активностью хондроитиназы ABC в примере 4, где кривая 1 соответствует экстракции с использованием буферного раствора с концентрацией поверхностно-активного вещества 2% при 25oC; кривая 2 соответствует использованию буферного раствора с концентрацией поверхностно-активного вещества 2% при 37oC; кривая 3 соответствует использованию буферного раствора с концентрацией поверхностно-активного вещества 5% при 25oC; и кривая 4 соответствует использованию буферного раствора с концентрацией поверхностно-активного вещества 5% при 37oC. Фиг. 11 показывает соотношение между временем, необходимым для экстракции клеток бактерий с использованием буферного раствора, содержащего Nonidet P-40 с различными концентрациями, и активностью хондроитиназы ABC в примере 4, где кривая 1 соответствует экстракции с использованием буферного раствора с концентрацией поверхностно-активного вещества 2% при 25oC; кривая 2 соответствует использованию буферного раствора с концентрацией поверхностно-активного вещества 2% при 37oC; кривая 3 соответствует использованию буферного раствора с концентрацией поверхностно-активного вещества 5% при 25oC; и кривая 4 соответствует использованию буферного раствора с концентрацией поверхностно-активного вещества 5% при 37oC. Фиг. 12 показывает соотношение между временем, необходимым для экстракции клеток бактерий с использованием буферных растворов, содержащих POELE с различными концентрациями, и активностью хондроитиназы ABC в примере 4, где кривая 1 соответствует экстракции с использованием буферного раствора с концентрацией поверхностно-активного вещества 2% при 25oC; кривая 2 соответствует использованию буферного раствора с концентрацией поверхностно-активного вещества 2% при 37oC; кривая 3 соответствует использованию буферного раствора с концентрацией поверхностно-активного вещества 5% при 25oC; и кривая 4 соответствует использованию буферного раствора с концентрацией поверхностно-активного вещества 5% при 37oC. В деталях показан способ получения очищенной хондроитиназы ABC и кристаллов хондроитиназы ABC настоящего изобретения. Для получения хондроитиназы ABC настоящего изобретения можно использовать любые клетки обычных известных микроорганизмов, например микроорганизмов, принадлежащих к Proteus vulgaris или подобным. Отдельным примером такого микроорганизма является Proteus vulgaris NCTC 4636 (ATCC 6896, 1ГО 3988). Микроорганизмы можно культивировать обычным способом (например, J.Biol. Chem. , 243, (7), 1523-1535 (1968); открытый патент Японии (Kokai) N 122588/1987 или N 57180/1990). Увлажненные клетки собирают из культуры и суспендируют в буферном растворе с pH, близким к нейтральному, экстрагируя фермент из суспензии. Обычно в качестве буферного раствора с pH, близким к нейтральному, используют фосфатный буферный раствор, трис-HCl буферный раствор, ацетатный буферный раствор или подобные с pH от 6,0 до 8,0 и концентрацией от 1 до 100 мМ. Клетки размельчают при помощи шаровой мельницы (используют DYNO

