СПИСОК ПАТЕНТОВ С УПОМИНАНИЕМ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ
-
- 2017751 Способ получения гиалурона
- 2192150 БАД для профилактики йодной недостаточности
- 2112542 Препарат для лечения патологий соединительных тканей
- 2225206 Препарат для лечения рака молочной железы
- 2299733 Лечение опорно-двигательного аппарата
- 2299732 Способ лечения глаукомы
- 2299726 Противоинфекционная губная помада
- 2299725 Косметическое средство для ухода за кожей
- 2198878 Ароматическое соединение
- 2198702 Способ подготовки трофических язв к аутодермапластике
- 2198653 Вагинальные суппозитории
- 2197946 Композиция для ухода за волосами
- 2197923 Фармацевтическая композиция для лечения отеков роговицы
- 2298410 Биотрансплантант и способ лечения ревматических и аутоиммунных заболеваний
- 2197501 Фотоотверженный гель на основе сшитой гиалуроновой кислоты
- 2197228 Твердые лекарственные формы
- 2197222 Водная компазиция для ухода за волосами, лица и тела
- 2297425 Полипептиды
- 2297240 Композиция с гиалуроновой кислотой
- 2297230 Фармацевтическая компазиция с ксантоновой смолой
- 2196588 Глазные капли
- 2195955 Применение биологически активных веществ
- 2195926 Дерматологические композиции
- 2295954 Микрочастицы для доставки нуклеиновых кислот
- 2295951 Косметика для ухода за кожей лица и век
- 2195262 Фармакологическое средство на основе гиалуроновой кислоты
- 2194512 Способ профилактики и коррекции процесса старения кожи
- 2194478 Лечение экземы
- 2294716 Расширяемый стент
- 2194055 Сшитые сополимеры
- 2099350 Ассоциаты депротонированной гиалуроновой кислоты
- 2293557 Средство для лечения кожи и слизистых
- 2292878 Приготовление микроцастиц, содержащих метопропол
- 2292746 БАД
- 2192256 Защита кишечника
- 2191782 Получение модифицированной гиалуроновой кислоты
- 2292219 Паратиреоидный гормон человека
- 2291686 Микроцастицы
- 2191000 Косметическая маска
- 2290921 Фармацевтические и косметические средства против старения кожи
- 2290900 Модифицированный биоматериал для использования в офтальмологии
- 2290899 Получение биоматерьяла
- 2290397 Новые инданилиденовые соединения
- 2290186 Лечение сирингомиелии
- 2288702 Иррингационный раствор для офтальмологии
- 2288699 Гель для лечения стоматологических заболеваний
- 2188011 Активирующая остеогенез фармацевтическая композиция
- 2187327 Средство с антисептиком
- 2187325 Средство с радиопротекторным действием
- 2287330 Композиции миноксидила
- 2186786 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2186593 Лечение раненого процесса кожи
- 2286801 Очищение воды
- 2286781 Лечение ожогов пищевода у детей
- 2286764 Средство лечения воспалений полости рта
- 2185840 Лечение инфекционных заболеваний
- 2286151 Альфа-2-Дельта-Лиганда
- 2185149 Ранозаживляющий гель
- 2285527 Лечение ИЛ-6 заболеваний
- 2184448 Раствор хранения роговицы, включающий гиалуроновую кислоту
- 2090179 Крем для кожи
- 2183961 Способ лечения кожи
- 2284331 Соли алифотических аминов
- 2284187 Производные амида
- 2089191 Снизить внутрение давление
- 2283320 Получение гликозаминогликанов
- 2283129 Лечение опухолей
- 2283098 Косметические средства с Q
- 2182574 Ароматические соединения
- 2088257 Средство с гипохолестеролемическим действием
- 2088218 Состав для гигиенических салфеток
- 2088206 Способ получения препарата, создающего исскуственный загар
- 2282462 Противомикробные средства
- 2182008 Интровагинальная компазиция
- 2181999 Препарат с отсроченным высвобождением
- 2181998 Новые композиции липидов
- 2181995 Лечение болевого синдрома
- 2181295 Вирионная вакцина
- 2087144 Витамин Е
- 2379336 Способ стирки
- 2379052 Вакцинация
- 2180855Композиция в виде ионного комплекса
- 2379025 Противоинфекционный гель
- 2180825 Лечение травм роговицы
- 2281082 Способ коррекции эстетических и возрастных проблем кожи
- 2180576 Биоактивная добавка для косметических средств
- 2280459 Средство для изменения скорости роста или репродукции клеток
- 2179981 Соли переходного металла
- 2378010 Жидкие вакцины
- 2378008 Комбинированные вакцины
- 2378007 Анаболическое средство
- 2377973 Растительные экстракты
- 2280041 Способ получения водорастворимых комплексов гиалурил
- 2280038 Биополимеры
- 2323733 Йодный обмен
- 2377260 Гель
- 2178693 Противовирусное средство на основе гиалуроновой кислоты
- 2178692 Облегчающие зуд косметическое средство
- 2377022 Гемостатические спреи
- 2376982 Увлажняющая сыворотка для лица
- 2376974 Трансдермальный гель для лица
- 2362784 Гипо-и гиперацетилированные менингокковые капсульные сахариды
- 2177789 Устройство для доставки лекарства к шейке матки
- 2277954 Крем для лица омолаживающий
- 2376378 Способ получения метионина
- 2177332 Биоматериал для предотвращения послеоперационных спаек, с производной гиалуроновой кислотой
- 2177310 Способ получения таблеток
- 2376011 Средство для позвоночника
- 2277410 Косметическое средство
- 2323748 Медицинская повязка
- 2276998 Гидрогелевые композиции
- 2082416 Способ получения препарата с коллагенном из животного сырья
- 2375081 Адсорбирующее изделие
- 2375049 Охлаждающий пластырь
- 2346049 Способ получения гиалурона
- 2275913 Фармацевтические средства
- 2174985 Полисахарид с антиоксидантом
- 2373957 Носитель для лекарственных средств и биологически активных веществ
- 2373941 Способ коррекции возрастных и патологических изменений кожных покров
- 2174845 Композиции и способы доставки генетического материала
- 2174830 Средство для укрепления волос
- 2373769 Синбиотическая композиция
- 2274472 Лечение апорно-двигательного аппарата и болевых синдромов
- 2372929 Профилактическая композиция на основе веществ фенольной природы в липосомной форме
- 2173563 Способ нанесения на поверхность предметов покрытия на основе гиалуроновой кислоты, её производных и полусинтетических полимеров
- 2079304 фармацевтическая композиция, обладающая иммуносупрессорной и антимикробной активностью
- 2273645 Полипептид ожирения
- 2173154 Фракция кератансульфатолигосахаридов и содержащий ее фармацевтический препарат
- 2173136 Грязная мазь
- 2173128 Способ хирургического лечения центральных разрывов сечатки
- 2078561 Косметическое средство предотвращающее старение кожи
- 2172490 Способ прогнозирования воспалительных заболеваний молочной железы при эндопластике
- 2272645 Способ лечения ЦМВ-Инфекции у детей раннего возроста
- 2272636 Фармацевтическая композиция для местного лечения воспаления
- 2272635 Фармацевтически активная субстанция для офтальмологии
- 2272599 Биоматерьял для стабилизации прогрессирующей миопии "Коллаплант"
- 2172168 Средство для заживления ран на основе гиалуроновой кислоты
- 2371172 Фармацевтическая композиция для лечения нервной системы на основе стефаглабрина
- 2171470 Способ прогнозирования послеоперационной трансформации доброкачественных опухолей нервной системы
- 2077317 Состав для ванн
- 2271213 Комбинированные композиции, содержащие экстракты из растений и морских животных
- 2076872 Способ получения окрашенной гиалуроновой кислоты
- 2076671 Раствор для защиты роговицы
- 2370281 Конъюгаты гидроксиалкилкрахмал
- 2370275 Способ лечения (коррекции) косметических и возрастных дефектов кожи
- 2370258 Фармацевтическая композиция для парентальной доставки в форме лиофилизата
- 2270023 Способ экстракции и очистки протеогликана хрящего типа (варианты)
- 2369408 Гемостатическая композиция, включающая гиалуроновую кислоту
- 2369387 Фармацевтическая композиция для лечения нервной системы
- 2369379 Нетаблитированные жевательные формы для индивидуального введения
- 2169136 Производное коричной кислоты
- 70792 Медицинский аппликатор
- 20741717 Способ стабилизации аскорбиновой кислоты
- 2074712 Способ получения препарата, препятствующего преждевременной эякуляции
- 2367954 Способ прогнозирования развития кожной патологии у женщин с синдромом склерополикистозных яичников (СПКЯ)
- 2268075 Устройство для электрокинетической доставки
- 2268052 Средство для лечения воспалительных и дегенеративных заболеваний суставов
- 2167649 Способ получения твердой дисперсии умеренного водорастворимого лекарственного вещества
- 2167647 Гель для бритья
- 2073520 Лечение урологических инфекций
- 2367476 Биопластический материал
- 2367475 Мембрана для использования при направленной регенерации тканей
- 2367469 Фармацевтическая композиция на основе лизоамидазы
- 2367456 Фармацевтическая композиция обладающая антибактериальным и некролитическим действием
- 2367455 Фармацевтическая композиция обладающая некролитическим и антибактериальным действием
- 2267324 Применение антиадгезивных углеводов, препарат для уменьшения и /или блокирования адгезии патогенных веществ
- 2166934 Композиции включающие биологический агент
- 2166510 Псевдодипептиды
- 2366460 Композиции, имеющие высокую противовирусную и антибактериальную активность
- 2360901 Производные феноксиуксусной кислоты
- 2165749 Способ восстановления эндотелия роговицы
- 2265441 Способ укрепления склеры
- 2365382 Композиции и способы для регуляции развития сосудов
- 2070879 Соли гликозаминогликанов
- 2164914 Циклические и гетероциклические N - замещенные - иминогидроксамовые карбоновые кислоты
- 2264627 Хламидийный конъюктивит
- 2364399 Фармацевтический препарат на основе стефаглабрина
- 2264230 Препарат с замедленным высвобождением активного вещества
- 2363497 Фармацевтические композиции
- 2363496 Способ увеличения объема мягких тканей
- 2363473 Способ антифлогистической активации в эксперементе
- 2363461 Фармацевтический препарат на основе сигетина
- 2363459 Средства для введения в роговицу глаз для предотвращения офтальмологических нарушений
- 2363448 Фармацевтические композиции