MILL или другие) для экстракции раствора фермента, содержащего хондроитиназу ABC, протеазу, другие ферменты, нуклеиновую кислоту, белки и подобное. Эффективность экстракции хондроитиназы ABC из клеток можно увеличить, используя растворы поверхностно-активных веществ, то есть, используя буферные растворы, к которым добавлены поверхностно-активные вещества. В настоящем изобретении можно использовать любые поверхностно-активные вещества, которые эффективно стимулируют экстракцию ферментов. Неионные поверхностно-активные вещества, которые можно применять, включают алкильные эфиры полиоксиэтилена, п-трет-октилфенильные эфиры полиоксиэтилена, полисорбат и подобное. В качестве специфических примеров алкильных эфиров полиоксиэтилена приведены поверхностно-активные вещества эмульгирующего типа (Emulgen-уре), Liponox-типа, Brij-типа и подобные. Подходящими с коммерческой точки зрения являются среди них Emulgen 120, Emulgen 109P, Liponox DCH, Brij 35, 78, 76, 96, 56, 58, 98, Nikkol BL-9 EX, BL-21, BL-25 и подобные. Приведенные в качестве отдельных примеров п-трет-октилфонильные эфиры полиоксиэтилена являются поверхностно-активными веществами Triton-типа, Nonidet P-40 типа, Igepal/CA-типа, Polytergent C, Neutronyx-типа, Conco-типа и подобными. Среди них Triton X-100, X-45, X-114, X-102, X-165, X/305 X-405, Nonidet P-40, Igepal CA-630, Neutronyx 605, Conco IX-100 и подобные являются подходящими с коммерческой точки зрения. В качестве специфических примеров полисорбатов приведены поверхностно-активные вещества Tween-типа, Emasol-типа, Sorbester-типа, Crill-типа и подобные. Предпочтительными полисорбатами являются производные сорбитан-моно-9- октадеканоат-поли- (окси-1,2-этандиила) с коммерческой маркой Tween 80. Другими примерами коммерческих полисорбатов являются Tween 20, 40, 60, Emasol 4115, 4130 и подобные. Среди приведенных выше поверхностно-активных веществ особенно предпочтительными являются алкильные эфиры полиоксиэтилена (например, лауриловый эфир полиоксиэтилена, полидоканал (polidocanal), называемые здесь далее "POELE") и подобные. Применение этих поверхностно-активных веществ не только эффективно промотирует экстракцию ферментов, но также дает в результате экстракт фермента, содержащий хондроитиназу ABC с меньшим количеством протезы, сопутствующего белка и нуклеиновой кислоты по сравнению с другими способами экстракции. Экстракт фермента, полученный таким образом, хроматографируют, используя слабую катионообменную смолу или сильную катионообменную смолу, а затем можно получить хондроитиназу ABC с предельно высокой активностью, дающую одну полосу при электрофорезе. В такой хондроитиназе ABC не обнаружено протеазной активности. Содержание эндотоксина в такой хондроитиназе очень маленькое, и не возникает проблем ее использования в качестве компонента лекарственных препаратов. Для экстракции увлажненные культивированные клетки добавляют к буферному раствору, содержащему от 2 до 7% указанного поверхностно-активного вещества для получения суспензии клеток. Эту суспензию нагревают до температуры 15-45oC, предпочтительно до примерно 37oC, перемешивают в течение примерно 1-10 часов, предпочтительно около 2-6 часов, и охлаждают до комнатной температуры, отделяют экстракт от клеточного остатка такими способами разделения, как центрифугирование или подобные. Полученный таким образом экстракт, содержащий хондроитиназу ABC в качестве основного компонента, другие ферменты, белки и нуклеиновые кислоты, используют в следующей стадии очистки. На стадии очистки из экстракта клеток удаляют белки, нуклеиновые кислоты и подобное. Для удаления белков и нуклеиновых кислот применяют любые традиционные способы. Когда принимают во внимание использование фермента в качестве компонента лекарства, особо предпочтительным способом удаления нуклеиновых кислот является добавка протаминсульфата. Обработку протамином проводят, добавляя 3-7% раствор протаминсульфата к экстракту клеток до концентрации примерно 0,25 - 1%, и перемешивают смесь при температуре от примерно 4oC до комнатной в течение 10 - 30 минут, получая осадок нуклеиновых кислот и подобного. Затем осадок отделяют и удаляют при центрифугировании или др. Полученный таким образом супернатант, содержащий хондроитиназу ABC, протеазу и другие ферменты, затем хроматографируют, используя катионообменную смолу. Для получения очищенной хондроитиназы ABC очистку осуществляют хроматографическим способом, применяя комбинацию слабой катионообменной смолы и сильной катионообменной смолы. Слабой катионообменной смолой, используемой в настоящем изобретении, является катионообменная смола с карбоксиалкильными группами, например карбоксиметильной группой, в качестве обменной группы. В качестве специфического примера приведено производное полисахарида (производное агарозы, производное сшитого декстрана и др.) с карбоксиметильной группой в качестве обменной группы. Коммерческими примерами таких катионообменных смол являются CM-сефароза (CM-sepharose), CM-sephadex (торговые марки, производство Pharmacia) и подобные. Катионообменная смола с сульфоалкильной группой в качестве обменной группы представлена как сильная катионообменная смола, применяемая в настоящем изобретении. В качестве специфических примеров приведены производные полисахаридов (производное агарозы, производное сшитого декстрана и др.) с сульфоэтильной группой или подобные. Коммерческими примерами таких сильных катионообменных смол являются S-Sepharose, SP-Sepharose (торговые марки, производство Pharmacia), SP-Sephadex (торговая марка, производство Pharmacia), SP-Toyopearl (торговая марка, производство Tosoh Co.) и подобные. Далее приведен один пример хроматографического использования этих двух типов смол в комбинации. Первое хроматографирование проводят, уравновешивая слабую катионообменную смолу таким буферным раствором (pH 6,5 - 7,5), который используют в экстракции клеток (например, 1-50 мМ фосфатный буферный раствор, трис-HCl буферный раствор, ацетатный буферный раствор и др.), с последующим контактом фермента, содержащего указанное поверхностно-активное вещество, с катионообменной смолой для абсорбции фермента и промывая катионообменную смолу обычно используемым солевым раствором (например, 20-26 мМ раствором NaCl) и/или упомянутым выше раствором поверхностно-активного вещества (например, 0,5% раствором POELE). Элюат, полученный растворением хлорида натрия в указанном буферном растворе, с концентрацией примерно 0,1 М контактирует с указанной смолой, элюируя фракции, обладающие ферментной активностью. В качестве способа элюирования можно применять как градиентное элюирование, так и ступенчатое элюирование. Хроматографирование можно осуществлять колоночным способом или периодическим способом. Полученные таким образом фракции затем контактируют с сильной катионообменной смолой, которая находится в равновесии с тем же буферным раствором, для адсорбции хондроитиназы ABC. После промывания катионообменной смолы обычно применяемым солевым раствором (например, 20-50 мМ раствором NaCl) и/или водой выделяют хондроитиназу ABC путем градиентного элюирования, используя такой же буферный раствор (например, фосфатный буферный раствор, трис-HCl буферный раствор, ацетатный буферный раствор и др.), но содержащий NaCl с градиентом концентрации от 0 до 0,5 М, предпочтительно от 25 до 350 мМ. Это хроматографирование предпочтительно проводить колоночным способом. Возможно обратное применение хроматографии с использованием двух типов катионообменных смол. Затем клетки экстрагируют буферным раствором, содержащим поверхностно-активное вещество, экстракт при этом содержит только очень небольшое количество примесей. В этом случае фермент можно очистить простыми способами, например без обработки для удаления нуклеиновых кислот из экстракта (такой как обработка протамином), только пропуская экстракт через колонку со слабой катионообменной смолой (например, СМ-Sepharose), адсорбируя хондроитиназу ABC, промывая колонку и элюируя фермент градиентным способом. Раствор очищенного фермента, полученный хроматографическим способом, может служить лекарством, реагентом или подобным после концентрирования и удаления соли. По-другому, из концентрированного раствора без соли можно получить порошок при помощи обычной сушки (например, лиофилизацией) в условиях, которые не дезактивируют или денатурируют фермент. Кроме того, указанный раствор очищенного фермента можно смешать с полиэфиром, имеющим гидроксильные группы на обоих концах (например, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль и др.) для кристаллизации хондроитиназы ABС. Кристаллы имеют ромбическую или моноклинную структуру, иглообразные, параметры кристаллической решетки приведены далее в примерах. Далее приведен один пример проведения кристаллизации. К раствору фермента добавляют полиэтиленгликоль с соответствующим молекулярным весом, таким как 4000, 6000 или подобный. Раствор концентрируют до концентрации фермента 250-500 ед./мл и концентрации полиэтиленгликоля 5-20%, предпочтительно 10-15% и дают ему стоять при температуре от 4oC до комнатной до тех пор, пока не вырастут кристаллы фермента. Очищенная таким образом хондроитиназа не содержит таких примесей, как эндотоксин, нуклеиновые кислоты, протеаза, другие белки и подобное и дает одну полосу в SDS-PAGE и один пик в HPLC (GPC, катионный обмен), а также имеет специфическую активность, увеличенную более чем в три раза по сравнению с хондроитиназой ABC, полученной обычными способами. Кроме того, в соответствии со способом настоящего изобретения в ходе получения продукта не требуется проведение таких процедур, как фракционирование сульфатом аммония, концентрирование/обессоливание и подобных, как в обычных способах, следовательно, можно сократить время производства хондроитиназы ABC, увеличить выход и снизить стоимость производства. Кроме того, способ настоящего изобретения можно применять со всеми его преимуществами независимо от количества получаемой хондроитиназы. Кристаллическую хондроитиназу ABC получают упомянутым выше способом кристаллизации в виде иглообразных или призматических кристаллов (см. фиг. 1), гомогенную и со стабильными характеристиками. Она также имеет высокую специфическую активность и превосходную стабильность при хранении. Далее приведены характеристики хондроитиназы ABC, полученной способом настоящего изобретения. 1) Воздействия. Действует на гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат, хондроинит и дерматансульфат, давая небольшое количество ненасыщенного олигосахарида с большим молекулярным весом на ранней стадии реакции и, в конечном счете, смесь ненасыщенного дисахарида (

4-глюкуронил-N- ацетилгексозамина и его 4- и 6-сульфатов) и олигосахарида. 2) Оптимальный pH и стабильный pH. Оптимальным является pH от 8,0 до 8,2, когда субстратом в трис-HCl буферном растворе является хондроитинсульфат (фиг. 2). После хранения при pH от 5 до 9 и температуре 25oC в течение 24 часов фермент проявляет 80% или более остаточной активности (фиг. 3). 3) Проверка ферментативной активности. Измерение основано на производстве в ходе ферментативной реакции ненасыщенных дисахаридов, демонстрирующих значительное поглощение света в ультрафиолетовой области. В частности, ферментативную реакцию проводят в реакционном растворе фермента, содержащем фермент, 1,2 мг хондроитинсульфата C (субстрат), 50 мМ трис-HCl буферного раствора (pH 8-8,5) с 50 мМ ацетата натрия и 10

г казеина при 37oC в течение 20 минут. Реакцию прекращают, добавляя 0,05 M HCl (pH 1,8). Измеряют поглощение света при 232 нм. Отдельно выдерживают прогретый раствор денатурированного фермента (в качестве контроля) в растворе субстрата такого же состава, как описано выше, обрабатывают его таким же образом, как описано выше, и измеряют поглощение света при 232 нм. Количество ненасыщенных дисахаридов рассчитывают по увеличению поглощения света в образце по сравнению с контролем. Миллимолярный молекулярный коэффициент экстинкции 2-ацетамидо-2-деокси-3-O- (

-D-глюко-4-ен-пиранозилуроновокислой)-6-O- сульфо-D-галактозы, использованный в рассчетах, равен 5,5. В результате определено, что одна единица (U) фермента катализирует выделение в реакции 1 микромоля ненасыщенных дисахаридов за одну минуту в описанных выше условиях проведения реакции. 4) Оптимальная температура реакции и температура устойчивости. Оптимальной температурой реакции является температура 37oC. Фермент демонтирует 90% и более активности при 30 - 37oC (фиг. 4). Фермент устойчив при 2 - 30oC и дезактивируется при 50oC, когда его хранят в трис-HCl буферном растворе (pH 7,0) в течение 1 часа (фиг. 5). 5) Ингибирование. Активность ингибируют ионами цинка (Zn2+), ионами никеля (Ni2+), ионами железа (Fe3+) и ионами меди (Cu2+), как показано в таблице 1. 6) Молекулярный вес. Электрофорез с использованием додецилсульфата натрия - полиакриламидного геля (SDS-PAGE) дает одну полосу. Молекулярный вес составляет около 100000 Да в обоих состояниях, восстановленном и невосстановленном. Молекулярный вес, определенный методом гель-проникающей хроматогарфии (HPLC) составляет 100000 дальтон (см. фиг. 6 условия обсуждаются ниже). 7) Изоэлектрическая точка. Изоэлектрическая точка 8,2 и 8,5 (в Phast System используют p1-калибровочный набор 3-10 в качестве стандарта, Phast Gel IEF pH 3-9; все использованные реагенты и приборы получены в Pharmacia). 8) Аминокислотный анализ. Результаты приведены в таблице 2. Приведенный анализ проводят, гидролизуя хондроитиназу ABC в 6 М соляной кислоты при пониженном давлении и 110oC в течение 24 часов. В таблице приведены средние величины от трех исследованных образцов. Рассчеты выполнены для общего молекулярного веса 100000. Трипсин и цистеин не определяли. 9) Концевая аминокислота. N-концевым аминокислотным остатком, определенным по методу Edman (Edman degradation analysis, "Biochem. Experiments N1, Protein chemistry II, Determination of primary structure" 132-142, август 28, 1976, опубликовано Tokyo Kagaku Dojin) является аланин. Аминокислотная последовательность Ala-Thr-X-Asp-Pro-Ala-Phe-Asp-Pro-, где X - неопределенное звено. C-концевой аминокислотной последовательностью, определенной карбоксипептидазным способом ("Biochem. Experiment N1, Protein Chemistry II, Determination of primary structure", 203-211) является -Ser-Leu-Pro. Таким образом, доказано, что терминальной аминокислотной последовательностью хондроитиназы ABC настоящего изобретения является следующая: Ala-Thr-X-Asp-Pro-Ala-Phe-Asp-Pro-----Ser-Leu-Pro, где X - неопределенное звено. 10) Устойчивость при хранении. Фермент устойчив по крайней мере в течение трех месяцев при комнатной температуре как в растворе фосфатного буфера (pH 6-8), так и в сухом состоянии. 11) Специфическая активность. Содержание белка определяли методом Lowry, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта. Специфическая активность составляет по крайней мере 300 ед./мг белка. 12) Другое. Фермент дает один пик как в HPLC, так и в гель-проникающей (GPC) HPLC (катионный обмен). Условия и результаты проведения гель-проникающей хроматографии приведены далее. Условия. Колонка TKS C3000 SWXL (производство Tosoh Co.). Элюент: 0,1 М раствор фосфатного буфера (pH 7.0), содержащий 0,2 М NaCl. Скорость элюирования: 0,5 мл/минуту. Температура процесса 35oC. Длина волны при детектировании: 280 нм. Заряжаемое количество: 20