- 2163123 Глазные капли
- 2162687 Усовершенствованнная лекарственная форма индуктора интерферана
- 2162343 Биосовместимый полимерный материал и способ его получения
- 2162327 Лечение рака
- 2067841 Способ получения ароматизатора
- 2161478 Способ консервированого лечения гонартроза
- 2361617 Вольфрамовые частицы в качестве рентгеноконтрастных веществ
- 2361552 Способы и устройства для дренирования жидкостей и понижения внутриглазного давления
- 2066996 Способ изготовления пленочного материала для офтальмохирургии
- 2361417 Корм с глюкозамином и экстрактом ивы для профилактики артроза у животных
- 2161002 Пищевой общеукрепляющий лечебно-профилактический продукт из хрящевой ткани акул
- 2360928 Комплексная матрица для медико-биологического применения
- 2160574 Способ лечения глаукомы
- 2360688 Способ лечения повреждений переферических нервов
- 2360670 Фармацевтическая композиция при климактерических расстройствах
- 2360646 Эндолюминальный протез
- 2260445 Способ усовершенствования транспортировки через легко прспосабливаемый полупроницаемый барьер
- 2260007 Производные амида
- 2359975 Способ получения модифицированных арабиногалактанов
- 2359974 Антигенные Пептиды
- 2159775 Псевдопептидный продукт
- 2259833 Фармацевтическая композиция для лечения роговицы глаза
- 2259816 Ранозаживляющее средство
- 2259815 Способ коррекции возрастных изменений, связанных с процессами старения кожи
- 2359706 Способ сохранения офтальмологических растворов
- 2359704 Антисептическое средство
- 2359662 Микрокапсулы
- 2159253 Катионные полимеры
- 2159111 Средство для ухода за кожей лица
- 2159105 Композиция для защиты кожи от опасных химических веществ Получение
- 2158593 Биосовместимый водный раствор
- 2358728 Способ лечения и предупреждения потери костной ткани
- 2258517 Способ хирургического лечения травмотических повреждений селезенки пленкой на основе гиалуроновой кислоты
- 2357968 Кристалические формы производной имидазола
- 2357957 Ингибиторы P38 и их применение
- 2157647 Пищевая добавка и ее получение
- 2357758 Препараты для чрескожной и чересслизистой добавки
- 2063244 Способ стабилизации растворов
- 2063140 Способ получения препарата для консервирования мяса
- 2157381 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2257198 Композиции микроцастиц
- 2356909 Белковый комплекс
- 2356570 Косметическая композиция
- 2256434 Способ закрытия перфорации барабанной перепонки
- 2356520 Способ лечения постконтузионного повреждения сечатки глаза
- 2156133 Гель
- 2255945 Полимерная композиция
- 2355761 Средства повторной дифференцировки
- 2061043 Способ повышения устойчивости урокиназы к нагреванию
- 2061005 Способ получения красителей для гистологических исследований
- 2355420 Зубная паста
- 2355385 Композиции пролонгированного действия с контролируемым высвобождением
- 2355240 Способ получения пищевого препарата хондропротекторного действия
- 2155057 Пихтово репейный бальзам
- 2354409 Способ производства высвобождающих лекарственные средчтва медицинских устройств
- 2254145 Раневое покрытие на основе коллаген-хитозанового комплекса
- 2254133 Лечение и профилактика ВИЧ-инфекции у человека
- 2253439 Фармацевтическая композиция для защиты и улучшения оптических свойств роговици при проведении эндовитреальных вмешательств
- 2253437 Способ омоложения кожи
- 2153352 Фармацевтическая композиция обладающая ранозаживляющим и противовоспалительным действием
- 2353354 Фармацевтический препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2252787 Способ получения искусственной матрицы кожи
- 2252767 Способ нормализации иммунобиохимического гомеостаза коров в предродовом и послеродовом периодах
- 2352583 Фармацевтическая композиция содержащая Fc-область иммуноглобулина в качестве носителя
- 2152403 Модифицированные полисахариды
- 2352356 Иммуногенная композиция
- 2352342 Исскусственный физиологический солевый раствор Способ его получения
- 2352330 Фармацевтический препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2352323 Фармацевтический препарат с модифицированным высвобождением
- 2152027 Способ подготовки ткани мозга для определения гликозаминогликанов
- 2251842 Интектицидный состав для борьбы с личинками оводов
- 2151580 Способ активации пролиферации эндотелия роговицы
- 2351648 Дифференцировка стромальных клеток, полученных из жировой ткани, в эндокринные клетки поджелудочной железы и их использование
- 2351595 N - гидроксиформамидные соединения в качестве ингибиторов металлопротеина
- 2251411 Косметическое средство в лиофилизированной фармацевтической форме
- 2251405 Косметика...ее композиции для косметических препаратов
- 2251367 Средство со сшитой гиалуроновой кислотой для наращивания тканей
- 2351359 Косметика для профилактики и лечения избыточной массы тела
- 2351322 Препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2351153 Диета при остеортрите собак
- 2350958 Способ определения групповой принадлежности синовальной жидкости
- 2350625 Производные гиалуроновой кислоты с пониженной биодеградируемостью
- 2150266 Крем после бритья
- 2350354 Фармацевтическое средство содержащие антагонист и фактор некроза
- 2350340 Способ коррекции процессов регенерации
- 2350309 Способ лечения избыточной массы тела с помощью рефлексотерапии
- 2250047 Профилактический продукт из хрящевой ткани гидробионтов
- 2249467 Медицинский матерьял и изделия на его основе
- 2055079 Способ получения препарата гиалуроновой кислоты
- 2349599 Биоадгезив мидии
- 2054903 Способ лечения коллагеноза у бычков на откорме
- 2249210 Способ прогнозирования предрасположенности к развитию и тяжести течения деформирующего остеоартроза коленного сустава у взрослых
- 2349339 Средство для соединительной ткани
- 2148988 Человеческий интерферона
- 2148399 Лечение атеросклероза
- 2148396 Способ определения активного вещества в дифильных мазевых основах
- 2148375 Способ диагностики близорукости
- 2348415 Способ противоспаечной терапии после хирургического вмешательства
- 2348400 Препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2348386 Способ непроникающего хирургического лечения первичной открытоугольной глаукомы
- 2248213 Лечение Галактозидальной А недостаточности
- 2347586 Микрофлюидизированные эмульсии типа "масло в воде" и вакцинные средства
- 2147243 Контрастное средство
- 2146526 Лечебный препарат дисбактериоза и урогенитальных инфекций
- 2146148 Терапевтическое применение фактора роста кератиноцитов (ФРК)
- 2146139 Способ повышения активности макрофагов и комбинации для его осуществления
- 2346277 Способ диагностики специфического синовита
- 2345793 Ультразвуковые контрастные вещества и их получение
- 2345782 Терапевтические комбинации на основе PORIFERA для лечения и предотвращения кожных заболеваний
- 2245131 Способ коррекции косметических недостатков кожи
- 2245130 Способ активации восстановительных процессов в коже
- 2144833 Хондроитиназа
- 2344809 Получение твердых дозированных форм с использованием сшитого нетермопластичного носителя
- 2244540 Косметический гель для ухода за кожей лица
- 2244536 Способ лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний тазобедренного сустава
- 2344167 Хмелевый экстракт
- 2143884 Агент регулирования дифференциации клеток кожи, культурная среда для клеток или тканей и способ регулирования дифференциации клеток кожи
- 2343932 Способ получения обладающих пониженной растворимостью в воде пленночных материалов
- 2343903 Устройство доставки лекарств для контролируемого введения препаратов
- 2048817 Способ получения материала для лечения ожогов и гнойно - некронических ран
- 2048803 Гидратантный крем
- 2242974 Средства и способы лечения воспалительных заболнваний
- 2142816 Способ получения антигерпетической вакцины
- 2342923 Средство для обработки рук с увлажняющим эффектом
- 2142781 Косметика для макияжа ресниц и бровей и агент ингирирующий рост микроорганизмов в косметических средствах
- 2242251 Трансплантируемые стенты с биоактивными покрытиями
- 2142257 Способ обработки глазных имплантантов и контакных линз
- 2342389 Мононатриевая соль
- 2342107 Способ устранения западения верхнего века при анофтальме
- 2141828 Средство, пролонгирующее эффективность чесночного порошка
- 2241489 Косметическое средство матриксных протеинов для залечивания ран
- 2241443 Средство для лечения герпеса
- 2241414 Способ получения протезов кровеносных сосудов
- 2341539 Гидрогель
- 2141324 Регулятор скорости воздействия препарата для инъекций
- 2141312 Косметическое средство для ухода за кожей лица
- 2341296 Средства и способы покрытия медицинских имплантантов
- 2341272 Средство для неспецифической иммунотерапии
- 2341266 Стенты с нанесенным покрытием содержащим N - (5-(4-(4-
- 2341257 Иммуномодулирующее средство
- 2341255 Средство для лечения климактерических расстройств
- 2240821 Способ лечения урологических инфекций
- 2140786 Способ лечения лишая
- 2140243 Способ хирургического лечения диабетической ретинопатии и отслоек сечатной оболочки
- 2240140 Медицинская многослойная повязка и изделия на ее основе
- 2240135 Культура клеток, содержащая клетки - предшественники остеонегеза, имплантант на ее основе и его использование для восстановления целостности кости
- 2240123 Экзогенные биологически активные коньюгирующие вещества
- 2139886 Фотоотвержаемое производное гликозаминогликата, сшитое производное гликозаминогликата и способы их получения, способ предотвращения клеточной и тканевой адгезии
- 2139729 Вакцина. Способ стимулирования иммунной системы
- 2339386 Средство обладающее радио - и химиозащитным действием
- 2339369 Лечение офтальмологических нарушений с использованием мочевины и ее производных