л. Вещества-метки молекулярного веса: цитохром C (12,4 кДа), аденилактиназа (32 кДа) енолаза (67 кДа), лактатдегидрогеназа (142 кДа), глутаматдегидрогеназа (290 кДа). Все ферменты произведены Oriental Yeast Manufacturing Co. Ltd. Результаты. Хондроитиназу ABC настоящего изобретения элюируют одним пиком при времени удерживания 18,43 мин (фиг. 6). Определен молекулярный вес фермента примерно 100000 дальтон на основании сравнения времени удерживания приведенных выше веществ-меток и их молекулярных весов. Препарат практически не содержит эндотоксина. Содержание ДНК и протеазы ниже пределов обнаружения, в то время как коммерческая хондроитиназа ABC (Sei kagaku Corporation N 10032 по каталогу) содержит ДНК в количестве, превышающем предел обнаружения в 5000 раз, а протеазу в количестве, превышающем предел обнаружения в 200 раз. Для сравнения хондроитиназы ABC настоящего изобретения и хондроитиназы ABC, свободной от протеазы (Seikagaku Corp. N 100332 по каталогу), которая, как известно, имеет наивысшую чистоту среди известных в настоящее время хондроитиназ, первая из двух имеет молекулярный вес около 100000 Да, определенный двумя методами SDS-PAGE и HPLC (GPC), в то время как вторая имеет молекулярный вес 80000, определенный методом SDS-PAGE, и около 120000-145000 дальтон, определенный методом гель-фильтрации. Это большая разница. К тому же, в то время как первая имеет специфическую активность 300 ед./мг белка или более, вторая имеет специфическую активность около 110 ед./мг белка. В отношении стабильности при хранении первая стабильна при комнатной температуре в течение по крайней мере трех месяцев, а вторая, как заявлено, стабильна в течение по крайней мере трех месяцев при температуре -70oC. Это также существенная разница. Кроме того, первая хондроитиназа ABC дает одну полосу в SDS-PAGE и один пик в HPLC (GPC), ее можно кристаллизовать и определить, таким образом, терминальную аминокислоту и изоэлектрическую точку, в то время как вторая не является ферментом, который можно определить как индивидуальное вещество, и, следовательно, невозможно идентифицировать ее терминальную аминокислоту и измерить изоэлектрическую точку. Теперь будут описаны композиции и лекарства настоящего изобретения. Первая иллюстративная композиция и лекарство, включающее хондроинтиназу и сывороточный альбумин или желатин. Такую композицию можно приготовить, получая водный раствор, содержащий добавки, описанные ниже, и имеющий нужный pH; смешивая этот раствор с очищенной хондроитиназой со специфической активностью, например 300 ед./мг или более, получая водный раствор, содержащий 5 ед. /мл или более (предпочтительно 10-1000 ед./мл) очищенной хондроитиназы; обычно фильтруя раствор, стерилизуя и получая жидкую композицию. Затем эту жидкую композицию можно перевести в сухую композицию, предпочтительно лиофилизированную композицию путем сушки при отсутствии нагревания (лиофилизацией или подобным образом). По-другому, жидкую композицию можно заморозить при температуре от -20oC до -80oC. Основными добавками, смешиваемыми с очищенной хондроитиназой в композициях настоящего изобретения, являются белки, такие как сывороточный альбумин или желатин. Их можно применять вместе. Для примера приводим сывороточный альбумин млекопитающих, например человека, кошки, лошади, свиньи, овцы, козы и др. Человеческий сывороточный альбумин, применимый для парентерального применения, является предпочтительным, когда композицию используют для инъекций человеку. Например, можно использовать человеческий сывороточный альбумин, полученный из плазмы здоровых людей, в качестве сырого материала, фракционировать его и очистить методом фракционирования с применением этанола (Cohn's ethanol fractionation method). Особенно предпочтительным является сывороточный альбумин, обработанный при нагревании, предпочтительно при 60oC в течение примерно 10 часов, для дезактивации вируса гепатита и подобных. HSA может содержать натрий-N-ацетилтриптофан и/или каприлат натрия, добавленные к нему в качестве стабилизаторов. В качестве примера желатина можно привести желатин, полученный из таких животных как кошки и свиньи. В частности, используемый здесь желатин получен соответствующей обработкой коллагена, выделенного из кожи, костей и др. частей животных, для придания ему растворимости. Такой желатин включает желатин, обработанный кислотой (А-тип), который обрабатывают минеральными кислотами (pH 1-3, например, соляной кислотой, серной кислотой, сернистой кислотой, фосфорной кислотой и др.) и который имеет изоэлектрическую точку 7,0-9,0; и желатин, обработанный щелочью (B-тип), который обработан щелочами (например, известью и др.) и имеет изоэлектрическую точку 4,5-5,0. Желатин, обработанный кислотой, предпочтительнее для использования в настоящем изобретении. В качестве примеров обработанного кислотой желатина приводим коммерческий продукт Nippi желатин высокого качества (тип A) и подобные. В композициях настоящего изобретения обычно регулирует pH от 5 до 9, предпочтительно от 6 до 8, если композиция является раствором. Для этой цели композиция обычно содержит буферный агент, который поддерживает величину pH в этом диапазоне. Не существует специфических ограничений по типу буферных агентов, используемых в настоящем изобретении, до тех пор, пока они пригодны физиологически. Примеры таких буферных агентов включают препараты с одним или более соединениями, выбранными из группы, состоящей из соляной кислоты, гидроокиси натрия, карбоната натрия, гидрокарбоната натрия, фосфорной кислоты, дигидрофосфата калия, гидрофосфата калия, дигидрофосфата натрия, гидрофосфата натрия, аминоуксусной кислоты, бензоата натрия, лимонной кислоты, винной кислоты, тартрата натрия, молочной кислоты, тактата натрия, этаноламина, аргинина и этилендиамина. Особенно предпочтительным является фосфатный буфер. Если pH меньше 5 или больше 9, хондроитиназа может дезактивироваться или могут образоваться нерастворимые вещества в растворе. Хотя действие хондроитиназы на белок регистрируют уже при его содержании от 0,001 доли от веса белка хондроитиназы и выше, предпочтительным количеством является 0,01 - 500-кратное количество по весу и в частности от 0,05 до 100 весовых частей. Даже если количество превышает 500-кратное весовое содержание, можно ожидать действия настоящего изобретения, но активность фермента на единицу веса уменьшена при таком большом количестве. Концентрация буферного агента в композиции составляет 1-100 мМ, предпочтительно 10-50 мМ. В дополнение к этим добавкам композиция настоящего изобретения может содержать обычно применяемые добавки к фармацевтическим композициям, такие как изотонизирующие агенты, наполнители, консерванты, успокаивающие агенты и подобные. Например, не существует ограничений наполнителей до тех пор, пока их используют обычным образом в препаратах для инъекций, предпочтительными примерами являются креатинин, лактоза, маннит, очищенная сахароза, ксилоза и подобные. Композиции настоящего изобретения обычно используют в качестве препаратов для инъекций или сырых материалов для препаратов для инъекций, содержащих хондроитиназу в качестве эффективного компонента. Композиции растворов заливают в такие емкости, как ампулы или пробирки, распространяют или хранят и используют в качестве препаратов для инъекций в том виде, в каком они есть. Можно высушивать или замораживать композиции растворов в подходящих для распространения и хранения контейнерах. Такие сухие или замороженные композиции растворяют в дистиллированной воде для инъекций, физиологическом растворе или подобном или разжижают перед употреблением. Эти препараты для инъекций можно использовать в качестве агентов, содержащих хондроитиназу, как эффективный компонент при лечении дисковой грыжи. Такой медицинский препарат можно применять в методе растворения межпозвоночных дисков, когда диск с образовавшейся грыжей растворяют, делая инъекции в межпозвоночное дисковое пространство пациента. Хотя обычно дозу нельзя точно установить и ее изменяют в зависимости от симптомов, возраста и других обстоятельств, обычным количеством является 10-300 ед.м. на дозу для случаев применения хондроитиназы ABC. К иллюстративным композициям и лекарственным препаратам настоящего изобретения, содержащим хондроитиназу и неионное поверхностно-активное вещество, нужно подмешивать к хондроитиназе в данных композициях такие добавки, как неионные поверхностно-активные вещества и буферные агенты. Предпочтительные неионные поверхностно-активные вещества, которые можно добавить, включают эфиры жирных кислот и полиоксиэтиленсорбитана (полисорбаты), соединение полиоксиэтилена и гидрированного касторового масла, эфиры жирных кислот и сахарозы, полиоксиэтиленполиоксипропиленгликоль и подобное. В качестве примером эфиров жирных кислот и полиоксиэтиленсорбитана приводим полиоксиэтиленсорбитан (степень полимеризации около 20) монолаурат, монопальмитат, моноолеат, моностеарат, триолеат и подобные. Из коммерческих продуктов назовем Polysorbate 80 (Tween 80) (полиоксиэтилен) (20) сорбитаминоолеат), Polysorbate 60 (полиоксиэтилен (20) сорбитаминомоностеарат), Polysorbate 40, Twee 21, 81, 65, 85 и подобные. В качестве примеров соединения полиоксиэтилена и гидрированного касторового масла даем коммерческие продукты HCO-10, HCO-50, HCO-60 и подобные. В качестве эфиров жирных кислот и сахарозы представляем коммерческие продукты эфир DKF-160 и подобные. Pluronic F-68 и подобные даны в качестве примеров коммерческого полиоксиэтиленполиоксипропиленгликоля. В качестве буферных агентов можно применять физиологически пригодные буферные агенты. Упомянутые буферные агенты можно применять для композиций такого типа также с фосфатным буфером, например, особенно предпочтительными являются натриевый фосфатный буферный раствор и калиевый фосфатный буферный раствор. В жидких фармацевтических композициях этого типа регулируют pH от 5 до 9, предпочтительно от 6 до 8, добавляя буферный раствор. Когда pH меньше 5 или больше 9, можно дезактивировать хондроитиназу или в растворе могут образоваться нерастворимые продукты. Что касается количество этих включенных добавок, хотя количество 0,06 весовых долей неионного поверхностно-активного вещества или более относительно количества хондроитиназы демонстрирует регистрируемый эффект, предпочтительным является количество 0,6 - 300-кратное. Концентрация буферного агента в композиции растворов составляет 1 мМ или более, предпочтительно от 10 до 50 мМ. Этот тип композиции можно преобразовать в конечный продукт после добавки упомянутых выше соединений, таких как изотонизирующие агенты, наполнители, консерванты, успокаивающие агенты и подобное. Полученные таким образом препараты можно использовать в качестве лекарственных препаратов в случае смещения межпозвоночных дисков таким же образом, как описано выше; указанные препараты могут давать растворы, которые предупреждают адсорбцию хондрооитиназы на стенках контейнеров и образование нерастворимых веществ от механических воздействий. Суммируем эффекты настоящего изобретения. Так как очищенная хондроитиназа ABC настоящего изобретения имеет очень высокую чистоту и не содержит существенного количества протеазы, нуклеиновых кислот и эндотоксина, она является предельно полезной как лекарство и реагент для использования в исследованиях и экспериментах. Так как, очищенная хондроитиназа ABC настоящего изобретения имеет превосходную стабильность при хранении, ее активность лишь слегка теряется, когда ее применяют в качестве лекарства. Ее высокая специфическая активность и минимальное содержание примесей делает возможным прием минимальной дозы и предотвращение побочных эффектов. Что касается действия очищенной хондроитиназы ABC настоящего изобретения как реагента для экспериментов и исследований, она может промотировать репродуцируемость экспериментальных результатов при ее использовании для экспериментов с клетками животных, например, потому, что фермент не содержит эндотоксина и протеазы. Кроме того, исключение в соответствии с настоящим изобретением обычно необходимых стадий фракционирования сульфатом аммония и концентрирования/обессоливания из процесса очистки дает в результате уменьшение количества стадий и сокращение времени процесса, увеличение выхода и снижение стоимости продукции. Другие характерные признаки изобретения будут видны из следующего описания типичных вариантов, которые приведены для иллюстрации изобретения, но не ограничивают его. Пример 1. Proteus vulgaris (NCTC 4636, ATCC 6896, 1ГО 3988) культивируют обычным способом (J. Biol. Chem. 243, (7), 1523-1535 (1968)) для получения культивированных увлажненных клеток. К 200 г клеток добавляют 60 мл 5 мМ фосфатного буферного раствора (pH 6,5-7,0), получая суспензию. Клетки размельчают, используя DYNO