- 2139041 Гидратантный регенерирующий крем и способ его получения
- 2139039 Косметический суперкрем для ухода за кожей
- 2139017 Способ получения боисовместимого материала
- 2138503 Производные камптотецина, способы их получения, уникальное средство
- 2338556 Средство содержащие антагонист Р2Х - рецептора и нестероидное противоспалительное лекарственное средство
- 2338514 Косметическое средство для профилактики старения кожи
- 2138297 Медицинские устройства, подверженные вызываемому разложению
- 2138295 Покрытие для ран
- 2337906 Ингибиторы цитозольной фосфолипазы А2 Применение физиологически допустимого корпускулярного ферримагнитного или ферромагнитного материала. Способ формирования магнитометрического изображения
- 2137501 Устройство формирования изображения
- 2137477 Способ лечения заболеваний характеризующихся аутоиммунной агрессией
- 2137467 Крем для кожи лица и тела
- 2137449 Способ коррекции дефектов преломления в глазу млекопитающего
- 2137402 Пищевая Добавка БАД
- 2336899 Способ стимуляции миелопоэза
- 2336862 Способ получения раствора для лечения роговицы
- 2336830 Способ восстановления костных структур челюсти
- 2136696 Новый полипептид и средство против ВИЧ - Инфекции
- 2336092 Биоадгезивное средство, по существу свободное от воды
- 2336089 Средство и способ лечения заболеваний периодонтальных и пульпы
- 2336074 Средства и способы лечения заднего сегмента глаза
- 2235548 Ранозаживляющее средство
- 2135186 Способ лечения рефлекторных синдромов при остеохондрозе
- 2234945 Стабилизатор водного раствора и водосодержащего сырья
- 2334762 Растворимая ассоциативная карбоксиметилцеллюлоза
- 2234514 Макропористые хитозановые гранулы и способ их получения. Способ культивирования клеток
- 2133615 Средство для лечения неврологических заболеваний
- 2233164 Способ профилактики развития послеоперационных спаек брюшной полости
- 2133127 Неткатный материал, способ его получения и способ лечения
- 2333223 Альдегидные производные сиаловой кислоты и средства на их основе
- 2333007 Полипептидные вакцины для широкой защиты против рядов поколений менингококов с повышенной вирулентностью
- 2332985 Дозированные формы анестезирующих средств с длительным высвобождением для обезболивания
- 2132677 Косметическая маска
- 38603 Пленочный аппликатор
- 2232594 Средство содержащие ингибирующие остеокластогенез фактор и полисахарид
- 2332238 Средство для прокладок, раневых повязок и других изделий, контактирующих с кожей
- 2331668 Стромальные клетки, получение из жировой ткани, для заживления дефектов роговицы и внутриглазных дефектов и их использование
- 2331438 Альфа - 2 - Дельта Лигант для лечения симптомов нижних мочевыводящих путей
- 2331411Электропряденые аморфные фармоцевтические средства
- 2331367 Способ профилактики образования спаек и их рецидива
- 2130767 Масло в воде для получения косметических и дерматологических средств, способ косметической обработки
- 2230752 Поперечносшитые гиалуроновые кислоты и их применение в медицине
- 2230558 Способ восстановления и сохранения здоровья скмьи
- 2230550 Средства длительного высвобождения, способ их получения и применения
- 2230458 Поддержания здоровья суставов
- 2330290 Способ определения состояния метаболических процессов в ткани суставного хряща
- 2230073 Способ поперечного сшивания карбоксилированных полисахаридов
- 2329059 Способ лечения полипозного риносинусита
- 2329037 Комбинированная терапия для лечения иммуновоспалительных заболеваний
- 2128666 Гиалуроновая кислота и ее соли, способ очистки гиалуроновой кислоты, способ получения гиалуроновой кислоты. Фармацевтический препарат с гиалуроновой кислотой и средства с гиалуроновой кислотой используемые в офтальмологии
- 2328740 Способ экспресс - оценки действия зубных паст
- 2128502 Косметический гель
- 2328272 Суппозитории индуктора интерферона
- 2328268 Косметика содержащая амфолитный сополимер
- 2128057 Композиционная мембрана, способ ее получения и способ направленной регенерации тканей с ее применением
- 2128055 Средство замедленного освобождения и способ его получения
- 2128049 Свечи
- 2227743 Полипептидные варианты с повышенной гепаринсвязывающей способностью
- 2326893 Ковалентное и нековалентное сшивание гидрофильных полимеров
- 2326697 Новый перевязочный материал для быстрого заживления раневой поверхности кожи
- 2126264 Фармацевтическое средство с гиалуроновой кислотой
- 2326137 Способ получения содержащих альгинат пористых формованных изделий
- 2325902 Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани
- 2225195 Репелленты против насекомых
- 2325193 Сосудистый стент
- 2325184 Улучшенные везикулы наружной мембраны бактерий
- 2325153 Многокомпонентная фармацевтическая дозированная форма
- 2325152 Удерживаемая в желудке система регулируемой доставки лекарственного средства
- 2029955 Способ предоперационного определения помутнения задней капсулы хрусталика при экстракции катаракты
- 2324688 Производные бисбензизоселеназолонила с противоопухолевым, противовоспалительным и антитромбоническим действием
- 2323017 Устройство и способ контролируемый доставки активных веществ в кожу
- 2323011 Содержащий Коллаген I и Коллаген II способный к рассасыванию внеклеточный матрикс, предназначенный для реконструирования хряща
- 2322955 Способ изготовления имплантанта для пластики дефектов хрящевой ткани
- 2322454 Антитело против CCR5
- 2322263 Система продолжительного высвобождения растворимого лекарственного средства
- 2221561 Витамин Е и его сложные эфиры
- 2321634 Гены участвующие в метаболизме углерода и продуцировании энергии
- 2321597 Биоматерьял, способ его приготовления и его применение, медицинское средство, имплантант и вкладыш
- 2121340 Средство для похудения
- 2220737 Средство для улучшения состояния опорно-двигательного аппарата
- 2220729 Гель используемый в стоматологии
- 2320720 Способ культивирования фибропластов для заместительной терапии
- 2320378 Накожный аппликатор
- 2320369 Средства, содержащие Альфа - 2 - Дельта Лиганды и ингибиторы обратного захвата серотонина/норадреналина
- 2320362 Местные фармацевтические средства, содержащие проантоцианидины, для лечения дерматитов
- 2320322 Биоадгезивная доставка лекарств
- 2320318 Чувствительное к температуре изменяющие состояние средство гидрогеля
- 2025120 Способ получения препарата, содержащего Фактор /G-CSF/, стимулирующий рост колоний гранулоцитов
- 2319490 Средство для введения железа при лечении синдрома беспокойных ног
- 25995 Содержащее адгезив приспособление для фиксации зубных протезов в полости рта
- 2218907 Средство для ухода за кожей лица и веками
- 2318830 Способ получения модифицированного дерматансульфата
- 2118153 Косметика - туш для ресниц
- 2217441 Способ получения полимера
- 2317296 Изетионатная соль селективного ингибитора CDK4
- 2217171 Мембрана для использования при направленной регенерации тканей
- 2317095 Экстракты ECHINACEA ANGUSTIFOLIA
- 2216332 Препарат для лечения астроза
- 2216314 Крем - маска для обезвоженной кожи
- 2316333 Средство оздоровительно-восстановительных косметических панто-магниевых ванн
- 2021304 Способ получения биологически активного средства
- 2115662 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2315627 Впрыскиваемые имплантанты на керамической основе для заполнения морщин, кожных впадин, шрамов
- 2315623 Средство получаемое путем лиофилизации препарата
- 2114862 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2314791 Лечебно-Косметическое средство
- 2314791 Косметический крем-бальзам для ухода за кожей лица и шеи
- 2214600 Способ оценки эффективности лечения неврологических проявлений
- 2114602 Способ косметической обработки
- 2114587 Раствор для защиты роговицы
- 2214283 Имплантант для подкожного или внутрикожного введения
- 2313370 Медицинские протезы, имеющие улучшенную биологическую совместимость
- 2313356 Препарат для лечения демодекоза
- 2313338 Средство на основе этиллинолеата и триэтилцитрата для лечения себореи и угрей
- 2313328 Косметика содержащая тонкодисперный и пористый порошок
- 2212880 Способ получения препарата содержащего антибиотик, с замедленным высвобождением активного вещества
- 2312640 Способ лечения Блефароконьюнктивальной формы синдрома сухого глаза
- 2017751 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2312145 Гены CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM, кодирующие белки, участвующие в синтезе мембран и мембранном транспорте
- 2311458 Белки вызывающие измененную иммуногенную реакцию. Способ их получения и использования
- 2311183 Улучшенное разделение с использованием гталуроновой кислоты
- 2311177 Ингибиторы интегрина для лечения заболевания глаз
- 2300069 Косметическая маска
- 2211024 Уход за сухой кожей
- 2310440 Раствор для защиты роговицы от повреждений
- 2309684 Лечение межфалангового остеоатроза узелковой формы
- 2309406 Способ мониторинга фиброза печени у больных хроническим гепатитом с (ХГС)
- 2209088 Опосредованная рецепторами доставка генов с использованием векторов на основе бактериофагов
- 2308967 Уменьшение объема ткани
- 2308962 Средство для опорно-дигательного аппарата
- 2308957 Способ получения препарата для мезотерапии
- 2308954 Средство для лечения ран, содержащее плазму или сыворотку крови
- 2308951 Комплексный способ профилактики вагинальных дисбактериозов
- 2308937 Косметическая биологически активная добавка и косметический литофитокомплекс на ее основе
- 2208638 ДНК (варианты), способ получения белка
- 2207885 Способ подачи небольшого объема лечебного раствора к целевому месту
- 2207858 Лишенные побочных эффектов производные простагландинов для лечения глаукомы