MILL, и центрифугируют, получая раствор экстракта, содержащий фермент (стадия 1). Для удаления нуклеиновой кислоты из раствора экстракта клеток применяют протаминсульфат. 5%-ный водный раствор протаминсульфата добавляют к указанному раствору экстракта, содержащему фермент, до концентрации 0,5%. Смесь перемешивают при 4oC в течение 30 мин и образовавшийся осадок удаляют центрифугированием, получая таким образом супернатант (стадия 2). После добавки 5-кратного (по объему) количества воды супернатант очищают методом колоночной хроматографии. Конкретно, колонку, заполненную CM-Sepharose, уравновешивают 5 мМ раствором фосфатного буфера (pH 6,5-7,0), затем в колонку заливают супернатант для абсорбции фермента. Колонку промывают тем же буферным раствором, потом тем же буферным раствором, содержащим 0,025 M NaCl, и потом элюируют тем же буферным раствором, содержащим 0,1 M NaCl, получая проявление активности фермента по фракциям (стадия 3). После добавки примерно 5-кратного (по объему) количества воды фракции с ферментативной активностью абсорбируют при движении на колонке с S-Sepharose, уравновешенной 5 мМ раствором фосфатного буфера (pH 6,5-7,0). Колонку промывают тем же буферным раствором, содержащим 0,025 M NaCl, затем проводят градиентное элюирование тем же буферным раствором, содержащим линейный градиент концентрации от 0,025 до 0,35 M NaCl, получая проявление ферментативной активности по фракциям. Элюированный раствор хондроитиназы ABC дает одну полосу (SDS-PAGE) в отсутствие нуклеиновой кислоты (ДНК), протеазы и др. и имеет специфическую активность 380 ед./мг, которая примерно в три раза выше специфической активности хондроитиназы ABC, полученной обычным способом. Таким образом, получают хондроитиназу ABC, фермент высокой чистоты. К раствору фермента (фосфатный буферный раствор, pH 7,0) добавляют полиэтиленгликоль (молекулярный вес 4000) таким образом, чтобы получить концентрацию 15%, и смесь оставляют стоять при комнатной температуре примерно в течение одной недели, получая белые или бесцветные иглообразные или призматические кристаллы хондроитиназы ABC. Микрофотография (увеличение: 2,5) кристаллов приведена на фиг. 1. Кристаллы имеют ромбическое или моноклинное строение, иглообразные с параметрами кристаллической решетки, определенными методом рентгеноструктурного анализа (см. таблицу 2a). Результаты SDS-PAGE на каждой стадии очистки приведены на фиг. 7. SDS-PAGE анализ проводят в соответствии с обычным методом (Laemmli U.K., Nature 227, 680-685 (1970)), применяя 10% гель. Видим одну чистую полосу в обоих случаях, для невосстановленного и восстановленного состояний, когда фермент обработан S-Sepharose (см. фиг. 7; C и D). Степень очистки хондроитиназы ABC на каждой стадии процесса настоящего изобретения показана в таблице 3. Содержание эндотоксина и остаточные количества протеазы приведены в таблице 4. В растворе фермента, полученном на стадии 4, не содержится существенного количества эндотоксина. Имеются только его следы; 5,0 пг/100 ед., как показано в таблице 4. Также в результате определения нуклеиновых кислот (ДНК) пороговым методом (прибор для определения ДНК, Threshold 0 торговая марка, производство Molecular Device Co.) не обнаружено ДНК, то есть содержание ДНК ниже порога чувствительности. Таблица 5 показывает стабильность хондроитиназы ABC, полученной на 4 стадии настоящего изобретения, когда раствор фермента хранят при разных температурах. В таблице приведена стабильность, выраженная % активности относительно активности препарата при -40oC (100%); раствор с активностью 380 ед./мл хранили в течение 5 дней. Пример 2. 7,5 кг увлажненных клеток Proteus vulgaris (NCTC 4636, АТСС 6896, 1ГО 3988), используемых в примере 1, загружают в резервуар, содержащий около 15 л 40 мМ раствора фосфатного буфера (pH 7,0