- 2207845 Твердая лекарственная форма пролонгированного действия
- 2207844 Препарат для местного неинвазивного применения
- 2207841 Средства с антиферментативным действием
- 2306335 Стволовые клетки и решетки полученные из жировой ткани
- 2306140 Новые рецепторы для Helicobacter pylori и их применение
- 2205612 Способ эндотелизации IN VITRO протезов кровеносных сосудов
- 2105540 Депигментирующее средство
- 2304960 Косметическое средство для кожи
- 2304616 Гены участвующие в гомеостазе и адаптации
- 2204550Способ получения длинноцепочечной N-Ацилированной кислотой Аминокислот
- 2204415 Способ получения изображения
- 2204394 Средство для лечения грибковых инфекций, желудочных язв
- 2204366 Способ хирургического лечения глаукомы
- 2104034 Вагинальное увлажняющие средство, способ его получения
- 2303991 Биологически активная добавка
- 2303990 БАД
- 2303973 Адсорбирующее изделие
- 2203676 Средство обладающее иммунокорригирующим действием
- 2203672 Способ предупреждения беременности
- 2303635 Гены кодирующие белки резистентности и толерантности к стрессам
- 2303529 Способ фиксации альгинатного геля на твердой фазе, способ получения клеточного чипа на его основе
- 2203078 Способ лечения гнойных ран
- 2302412 Гидразоно-малонитрилы
- 2102400 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2202356 Способ стимуляции репаративных процессов длительно незаживающих ран и трофических язв
- 2202336 Средство для ухода за кожей
- 2302231 Глазные капли
- 2102082 Способ магнитометрического исследования тела человека или животного
- 2301814 Полиакриламидный гидрогель
- 2201765 Гибридные матричные имплантанты и эксплантанты
- 2301677 Биотрансплантант для лечения дегенеративных и трвматических заболеваний хрящевой ткани и способ его получения
- 2301676 Способ лечения ревматизма
- 2301674 Способ лечения больных с переломами нижней челюсти
- 2301661 Средство с регулируемым освобождением и способ его получения
- 2005488 Средство для лечения болезней соединительной ткани
- 2200001 Крем для кожи
|
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
|
Патент №2208638 |
(54) ДНК (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА, БЕЛОК, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ
(57) Реферат:
Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в медицине. Определены ДНК-последовательности, кодирующие новые белки TGF-бета семейства, МР-52 и МР-121. В результате трансформации клеток организма-хозяина вектором экспрессии, содержащим фрагмент ДНК с последовательностью, кодирующей МР-52, получен активный полипептидный продукт, обладающий способностью индуцировать рост костной и хрящевой тканей. Изобретение обеспечивает использование нового TGF-бета подобного белка (МР-52) в качестве активного начала в фармкомпозициях, предназначенных для лечения или профилактики повреждения костной и хрящевой тканей. 5 с. и 2 з.п. ф-лы, 9 ил. Изобретение касается последовательностей ДНК, кодирующих новые факторы роста/дифференциации семейства TGF- , в частности новых последовательностей ДНК, кодирующих TGF- подобные белки, выделения этих последовательностей ДНК, содержащих эти ДНК экспрессирующих плазмид, способа получения TGF--подобного белка путем культивирования трансформанта и фармацевтических композиций, содержащих этот белок. Семейство TGF- факторов роста, содержащее BMP, TGF и родственные ингибину белки (Roberts и Sporn, Handbook of Experimental Pharmacology, 95 (1990), 419-472) имеет особенное значение в широком диапазоне способов консервативного лечения и использования в медицине. Эти факторы применимы в способах, касающихся заживления ран и репарации тканей. Некоторые члены TGF-семейства являются индукторами тканеобразования, в частности индукторами костеобразования, и играют решающую роль в индуцировании роста хрящевой и костной тканей. Wozey (Progress in Growth Factor Research I (1989), 267-280) и Vale с сотр. (Handbook of Experimental Pharmacology, 95 (1990), 211-248) описывают различные факторы роста, например, относящиеся к группе BMP (костных морфогенетических белков) и группе ингибина. Члены этих групп обладают значительным структурным сходством. Предшественник такого белка состоит из аминоконцевой сигнальной последовательности, пропептида и карбоксиконцевой последовательности приблизительно из 110 аминокислот, которая впоследствии отщепляется от предшественника и представляет собой зрелый белок. Wozey упоминал также, что случае N-концевого фрагмента расщепление происходит по схеме RXXR, зрелый белок расщепляется по сайту REKR. Из публикации Roberts и Sporn (Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990)) известно, что белки TGF-B1, TGF-B2, TGF-B3, TGF-B4 и TGF-B5 расщепляются по сайтам RHRR, RKKR, RKKR, RRRR, RKKR соответственно. Таким образом, отщепление зрелой формы происходит всегда по типичной схеме по расположению сайтов RXXR. Кроме того, члены этих групп имеют определенную гомологию аминокислотной последовательности. Зрелый белок содержит наиболее консервативные последовательности, в частности семь остатков цистеина, которые сохраняются среди членов TGF--семейства. TGF--подобные белки представляют собой многофункциональные гормонально активные факторы роста. Все они обладают также родственными биологическими активностями, такими как хемотактическое аттрагирование клеток, ускорение клеточной дифференциации и способность индуцирования тканеобразования, например индуцирования образования хрящевой и костной тканей. Патент США 5013649 описывает последовательности ДНК, кодирующие белки, индуцирующие костеобразование, названные белками ВМР-2 (костными морфогенетическими белками), а заявки США с номерами сер. 179101 и 179197 описывают белки BMP-1 и BMP-3, Более того, многие типы клеток способны синтезировать TGF--подобные белки и, в сущности, все клетки имеют TGF- рецепторы. При общем рассмотрении эти белки обнаруживают различия в их структуре, приводящие к значительному варьированию в их отдельных биологических функциях. Кроме того, они были обнаружены в широком разнообразии различных тканей и стадий развития. Следовательно, они могут иметь различия, касающиеся их отдельных функций, например, таких как требуемая клеточная физиологическая среда, продолжительность жизни, их мишени, потребность в дополнительных факторах и их устойчивость к деградации. Таким образом, хотя описаны многочисленные белки, проявляющие тканеиндуктивный, в частности остеоиндуктивный потенциал, их природная роль в организме и, что более важно, возможность их применения в медицине требуют еще подробного объяснения. Существуют сильные основания, чтобы предполагать наличие неизвестных пока членов семейства ТGF-, имеющих значение для костеобразования или дифференциации/индукции других тканей. Однако главной проблемой при выделении этих новых ТGF--подобных белков является то, что их функции до настоящего времени не могут быть описаны достаточно точно для создания дискриминирующего биотеста. С другой стороны, ожидаемая гомология нуклеотидной последовательности для известных членов семейства могла бы быть слишком низкой для возможности скрининга при помощи классических способов гибридизации нуклеиновых кислот. Тем не менее, дальнейшее выделение и характеристика новых ТGF--подобных белков является настоятельной необходимостью для того, чтобы держать в руках все множество белков индукции и дифференциации, удовлетворяющих все желательные требования медицины. Эти факторы могут найти полезное применение в медицине в заживлении дефектов и лечении дегенеративных нарушений костных и (или) других тканей, например тканей почек и печени. Таким образом, технической проблемой, лежащей в основе данного изобретения, является в основном обеспечение последовательностей ДНК, кодирующих новые члены семейства белков ТGF-, имеющих митогенный и (или) индуцирующий дифференциацию, например индуцирующий костеобразование, потенциал. Решение этой технической проблемы достигнуто обеспечением вариантов (воплощений изобретения), охарактеризованных в пунктах формулы изобретения 1-17. Другие особенности и преимущества данного изобретения будут видны из описания предпочтительных вариантов и чертежей. Далее будут даны краткие описания последовательностей и чертежей. SЕQ ID 1 (последовательность с идентификационным номером 1) изображает нуклеотидную последовательность МР-52, т.е. полученную из эмбриона последовательность, соответствующую зрелому пептиду, и большую часть последовательности, кодирующей пропептид МР-52. Часть последовательности пропептида у 5I-конца MР-52 пока еще не охарактеризована. SEQ ID 2 изображает охарактеризованную до сих пор нуклеотидную последовательность полученной из печени последовательности MP-121. SEQ ID 3 изображает аминокислотную последовательность МР-52, выведенную из SEQ ID 1. Фиг. 1 изображает сопоставление (сравнительный анализ) аминокислотных последовательностей MР-52 и MР-121 с некоторыми родственными белками. 1а показывает сопоставление MР-52 с некоторыми членами семейства белков BMP, начиная с первого из семи остатков цистеина;
1b показывает сопоставление MР-121 с некоторыми членами семейства белков Ингибина. * указывает, что данная аминокислота является одинаковой во всех сравниваемых белках;
+ указывает, что данная аминокислота одна и та же по меньшей мере в одном из белков, сравниваемых с МР-52 (фиг.1а) или с MP-121 (фиг.1b). Фиг. 2 изображает нуклеотидные последовательности олигонуклеотидного праймера (затравки), применяемого в данном изобретении, и сопоставление этих последовательностей с известными членами семейства TGF-.