0,5), к которому добавляют 10% лаурилового эфира полиоксиэтилена (POELE; Nikkol BL-9EX) и около 7,5 л очищенной воды. Смесь перемешивают, получая суспензию клеток, которую нагревают при 35 + 3oC и перемешивают около двух часов при этой температуре. Примерно через два часа добавляют около 30 л 20 мМ раствора фосфатного буфера (pH 7,0

0,5), разбавляя суспензию. Затем суспензию охлаждают до 20oC. Суспензию центрифугируют на менее быстрой центрифуге, получая супернатант. Температуру раствора поддерживают ниже 20oC до и после центрифугирования. Полученный таким образом суспернатант разбавляют, добавляя около 30 л очищенной воды, охлажденной до 2 - 15oC, и пропускают через колонку с СМ-Sepharose (количество геля: около 5 л) для адсорбции хондроитиназы ABC на колонке. Колонку промывают 1 л очищенной воды, 10 л 0,5% водного раствора POELE и 5 л 0,04 М раствора фосфатного буфера (pH 6,2

0,2). Затем проводят градиентное элюирование 20 л 0,04 М раствора фосфатного буфера (pH 6,2

0,2), содержащего градиент концентраций от 0 до 0,25 М NaCl, получая проявление активности хондроитиназы ABC по стадиям. Элюат пропускают через стерилизующий фильтр с размером пор 0,22

м и собирают в стерилизованный контейнер, получая, таким образом, раствор хондроитиназы ABC. Соотношение между временем экстракции клеток (час) и активностью фермента показано в таблице 6. Концентрация фермента уравновешивается в течение 1 - 2 часов после начала экстракции клеток. Общее количество нуклеиновой кислоты в экстракте достигает максимального значения (около 25 г) через 0,25 часа после начала перемешивания, затем уменьшается и уравновешивается (около 2-3 г) примерно через один час. Пример 3. 5 г увлажненных клеток Proteus vulgaris (NCTC 4636, АТСС 6896, 1ГО 3988), используемых в примере 1, загружают в 5-кратный объем 20 мМ раствора фосфатного буфера (pH 7,0), к которому добавляют 5% POELE, и экстрагируют в течение 3 часов при 37oC. Экстракт обрабатывают протамином, хроматографируют на СМ-Sepharose и S-Sepharose таким же образом, как в примере 1 (условия разделения представлены в таблице 7), и проводят градиентное элюирование, получая хондроитиназу ABC. Раствор дает одну полосу хондроитиназы ABC в SDS-PAGE. Раствор пропускают через стерилизующий фильтр с размерами пор 0,22