М обозначает А или Ц;
S обозначает Ц или Г;
R обозначает A или Г. К обозначает Г или Т. 2а изображает последовательность праймера OD;
2b изображает последовательность праймера OID. Фиг.3-9 - экспрессия и биологическая активность МР-52. Данное изобретение касается новых TGF--подобных белков и обеспечивает последовательности ДНК, содержащиеся в соответствующих генах. В таких последовательностях находятся нуклеотидные последовательности, содержащие последовательность
AТGAACTCCATGGACCCCGAGTCCACA и
CTTCTCAAGGCCAACACAGCTGCAGGCACC
и, в частности, последовательности, представленные в SEQ ID 1 и 2, аллельные производные этих последовательностей и последовательности, вырожденные как результат вырожденности генетического кода для этих последовательностей. В таких последовательностях могут также находиться последовательности ДНК, гибридизующиеся в строгих условиях гибридизации с описанными выше последовательностями ДНК и соответствующие следующим аминокислотным последовательностям:
Met-Asn-Ser-Met-Asp-Prp-Glu-Ser-Тhr или
Leu-Leu-Lys-Ala-Asn-Thr-Ala-Ala-Gly-Thr. Хотя эти аллельные, вырожденные и гибридизующиеся последовательности могут иметь структурные отклонения, обусловленные природными мутациями, такие как небольшие делеции или замены, обычно они проявляют, в основном, те же самые полезные свойства, что позволяет применять их, в основном, в тех же самых способах применения в медицине. Согласно данному изобретению, термин "гибридизация" обозначает обычные условия гибридизации, предпочтительно условия с концентрацией солей 6хSSC при 62-66oC с последующим промыванием в течение одного часа при помощи 0,6хSSC, 0,1% SDS при 62-66oС (SSC - раствор хлорида и цитрата натрия, SDS - додецилсульфат натрия). Термин "гибридизация" предпочтительно относится к строгим условиям гибридизации с концентрацией солей 4хSSC при 62-66oC с последующим промыванием в течение одного часа при помощи 0,1хSSС, 0,1% SDS при 62-66oС. Важными биологическими активностями кодируемых белков являются митогенный потенциал и остеоиндуктивный потенциал, которые могут быть определены в тестах согласно Roberts et al., РNAS 78 (1981). 5339-5343, Sеуеdin et al., PNAS 82 (1985), 2267-2271 или Sampath and Reddi, PNAS 78 (1981), 7599-7603. Предпочтительными воплощениями (вариантами) данного изобретения являются последовательности ДНК, описанные выше и полученные из позвоночных, предпочтительно из млекопитающих, таких как свиньи или коровы, и из грызунов, таких как крысы или мыши, и, в частности, из приматов, таких как человек. Особенно предпочтительными вариантами данного изобретения являются последовательности ДНК, обозначаемые МР-52 и MP-121, которые представлены в SEQ ID 1 и 2. Соответствующие транскрипты МР-52 были получены из эмбриогенной ткани и кодировали белок, обнаруживающий значительную аминокислотную гомологию со зрелой частью BMP-подобных белков (см. фиг.1а). Последовательности белков ВМР-2 (=ВМР2А) и ВМР-4 (=ВМР2В) описаны в Wozney et аl., Science Vol. 242, 1528-1534 (1988). Соответственные последовательности ВМР5, ВМР6 и BMP7 описаны в Celeste et al. , Рroс. Nat1. Acad. Sсi. USA Vol. 87, 9843-9847 (1990). Некоторые типичные гомологии последовательности, которые специфичны только для известных последовательностей BMP, также были обнаружены в пропептидной части MP-52 тогда, как другие части участка предшественника MP-52 обнаруживают заметные различия при сравнении с предшественниками BMP. В ткани печени была обнаружена мРНК MP-121 и соответствующая ей аминокислотная последовательность обнаруживает гомологию с аминокислотными последовательностями белковых цепей Ингибина (см. фиг.1b). Последовательности кДНК, кодирующие TGF--подобные белки, пока не были выделены из ткани печени, возможно вследствие низкого количества специфических для TGF- транскриптов в этой ткани. Однако в эмбриогенной ткани последовательности, кодирующие известные TGF--подобные белки, могут быть обнаружены в относительном изобилии. Заявители недавно также обнаружили присутствие в печени скопления TGF--подобных белков. Высокий фоновый уровень клонов, относящихся к известным факторам этой группы, представляет собой главную трудность в установлении новых родственных TGF- последовательностей в этих и, возможно, других тканях. В данном изобретении клонирование проводили по способу, описанному ниже. Как только последовательность ДНК была клонирована, получение клеток хозяина, способных продуцировать TGF--подобные белки, и получение этих белков можно было легко завершить при помощи известных способов рекомбинантных ДНК, предусматривающих конструирование экспрессирующих плазмид, кодирующих такой белок, и трансформацию клетки хозяина этой экспрессирующей плазмидой, культивирование трансформанта в подходящей кулътуральной среде и извлечение продукта с TGF--подобной активностью. Таким образом, данное изобретение касается также рекомбинантных молекул, содержащих описанные выше последовательности ДНК, иногда соединенные с последовательностью регуляции транскрипции. Такие векторы можно применять в получении TGF--подобных белков в стабильно или временно трансформированных клетках. Некоторые животные, растительные, грибковые и бактериальные системы можно применять для трансформации и последующего культивирования. Предпочтительно, чтобы экспрессирующие векторы, которые можно использовать в данном изобретении, содержали последовательности, необходимые для репликации в клетке хозяина, и были автономно реллицируемыми. Также предпочтительно применение векторов, содержащих селектируемые маркерные гены, которые могут быть легко отобраны для трансформированных клеток. Необходимая для этого операция хорошо известна работающим в этой области. Другим объектом данного изобретения является обеспечение клетки хозяина, трансформированной экспрессирующей плазмидой данного изобретения и способной продуцировать белок семейства TGF- Примерами подходящих клеток хозяина являются различные эукариотические и прокариотические клетки, такие как Е. coli, клетки насекомых, клетки растений, клетки млекопитающих и грибы, например дрожжи. Следующим объектом данного изобретения является обеспечение белка семейства TGF-, кодируемого описанными выше последовательностями ДНК и обнаруживающего такие биологические особенности, как способность индуцирования тканеобразования, в частности костеобразования и (или) митогенная способность, возможно, имеющие значение для терапевтических способов. Эти особенности белков могут варьировать в зависимости от образования гомодимеров или гетеродимеров. Такие структуры могут оказаться полезными также в клинических применениях. Аминокислотная последовательность особенно предпочтительного белка семейства TGF- (MP-52) показана в SEQ ID 3. Следующим аспектом изобретения является обеспечение способа получения TGF--подобных белков. Такой способ предусматривает культивирование клетки хозяина, трансформируемой последовательностью ДНК данного изобретения, в подходящей культуральной среде и очистку полученного TGF--подобного белка. Таким образом, этот способ позволяет получить достаточное количество целевого белка для применения в консервативном лечении или в способах с использованием культур клеток, требующих факторов роста для их продуктивности. Клетку хозяина получают из бактерий, таких как Bacillus или Escherichia coli, из грибов, таких как дрожжи, из растений таких, как табак, картофель или Arabidopsis, и из животных, в частности, линии клеток позвоночных, такие как линии клеток Мо-, СОS- или СНО. Еще одним аспектом данного изобретения является обеспечение особенно чувствительного способа выделения последовательностей ДНК, соответствующих низкому количеству мРНК в целевых тканях. Способ данного изобретения предусматривает сочетание четырех различных стадий. Сначала должна быть выделена мРНК и использована в реакции амплификации с применением олигонуклеотидных праймеров. Последовательность олигонуклеотидных праймеров содержит вырожденные последовательности ДНК, произведенные в соответствии с аминокислотной последовательностью белков, относящихся к целевому гену. Эта стадия может приводить к амплификации уже известных членов целевого семейства генов, и эти нежелательные последовательности должны быть, следовательно, исключены. Это достигается при помощи рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз), которые, как это известно, способны переваривать уже подвергнутые анализу члены этого семейства генов. После обработки популяции амплифицированной ДНК этими рестриктазами оставшиеся целевые ДНК выделяют при помощи гель-электрофореза и повторно амплифицируют в третьей стадии при помощи реакции амплификации. В четвертой стадии их клонируют в подходящие векторы для секвенирования. Для повышения чувствительности и эффективности вторую и третью стадии повторяют по меньшей мере два раза в одном из вариантов данного способа. В одном из предпочтительных вариантов описанный выше способ выделения применяют для выделения последовательностей ДНК из ткани печени. В наиболее предпочтительном варианте этого способа один из праймеров, применяемый для эксперимента с ПЦР (полимеразной цепной реакцией), гомологичен poly(A)-фрагменту мРНК, тогда как второй праймер содержит генспецифическую последовательность. Способы, применяемые в проведении различных стадий данного способа (такие, как реакции амплификации или способы секвенирования) известны специалистам, работающим в этой области, и описаны, например, в Sambrook et al. , 1989, "Molecular Cloning: А laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press. Другим объектом данного изобретения является обеспечение фармацевтических композиций, содержащих терапевтически эффективное количество белка семейства TGF- данного изобретения. Иногда такая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель. Подобная композиция может применяться в заживлении ран и репарации тканей так же, как в заживлении кости, хрящей или дефектов зубов, либо отдельно, либо в соединении с подходящими носителями и, возможно, с другими родственными белками или факторами роста. Так терапевтическая композиция данного изобретения может содержать (но не ограничивается этим) кодируемый МР-52 белок в сочетании с кодируемым MP-121 белком и иногда с другими известными биологически активными веществами, такими как EGF (эпидермальный фактор роста) или PDGF (тромбоцитарный фактор роста). Другим возможным клиническим приложением TGF--подобного белка является его применение в качестве супрессора иммунного ответа, который может предотвращать отторжение трансплантируемых органов. Фармацевтическая композиция, содержащая белки данного изобретения, может также применяться профилактически и в косметической пластической хирургии. Кроме того, применение такой композиции не лимитировано человеком, а распространяется на животных, в частности на домашних животных. Наконец, еще одним объектом данного изобретения является антитело или фрагмент антитела, которые способны специфически связываться с белками данного изобретения. Способы получения такого специфического антитела хорошо известны. Предпочтительно антитело, являющееся моноклональным. Такие антитела или фрагменты антител могут быть применены для диагностических способов. Следующие примеры детально иллюстрируют описанное изобретение, но не ограничивают его. Пример 1
Выделение MP-121
1.1 Тотальную РНК выделяли из ткани печени человека (40-летнего мужчины) по способу Chergwin et al., Biochemistry 18 (1979), 5294-5299. Poly(A)+-РНК выделяли из тотальной РНК при помощи олиго(dТ)-хроматографии в соответствии с инструкциями изготовителя (Stratagene Poli (A) Quick columns). 1.2 Для реакции обратной транскрипции poli (A)+-РНК (1-2.5 мкг), полученную из ткани печени, нагревали 5 мин до 65oС и быстро охлаждали на льду. Реагенты для обратной транскрипции, содержащие 27 Е защитного реагента для РНК (Pharmacia), 2.5 мкг олиго d(T)12-18 (Pharmacia), 5 х буфер (250 мМ Трис-HCl рН 8.5; 50 мМ МgСl2; 50 мМ ДТТ; 5 мМ каждого из дНТФ; 600 мМ КСl) и 20 единиц обратной транскриптазы вируса птичьего миелобластоза (AMV, Boehringer Mannheim) добавляли на мкг poli (A)+-РНК. 1.3 Дезоксинуклеотидные праймеры OD и ОID (фиг.2), предназначенные для затравки реакции амплификации, генерировали на автоматизированном синтезаторе ДНК (Biosearch). Очистку проводили при помощи денатурирующего гель-электрофореза и выделения основной полосы из геля при помощи изотахофореза. Олигонуклеотиды были сконструированы путем сравнительного анализа первичной структуры последовательностей некоторых известных членов семейства TGF- и отбора наиболее консервативных районов. Сравнительный анализ такого района показан на фиг.2. Для облегчения клонкрования оба олигонуклеотида содержали сайты рестрикции ЕcoR I, a OD дополнительно содержал сайт рестрикции Nсо I у его 5I-конца. 1.4 В полимеразной цепной реакции в качестве матрицы применяли полученный из печени пул кДНК в реакционной смеси объемом 50 мкл. Амплификацию проводили в 1 x PCR-буфере (16.6 мМ (NН4)2SO4; 67 мМ Трис-НСl рН 8.8; 2 мМ MgCl2; 6.7 мкМ ЭДТА; 10 мМ -меркаптоэтанол; 170 мкг/мл БСА (Gibco)), 200 мкМ каждого из олигонуклеотидов (OD и OID) и 1.5 единиц Taq-полимеразы (AmpliTaq, Perkin Elmer Cetus). PCR-peакцию проводили в присутствии кДНК, соответствующей 30 нг poli (A)+-РНК в качестве исходного материала. На эту реакционную смесь наслаивали парафин и проводили 40 циклов полимеразной цепной реакции (PCR) (цикл 1: 80 с 93oС/40 с 52oC/40 с 72oС; циклы 2-9: 60 с 93oС/40 с 52oС/60 с 72oС; циклы 10-29: 60 с 93oС/40 с 52oС/60 с 72oС; циклы 30-31: 60 с 93oС/40 с 52oС/90 с 72oС; цикл 40: 60 с 93oС/40 с 52oС/420 с 72oС). Шесть реакционных смесей PCR-реакции объединяли вместе, очищали последовательными экстракциями, равными объемами фенола, смеси фенол/хлороформ (1: 1 об./об.) и смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1 об./об.)и концентрировали осаждением этанолом. 1.5 Половина полученного пула PCR была достаточной для переваривания рестрикционными ферментами Sph I (Pharmcia) и AlwN I (Biolabs). Другую половину переваривали в серии реакций рестрикционными ферментами Аvа I (BRL), AlwN I (Biolabs) и Tfi I (Biolabs). Переваривание рестрикционными ферментами проводили в объеме 100 мкл при 37oС (за исключением Tfi I - при 65oС) с использованием 8 единиц каждого фермента в течение 2-12 ч в буфере, рекомендованном изготовителем. 1.6 Каждую пробу ДНК фракционировали при помощи электрофореза с применением 4%-ного агарозного геля (3% FMC Nusieve agarose, Biozym и 1% agarose, BRL) в Трис-боратном буфере (89 мМ Trisbase, 89 мM борная кислота, 2 мМ ЭДТА, рН 8). После окрашивания этидиумбромидом нерасщепленные продукты амплификации (приблизительно 200 пар оснований; маркер размера шел в параллельной пробе) вырезали из геля и выделяли фенольной экстракцией: равный объем фенола добавляли к вырезанной агарозе, которую измельчали до маленьких кусочков, замораживали в течение 10 мин, интенсивно перемешивали и центрифугировали. Водную фазу собирали, интерфазу повторно экстрагировали ТЕ-буфером такого же объема, центрифугировали и обе водные фазы объединяли. Далее ДНК очищали дважды экстракцией смесью фенола с хлороформом и один раз смесью хлороформ/изоамиловый спирт. 1.7 После осаждения этанолом одну четвертую или одну пятую часть выделенной ДНК повторно амплифицировали при тех же условиях, которые применяли при первичной амплификации, за исключением того, что количество циклов уменьшали до 13 (цикл 1: 80 с 93oС/40 с 52oС/40 с 72oС; циклы 2-12: 60 с 93oС/ 40 с 52oС/60 с 72oС; цикл 13: 60 с 93oС/40 с 52oС/420 с 72oС). Продукты повторной амплификации очищали, подвергали действию тех же рестрикционных ферментов, которые описаны выше, и нерасщепленные продукты выделяли из агарозных гелей, как описано выше для продуктов амплификации. Повторную реамплификацию сопровождали рестрикцией, выделение из геля повторяли один раз. 1.8 После последнего выделения из геля продукты амплификации переваривали 4 единицами EcoR I (Pharmacia) в течение 2 ч при 37oС с применением буфера, рекомендованного изготовителем. Одну четвертую часть рестрикциошюй смеси лигировали в вектор pBluescript II SK+ (Stratagene), который был также переварен при помощи EcoR I. После лигирования 24 клона из каждого сочетания ферментов анализировали далее при помощи секвенирования. Проба, рестриктированная ферментами AlwN I и Sph I, не содержала новых последовательностей, только последовательности ВМР6 и Ингибина A. 19 идентичных новых последовательностей, которые были названы MP-121, были обнаружены при обработке проб рестриктазами Аva I, AlwN I и Tfi I. Одна последовательность отличалась от основной обнаруженной последовательности двумя нуклеотидными заменами. Реакцию лигирования и трансформации Е. coli HBIOI проводили, как описано в Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual (1989). Трансформанты отбирали по устойчивости к ампициллину и плазмидные ДНК выделяли в соответствии со стандартными протоколами (Sambrook et a1., (1989)). Двухцепочечные плазмиды секвенировали при помощи "дидезоксисеквенирования с терминацией цепи" с набором (китом) "Sеquenаsе Version 2.0" (United States Biochemical Corporation). Клон был дополнен до 3I-конца кДНК по способу, детально описанному Frohman (Amplifications, published by Perkin-Elmer Corporation, issue 5 (1990), pp. 11-15). Ту же самую мРНК печени, которую применяли для выделения первого фрагмента MP-121, обратно транскрибировали при помощи праймера, состоящего из олиго (dT) (16 остатков), соединенного с адапторным праймером
AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAAGC(T)16
Амплификацию проводили с применением адапторного праймера
AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG
и внутреннего праймера
GGCTACGCCATGAACTTCTGCATA
последовательности MP-121. Продукты амплификации повторно амплифицировали с примением вставленного внутреннего праймера
ACATAGCAGGCATGCCTGGTATTG
последовательности MP-121 и адапторного праймера. Продукты повторной амплификации клонировали после рестрикции при помощи Sph I в таким же образом рестриктированном векторе рТ7/Т3 U19 (Pharmacia) и секвенировали при помощи набора (кита) "Sеquenаsе Version 2.0" (United States Biochemical Corporation). Клоны отличались тем, что их последовательность перекрывалась с 3I-концом известной последовательности MP-121. Пример 2
Выделение МР-52