,м, закачивая помпой, и собирают в стерилизованный контейнер, получая, таким образом, раствор хондроитиназы ABC. Данные расчетов, приведенные в таблице 7, показывают экстракцию хондроитиназы ABC около 500 ед. на 1 г клеток. Степень очистки на каждой стадии примера 3 приведена в таблице 7. Соотношение между временем, необходимым для выделения хондроитиназы ABC их клеток, и активностью хондроитиназы ABC показано на фиг. 4. Пример 4. Таким же способом, как описано в примере 3, готовят суспензию, применяя POELE, и добавляют Triton X-100, Brij-35, Nonidet P-40, получая концентрацию 2-5%. Экстракцию хондроитиназы проводят при 25-37oC. Результаты, представленные на фиг. 9 - 12, показывают, что в случаях, когда экстракцию проводят при 37oC и используют концентрацию поверхностно-активного вещества 5%, получают экстракты с большей активностью и чистотой, которые устанавливаются в течение 2 - 4 часов. Пример 5. Эффект предотвращения адгезии к стеклянным и пластиковым контейнерам (растворы). Растворы композиции хондроитиназы ABC получают из 5 ед. хондроитиназы ABC, полученной в примере 1 (специфическая активность 300 ед./мг), очищенного желатина (желатин, обработанный кислотой), человеческого сывороточного альбумина (HSA) или бычьего сывороточного альбумина (BSA), каждый в количестве 0,001 - 100-кратном от содержания белка фермента, как показано в таблицах 8 и 9. pH доводят до 7,0, добавляя 50 мМ раствор калийфосфатного буфера. Эти растворы загружают в стеклянные или пластиковые (полипропилен) пробирки и хранят в течение 24 часов при 4oC, затем измеряют активность фермента в растворе для определения эффекта предотвращения адгезии к контейнерам. Результаты, выраженные % активности в растворах после хранения (по сравнению с величиной до хранения), приведены в таблице 8 (стеклянные пробирки) и таблице 9 (пластиковые пробирки). Пример 6. Эффект предотвращения образования нерастворимых веществ и эффект сохранения активности при перестройке (лиофилизированные композиции). Растворы композиции хондроитиназы ABC, полученные из 50 ед. хондроитиназы ABC (специфическая активность: 380 ед./мг), и материалы, указанные в таблицах 10 и 11, каждый в количестве 0,001 - 10-кратном по отношению к количеству белка фермента, как показано в таблицах 10 и 11. pH доводят до 6,5, добавляя 20 мМ раствор натрий-фосфатного буфера. После добавки креатинина (10 мг/мл) в качестве наполнителя, растворы заливают в пробирки и высушивают при замораживании, получая сухую композицию хондроитиназы ABC. Композицию хранят в пробирках при 40oC в течение одного месяца, наблюдая их свойства и не находя аномальностей, таких как изменение цвета, деформации и подобное. Для наблюдения их свойств при перестройке системы добавляют воду для инъекций и определяют активность для проверки эффекта сохранения активности в присутствии добавок. Результаты представлены в таблицах 10 и 11. Таблица 10 показывает результаты наблюдения невооруженным глазом присутствия или отсутствия нерастворимых материалов при изменении состава композиции, а таблица 11 показывает активность после хранения, выраженную в процентах от активности до хранения. Аналогичным образом, как описано выше, готовят композиции (хондроитиназа ABC: 50 ед., специфическая активность: 380 ед./мг; HSA: 0,05-кратное количество от количества белка), к которой добавляют креатинин, для наблюдения свойств и определения активности после хранения. Установлено, что раствор бесцветный и чистый, а остаточная активность составляет 80%. Приведенные выше экспериментальные результаты показывают, что добавка желатина, HSA или BSA к очищенной хондроитиназе и доведение pH раствора до значения, близкого к нейтральному, предотвращают адгезию очищенной хондроитиназы к контейнерам, делают раствор бесцветным и прозрачным после растворения и сохраняют активность фермента без понижения в течение хранения. Эти эффекты особенно значительны, когда желатин, HSA или BSA используют в количестве 0,05 - 10-кратном содержанию белка в очищенной хондроитиназе. В этом случае особо предпочтительной композицией хондроитиназы ABC является такая, которую готовят, используя хондроитиназу ABC высокой чистоты, имеющую специфическую активность, вместе с желатином, HSA или BSA и раствором натрий-фосфатного буфера с pH 5 - 9 (предпочтительно 6 - 8), в котором они растворены, для получения раствора (10 - 50 мМ раствор натрий-фосфатного буфера), который затем лиофилизуют. Желательно, чтобы лиофилизованная композиция при растворении обеспечивала раствор с указанным выше значением pH. Пример 7. Эффект предотвращения адгезии к стеклянным контейнерам. Хондроитиназу ABC растворяют в 0,1 М водном растворе NaCl. К раствору добавляют Polysorbate 80 в количестве 0,075 - 75-кратном относительно количестве белка фермента (1,33 г или 13,3 г), затем добавляют раствор фосфатного буфера, доводя pH до 6,9. Этим раствором заполняют стеклянные ампулы, получая фармацевтические композиции. Ампулы хранят при 20oC в течение 20 часов, определяя затем их титр и проверяя наличие эффекта предотвращения адгезии к контейнерам. Результаты представлены в таблице 12. Пример 8. Эффект предотвращения образования нерастворимых веществ при встряхивании. Хондроитиназу ABC (40 ед.) растворяют в 0,1 М водном растворе NaCl. К раствору добавляют Polysorbate 80 в количестве 0,0075 - 7,5-кратном по отношению к содержанию белка фермента (133

г), как показано в таблице 13, затем добавляют фосфатный буфер, доводя pH до 6,9. Этот раствор заливают в стеклянные ампулы. Ампулы встряхивают, используя инкубатор для встряхивания, с частотой 160 раз в минуту в течение 8 часов, наблюдая присутствие или отсутствие появления нерастворимых материалов. Результаты представлены в таблице 13. Пример 9. Эффект предотвращения образования нерастворимых веществ при вибрациях в процессе транпортировки. Хондроитиназу ABC (5 ед. ) растворяют в 0,1 М водном растворе NaCl. К раствору добавляют Polysorbate 80 в количестве 0,06 - 6,0-кратном относительно белка фермента (16,7

г), затем доводят pH до 6,9, добавляя раствор фосфатного буфера. Этим раствором заполняют стеклянные ампулы. Ампулы транспортируют в грузовом автомобиле при температуре ниже 25oC в течение 7 дней, наблюдая присутствие или отсутствие образовавшихся нерастворимых материалов. Результаты приведены в таблице 14. Пример 10. Эффект предотвращения образования нерастворимых материалов при вибрациях в процессе транспортировки. Хондроитиназу ABC (50 ед.) растворяют в 0,1 М водном растворе NaCl. К раствору добавляют Polysorbate 80 в количестве 0,006 - 0,60-кратном по отношению к количеству белка фермента (167 мкг), затем доводят pH до 6,9, добавляя раствор фосфатного буфера. Этим раствором заполняют стеклянные ампулы. Ампулы транспортируют в грузовом автомобиле при температуре ниже 25oC в течение 7 дней, наблюдая присутствие или отсутствие образовавшихся нерастворимых материалов. Результаты приведены в таблице 15. Пример 11. Эффект предотвращения образования нерастворимых материалов при вибрациях в процессе транспортировки. Хондроитиназу ABC (140 ед.) растворяют в 0,1 М водном растворе NaCl. К раствору добавляют Polysorbate 80 в количестве 32-кратном относительно количества белка фермента (467

г), затем доводят pH до 6,9, добавляя раствор фосфатного буфера. Этим раствором заполняют стеклянные ампулы. Ампулы транспортируют в грузовике при температуре ниже 11,7oC в течение 19 дней, наблюдая присутствие или отсутствие образовавшихся нерастворимых материалов. Затем определяют титр, рассчитывают остаточную степень активности. Результаты приведены в таблицах 20 и 21. Пример 14. Хондроитиназу ABC (30 ед.) растворяют в 0,1 М водном растворе NaCl. К раствору добавляют Pluronic P68 в количестве 15-кратном от количества фермента (100

г), затем доводят pH до 7, добавляя раствор фосфатного буфера. Этим раствором заполняют стеклянные ампулы, получая фармацевтическую композицию. Хондроитиназу ABC (80 ед.) растворяют в 0,1 М водном растворе NaCl. К раствору добавляют HCO-60 в количестве 15-кратном от количества фермента (267 мкг ), затем доводят pH до 7, добавляя раствор фосфатного буфера. Этим раствором заполняют ампулы, получая фармацевтическую композицию. Хондроитиназу ABC (30 ед.) растворяют в 0,1 М водном растворе NaCl. К раствору добавляют Polysorbate 80 в количестве 15-кратном от количества фермента (100

г), затем доводят pH до 7, добавляя раствор фосфатного буфера. Этим раствором заполняют стеклянные ампулы, получая фармацевтическую композицию. Хондроитиназу ABC (60 ед.) растворяют в 0,1 М водном растворе NaCl. К раствору добавляют Polysorbate 80 и Pluronic P68, каждый в количестве 7,5-кратном от количества фермента (200

г), затем доводят pH до 7, добавляя раствор фосфатного буфера. Этим раствором заполняют стеклянные ампулы, получая фармацевтическую композицию. Хондроитиназу ABC (50 ед.) растворяют в 0,1 М водном растворе NaCl. К раствору добавляют HCO-60 и К-эфир P-160, каждый в количестве 7,5-кратном от количества фермента (167

г), затем доводят pH до 7, добавляя раствор фосфатного буфера. Этим раствором заполняют стеклянные ампулы, получая фармацевтическую композицию. В свете приведенного выше описания очевидно, что возможны многочисленные модификации и вариации настоящего изобретения. Следовательно, должно быть ясно, что в рамках приложенной формулы изобретения его можно осуществить способом, отличным от описанных здесь конкретных способов.

Формула изобретения

1. Очищенный фермент хондроитиназа АВС клеток Proteus vulgaris, отличающийся тем, что он имеет следующие характеристики: молекулярный вес около 100000 при определении методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS - PAGE) в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях и методом гель-проникающей хроматографии, изоэлектрическую точку около pH 8,2 и 8,5, оптимальный pH в области от 8,0 до 8,2 (субстрат:хондроитинсульфат C, буферный раствор:трис-HCl буферный раствор) и оптимальную реакционную температуру 37oC, активность, ингибируемую Zn2+, Ni2+, Fe3+, Cu2+, аланин в качестве N-концевой аминокислоты и пролин в качестве C-концевой аминокислоты, одну полосу в SDS - PAGE и один пик в HPLC-жидкостной хроматографии при высоком давлении (GPC : гель проникающая хроматография) или катионообменный HPLC. 2. Способ получения очищенного фермента хондроитиназы АВС из клеток Proteus vulgaris, отличающийся тем, что получают экстракт, содержащий фермент, путем экстракции клеток указанного микроорганизма, удаляют нуклеиновую кислоту из экстракта, содержащего фермент, и проводят хроматографию, включающую адсорбцию содержащего фермент экстракта на слабой катионообменной смоле и элюирование адсорбированного фермента, а также адсорбцию элюата и элюирование адсорбированного фермента с использованием сильной катионообменной смолы. 3. Способ получения очищенного фермента, хондроитиназы АВС из клеток Proteus vulgaris, отличающийся тем, что получают экстракт, содержащий фермент, путем экстракции клеток указанного микроорганизма, удаляют нуклеиновую кислоту из экстракта, содержащего фермент, и проводят хроматографию, включающую адсорбцию содержащего фермент экстракта на сильной катионообменной смоле и элюирование адсорбированного фермента, а также адсорбцию элюата и элюирование адсорбированного фермента с использованием слабой катионообменной смолы. 4. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что используют слабую катионообменную смолу с обменной карбоксиалкильной группой и сильную катионообменную смолу с обменной сульфоалкильной группой. 5. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что включает стадию хроматографирования экстракта, содержащего фермент, с использованием слабой или сильной катионообменной смолы для адсорбции на ней хондроитиназы АВС, и дополнительную стадию элюирования хондроитиназы АВС, адсорбированной на этой смоле при непрерывном изменении ионной силы элюента. 6. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что экстракцию осуществляют путем распыления клеток Proteus vulgaris. 7. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что экстракцию проводят с применением раствора поверхностно-активного вещества. 8. Очищенный фермент хондроитиназы АВС из клеток Proteus vulgaris, отличающийся тем, что он представляет собой иглообразные или призматические кристаллы, имеющие ромбическую или моноклинную структуру со следующими параметрами кристаллической решетки:

Ромбическая система:

пространственная группа: P2221;

параметры кристаллической решетки:

a = 214

; b = 92

; c = 56

;

90o;

90o. Моноклинная система:

пространственная группа: P21;

параметры кристаллической решетки:

a = 214

; b = 56

; c = 92

;

= 90o;

= 90o. 9. Хондроитиназа по п.8, отличающаяся тем, что она получена кристаллизацией в полиэфире с гидроксильными группами на обоих концах. 10. Фармацевтическая композиция для лечения межпозвоночного смещения, отличающаяся тем, что включает хондроитиназу АВС и дополнительно один компонент, выбираемый из группы, состоящей из а) неионного ПАВ в количестве, (0,6 - 300)-кратном по весу; в) сывороточного альбумина; с) желатина и d) смеси сывороточного альбумина и желатина, причем альбумин и/или желатин присутствуют в количестве, составляющем по крайней мере 0,001 от содержания хондроитиназы. 11. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что присутствует в виде раствора с pH 5 - 9. 12. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что хондроитиназа АВС является очищенным продуктом со специфической активностью 300 ед./мг или более. 13. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что хондроитиназа АВС является очищенным продуктом со специфической активностью 300 ед./мг, по существу не содержащим эндотоксина, а содержание нуклеиновой кислоты и протеазы ниже предела обнаружения. 14. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что представляет собой жидкость, раствор или высушенный продукт. 15. Композиция по п. 11, отличающаяся тем, что дополнительно включает физиологически приемлемый буферирующий агент в количестве 1 - 100 мМ, а pH композиции отрегулирован таким образом, что составляет величину 5 - 9. 16. Композиция по п.15, отличающаяся тем, что буферирующий агент включает одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из соляной кислоты, гидроокиси натрия, карбоната натрия, гидрокарбоната натрия, фосфорной кислоты, дигидрофосфата калия, дикалийгидрофосфата, дигидрофосфата натрия, динатрийгидрофосфата, аминоуксусной кислоты, бензоата натрия, лимонной кислоты, цитрата натрия, уксусной кислоты, ацетата натрия, винной кислоты, тартрата натрия, молочной кислоты, лактата натрия, этаноламина, аргинина и этилендиамина. 17. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что неионное поверхностно-активное вещество представляет собой эфир жирной кислоты полиоксиэтиленсорбитана. 18. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что хондроитиназа АВС имеет специфическую активность 300 ед./мг или более и композиция, будучи раствором, дополнительно включает 10 - 50 мМ фосфатного буферирующего агента для доведения pH раствора до величины 6 - 8. 19. Композиция по п. 10, отличающаяся тем, что находится в форме для инъекций. 20. Фармацевтическая композиция для лечения межпозвоночного смещения, отличающаяся тем, что включает стерильный раствор, содержащий в качестве активного ингредиента хондроитиназу АВС в смеси с сывороточным альбумином, желатином или неионным поверхностно-активным веществом и стерильную воду без консервантов для применения в инъекциях. Приоритет по пунктам:

26.06.92 - по пп.1 - 6, 8 - 9;

26.10.92 - по пп.11 - 17, 19 - 20;

25.06.93 - по пп.10 и 18.