Следующая последовательность кДНК, MP-52, была выделена согласно описанному выше способу (пример 1) с применением РНК из ткани эмбриона человека (8-9 недель). В полимеразной цепной реакции использовали кДНК, соответствующую 20 нг поли(A)+-РНК, в качестве исходного материала. Стадию повторной амплификации повторяли дважды для обеих комбинаций ферментов. После лигирования 24 клона из каждой ферментной комбинации анализировали далее при помощи секвенирования. Проба, рестриктированная ферментами AlwN I и Sph I, давала новую последовательность, которая была названа МР-52. Другие клоны содержали, в основном, последовательвость ВМР6 и одну последовательность ВМР7. Проба, рестриктированная ферментами Ava I, AlwN I и Tfi I, не содержала новых последовательностей, а состояла, в основном, из последовательностей BMP7 и небольшого числа последовательностей Ингибина A. Клон дополняли до 3I-конца согласно описанному выше способу (пример 1). Ту же самую мРНК эмбриона человека, которую применяли для выделения первого фрагмента MР-52, подвергали действию обратной транскриптазы, как в примере 1. Амплификацию проводили с применением адапторного праймера
AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG
и внутреннего праймера
CTTGAGTACGAGGCXXXCCACTG
последовательности МР-52. Продукты амплификации повторно амплифицировали с применением вставленного адапторного праймера
ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG
и вставленного внутреннего праймера
GGAGCCCACGAATCATGCAGTCA
последовательности МР-52. Продукты повторной амплификации клонировали после рестрикции при помощи Nco I в таким же образом рестриктированном векторе (рSU 19 (Pharmacia #27-4951-01) с измененным сайтом множественного клонирования, содержащим уникальный сайт рестрикции Nсo I) и секвенировали. Клоны отличались тем, что их последовательность перекрывалась с 3I-концом известной последовательности МР-52. Некоторые из этих клонов содержат последние 143 пары оснований 3I-конца последовательности, представленной в SEQ ID 1, и 0.56 кб 3I-нетранслируемого района (последовательность не представлена). Один из клонов применяли в качестве зонда для скрининга геномной библиотеки человека (Stratagene #946203) по общепринятому способу, детально описанному Ausubel et al. (Current Protocolс in Molecular Biology, published by Greene publishing Associates and Wiley - Interscience (1989)). Из 8х105  -фагов выделили и депонировали в DSM (#7387) один фаг ( 2.7.4), который, как было показано, содержал инсерцию размером приблизительно 20 кб. Этот клон содержит, кроме последовательности, выделенной из мРНК при помощи описанных способов амплификации, информацию далее до 5I-конца. Для секвенирования фрагмент Hind III размером приблизительно 7.5 кб субклонировали в таким же образом рестриктированном векторе (Bluescript SK, Stratagene # 212206). Эту плазмиду, названную SKL 52 (НЗ) MP12, также депонировали в DSM (# 7353). Информация в виде последовательностей, полученная из этого клона, показана в SEQ ID 1. По месту нуклеотида 1050 определенная кДНК и соответствующая геномная последовательность различаются одним основанием (кДНК: Г; геномная ДНК: А). Мы полагаем, что геномная последовательность является верной, т. к. это было подтверждено также секвенированием амплифицированной геномной ДНК из эмбриональной ткани, которую применяли для получения мРНК. Эта геномная ДНК содержит интрон размером приблизительно 2 кб между парами оснований 332 и 333 SEQ ID 1. Последовательность интрона не представлена. Правильное место соединения экзон/экзон было подтверждено секвенированием продукта амплификации, полученного из кДНК, которая содержит этот район. Эта информация была получена при помощи слегка модифицированного способа, детально описанного Frohman (Amfications, published by Perkin-Elmer Corporation, issue 5 (I990), pp. 11-15). Ту же эмбриональную РНК, которую применяли для выделения 3I-конца МР-52, обратно транскрибировали с применением внутреннего праймера последовательности MР-52, ориентированной в 5I-направлении
AGAGCAGGTGGGTGGTGTGGACT
Поли(А)-конец добавляли к 5I-концу первой цепи кДНК при помощи терминальной трансферазы. Двухступенчатую амплификацию проводили сначала с применением праймера, состоящего из олиго-dТ и адапторного праймера
AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAAGC (T16)
и затем с применением адапторного праймера
AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG
и внутреннего праймера
CCAGCAGCCCATCCTTCTCC
последовательности МР-52. Продукты амплификации повторно амплифицировали с применением того же адапторного праймера и вставленного внутреннего праймера
TCCAGGGCACTAATGTCAAACACG
последовательности МР-52. Затем продукты повторной амплификации еще раз амплифицировали с применением вставленного адапторного праймера
ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG
и вставленного внутреннего праймера
ACTAATGTCAAACACGTACCTCTG
последовательности MР-52. Конечные продукты реамплификации затупляли и клонировали в векторе (Bluescript SK, Stratagene #212206), обработанном Ecor V. Клоны отличались тем, что их последовательность перекрывалась с ДНК фага 2.7.4. Плазмида SKL 52 (КЗ) была депонирована под 7353 в DSM (Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур)), Mascheroder Weg lb, 3300 Вraunschweig, 10.12.1992. Фаг 2.7.4 был депонирован под 7387 в DSM 13.01.1993. Пример 3
Экспрессия TGF- белка МР52 в прокариотной системе (E.coli)
Часть МР52, содержащая дополнительные остатки гистидина на N-концах, экспрессировалась в E.coli. Метка His упрощает очистку за счет образования хелатного комплекса с металлом. Часть МР52 с С-концами (119 аминокислот), содержащая аминокислоты 283-401 в SEQ ID 3 и дополнительно 10 аминокислот на N-концах (MHHHHHHKLI) экспрессировалась с использованием прокариотного вектора рВР2. Вектор рВР2 является производным плазмиды рВР322, содержащей устойчивый к ампицилину ген. За промотером Т7 следует связывающий сайт рибосомы, стартовый кодон, 6 гистидиновых кодона, множественный сайт клонирования для вставки целевого гена, стоп-кодон в каждой рамке считывания и терминатор. Экспрессия MP52His индуцировалась источником полимеразы Т7 РНК. Хозяин экспрессии BL21(DE3)pLysS (Новаген) содержит хромосомную копию гена полимеразы Т7 РНК под контролем lacUV5, экспрессия MP52His индуцировалась с помощью IPTG согласно инструкции изготовителя. Мономерный MP52His экспрессировался в телах включения с возможностью выделения стандартными способами. Очистка MP52His производилась с использованием хелатного комплекса никеля, как описано Hochuli и др. (BIO/Technology 6, 1988, 1321-1325). Дальнейшая очистка производилась реверсированной фазовой колонкой (нуклеосил 300-7С4, Machery-Nagel, 715023) с 0-90% градиентом ацетонитрила, содержащего 0,1% TFA, в течение 100 мин (скорость течения 2 мл/мин). Главная фракция MP52His была собрана, лиофилизована и хранилась при - 70oС. MP52His солюбилизирован в денатурирующем буфере (6 М гуанидин хлорида, 150 мМ Nad, 3 мМ DTT, 10 мМ Tris pH 8; 2,6 мг/мл) и развернут в активный двумерный MP52His при конечной концентрации 160 мкг/мл в обычной буферной системе Tris (pH 9,5), содержащей EDTA (2-10 мМ), CHAPS (15-50 мМ), NaCI (1-2 М) и редокс-систему (1 мМ GSSG, 2 мМ GSH) в течение 48 ч при 23oС. Остаточный мономерный MP52His отделялся от двумерного посредством ВЭЖХ. Для этого MP52His загружался в колонку (аквапор октил, 20 мкм, Applied Biosystems) с 35% буфером В (буфер А: 0,1% TFA в воде, буфер В: 90% ацетонитрил, 0,1% TFA). При градиенте буфера В 35-60% в течение 50 мин (скорость потока 3 мл/мин) двумерный MP52His начинает элюироваться при примерно 40% буфера В, затем следует мономерная форма, начиная примерно с 43% буфера В. Очищенный двумерный MP52His был лиофилизован, хранился при 70oС и использовался в описанных далее экспериментах по изучению биологической активности. Аналогично была экспрессирована С-концевая часть МР52 (120 аминокислот), содержащая аминокислоты 282-401 в SEQ ID 3 и дополнительный остаток метионина на N-концах, с использованием прокариотного вектора рВР2. При использовании бактериального штамма BL21(DE3)pLysS (Новаген), индуцируя ген полимеразы Т7 в соответствии с инструкциями производителя, был также экспрессирован МР52m в телах включения с возможностью выделения с помощью стандартных способов. Дальнейшая очистка производилась реверсивной фазовой колонкой (нуклеосил 300-7С4, Machery-Nagel, 715023) с 0-50% градиентом буфера В (буфер А: 0,1% TFA в воде, буфер В: 90% ацетонитрил, 0,1% TFA) в течение 50 мин (скорость течения 2 мл/мин). Главные фракции МР52m были собраны, лиофилизованы и хранились при - 70oС. Солюбилизация, развертывание и сепарация остаточного мономерного МР52m производилась, как описано для MP52His. Фракции, содержащие очищенный двумерный МР52m, были собраны, лиофилизованы, хранились при - 70oС и использовались в описанных опытах по изучению биологической активности. Нагруженные на полиамидные гели SDS (15%) MP52m и MP52His показали кажущийся молекулярный вес примерно 14 kD (теоретический молекулярный вес 13,7 kD) и 15 kD (теоретический молекулярный вес 14,8 kD) соответственно, как показано на фиг.3 после окрашивания серебром. Тест на наличие МР52 производился с использованием Вестерн блотинга в соответствии со стандартными методами со специфическими для МР52 антителами. Пример 4
Биологическая активность МР52
Опыт с пристенной костью in vivo
MP52His (1, 3 и 10 мкг/20 мкл/сайт) был растворен в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS; рН 3,4), содержащим 0,01% человеческого серумальбумина, и повторно инъекцировался в пристенную кость новорожденной мыши один раз в день. Инъекция МР52 была начата спустя один день после рождения и закончена после 12 дней для гистопатологического исследования (штамм гематоксилин-эозина). Как показано на фиг.4 MP52His стимулирует в зависимости от дозы увеличение толщины новообразованной кости. Модель сегментального дефекта кости in vivo
Пятимиллиметровый сегментальный дефект кости был создан в средней области бедренной кости 13-недельного самца крысы Sprague-Dawley с использованием мелкозубчатой пилы. Был закапан физиологический раствор для предотвращения повреждения ткани. Полиэтиленовая пластина была закреплена вдоль латерального кортекса с помощью нержавеющих винтов диаметром 2 мм. Раствор, содержащий 0,5% свиного коллагена типа 1 (200 мкл), был смешан с MP52His (20 мкл), лиофилизован и имплантирован в дефекты. Раствор свиного коллагена типа 1 был так же обработан и использован для контроля. Через 12 недель после имплантации крысы были умерщвлены и бедренные кости извлечены. Заживление сегментальных дефектов кости в течение времени оценивалось с помощью рентгенографии мягкими рентгеновскими лучами после 4, 8 и 12 недель после имплантации. Как показано на фиг.5, дефектная кость, обработанная МР52, заполнялась минерализованной тканью после 8 и 12 недель, в то время как в контроле не было обнаружено изменений при радиографии в дефектной кости даже спустя 12 недель. Содержание костных минералов в дефектах бедренной кости было измерено после 12-недельной обработки с помощью измерения поглощения рентгеновских лучей двойной энергии. Как показано на фиг.6, группа MP52His имеет значительно повышенный уровень по сравнению с контрольной группой. По одной крысе из обеих групп были подвергнуты гистологическому анализу через 12 недель. Окрашивание (гематоксилин и эозин, синий альциан) декальцинированных участков дефектов бедренной кости, обработанных MP52His, выявило законченное костное соединение поперек дефекта, содержащее клетки костного мозга (данные не показаны). У контрольной крысы мышечные, жировые и волокнистые ткани показали только задержанный или несросшийся дефект. Для измерения прочности на скручивание были удалены полиэтиленовые пластины и нержавеющие винты и диафизы бедренной кости оставшихся крыс были зафиксированы закрытием обоих концов смолой и закреплением их в системе нагрузки кости (MZ-500D, Maruto Testing Machine Co.). Смола на нижнем конце поворачивалась со скоростью 180 град/мин. Прочность на скручивание определяли измерением максимальной силы, необходимой для перелома кости. Как показано на фиг.7, прочность на скручивание бедренной кости, обработанной MP52His, значительно выше контрольной величины. Модель дефекта на полную толщину суставного хряща кролика
Дефект диаметром 2 мм был создан в средней части бедренной кости через подхрящевую пластину у кроликов (около 2 кг) с помощью ортопедического ручного сверла. После этого просверленное отверстие было расширено игольной биопсией. Гиалуроновый кислый гель (10 мкл, 1%), смешанный с MP52His и без него, был введен в дефект хряща. Шесть недель после операции декальцинированные трансекции суставного хряща были окрашены гематоксилин-эозином и голубым альцианом. На фиг.8 показано, что после обработки смесью гиалуроновой кислоты (НА) с MP52His появилась зона, по структуре схожая со здоровым хрящом. Обработанные гиалуроновой кислотой контрольные дефекты показывают генерацию хондроцитов, однако отсутствует зональная структура суставного хряща. Биологическая активность МР52
Влияние МР52 на допаминэргические нейроны
Для изучения влияния МР52 на допаминэргические нейроны, были изолированы нейроны со дна среднего мозга 14-дневного эмбриона крысы (Е14) согласно метода, описанного Shimoda и др. (Brain. Res. 586, 319-331 (1992)). Клетки были отделены и культивированы по методу, описанному Krieglstein и др. (Neuroscience 63, 1189-1196 (1994)). Плотность клеток на покрытых полиорнитином/ламинином покровных стеклах составляла 200000 клеток/см2. После культивирования в течение 24 ч последовательно каждые три дня изымались две трети среды (500 мкл) и заменялись свежей средой, содержащей соответствующие добавки. MP52His, очищенный сефарозой и реверсивной фазой ВЭЖХ, был растворен в 50% ацетонитриле и добавлен к среде. Конечная концентрация MP52His в среде составляла 20 нг/мл (конечная концентрация ацетонитрила составляла 0,3%). Сравнимое количество очищенного мономерного MP52His, растворенного в 50% ацетонитриле, было использовано для контроля. Через 8 дней культуры были зафиксированы в течение 10 мин при комнатной температуре в 4% формальдегиде; клетки были переведены в проницаемое состояние ацетоном (10 мин, -20oС) и промыты PBS (физиологический раствор с фосфатным буфером). После обработки 1% HiOi в PBS, промывания и блокирования лошадиной сывороткой они были окрашены иммуноцитохимическим путем. Тирозин гидроксилаза (ТН) является лимитирующим энцимом в биосинтезе допамина и других катехоламинов, так что ТН может быть использован в качестве маркера для допаминэргических нейронов в данных культурах (клетки, содержащие норадреналин, не были изолированы). ТН детектировался посредством одночасовой инкубации при 37oС с использованием мышиного моноклонального антитела против крысиного ТН (разведение 1: 200, Boehringen Mannheim) и последовательного детектирования с помощью набора Vektastain ABC (Vekto Labs). ТН-позитивные клетки были сосчитаны на площади 0,12 см2. На фиг.9 можно видеть, что двумерный МР52 оказывают положительный эффект на выживаемость допаминэргических нейронов. Белок может действовать как нейротропный фактор. Мономерный МР52 не оказывал воздействия по сравнению с контрольной средой как ожидалось от TGF- белков. Влияние МР52 на нейроны сетчатки
С целью исследования влияния МР52 в различных системах были выделены культуры ткани сетчатки эмбрионов цыплят. Метод выделения дискообразных проб ткани из сетчатки примерно равного размера детально описан Carri & Ebendal (Dev. Brain Res. , том 8 (1983) 219-229), Carri & Ebendal (Anat. Rec., том 214 (1986) 226-229) и Carri и др. (J. Neurosci. Res., том 19 (1988) 428-439). В этих экспериментах стимулирование роста нервных волокон из эмбрионального эксплантата сетчатки измерялось in vitro на коллагеновой матрице. Брали части ткани сетчатки эмбрионов цыплят (белый леггорн, 6-й день эмбрионального развития) с использованием стеклянных капилляров и были удалены мезенхимальные клетки повторным промыванием пигментного эпителия сетчатки. Обработанные таким образом частицы ткани были перенесены на планшет для культивирования, покрытый коллагеном, и инкубировались всю ночь (37,5oС, 5% СО2). Последовательно добавлялись соответствующие факторы или контрольные составы и культуры инкубировались далее. Двумерный МР52 использовался в различных концентрациях (см. табл. 1). Мономерный МР52, который не проявлял активности ни в одном эксперименте, использовался в качестве негативного контроля. Таблица 1: длина невритов сетчатки после 4 дней культивирования под влиянием различных концентраций МР52m. Длина невритов контрольных проб, содержащих только культуральную среду, составила 5,5/8/10/11/4,8/7 условных единиц, что соответствует среднему значению 7,7 (SEM 1,0). Длина невритов контрольных проб, содержащих мономерный МР52m (в равных концентрациях с двумерным МР52m), показала тот же рост, что и контрольные пробы, содержащие только культуральную среду. Одна условная единица соответствует 0,03 мм в реальном масштабе. В качестве независимого контроля эксплантаты находились в культуральной среде, содержащей небольшое количество бычьего сывороточного альбумина. Белки были растворены в водном буфере или 50% ацетонитриле и далее в культуральной среде до конечных концентраций 1,25, 12,5, 25, 100 и 200 нг/мл. После 4 дней пребывания в культуре была измерена максимальная длина волокна ведущих нервных волокон в темном поле под микроскопом. МР52 в зависимости от дозы стимулировал рост невритов как показано в таблице 1, проявлял максимальную активность в диапазоне 25-100 нг/мл, что соответствует реальной длине волокна 1,3-1,7 мм по сравнению с 0,2 мм для негативного контроля. Мономерный МР52 и некультивированный контроль не показали стимуляции, превышающей негативный контроль. Описанные выше эксперименты отчетливо показывают, что МР52 является очень полезным для лечения или профилактики повреждений хряща и кости, а также расстройств и болезней, которые могут быть уменьшены или излечены посредством нарастания кости и/или хряща или косметической хирургией. Это может быть, например, лечение переломов кости и несрастаний, реконструкция и трансплантация кости, спинные слияния и зубоврачебное применение, а также заболевания, вызванные анормальным метаболизмом кости или хряща, как, например, остеопороз. При применении белков согласно изобретению с целью образования нового хряща и/или кости рекомендуется локальное применение, предпочтительно на матрице. При этом могут быть использованы обычно применяемые матрицы, широко известные для белков, стимулирующих рост хрящей и костей. При устранении дефектов костей могут применяться матрицы, например материалы на коллагеновой основе, куски хряща из других участков тела или полимеры, соответственно сополимеры, такие как полигликолевая или полимолочная кислота. При необходимости могут применяться целлюлозные материалы, смеси описанных матричных материалов с гиалуроновой кислотой. Введение белков на матрице производится с помощью обычно применяемых методов. За процессом заживления хряща необходимо наблюдение вплоть до полного излечения с помощью рентгеновского анализа, белки в растворе, при необходимости при добавлении гиалуроновой кислоты или производных целлюлозы и/или и инъецируемого коллагена, могут впрыскиваться неоднократно в пораженное место. Для индукции новой кости используются при локальном применении матрицы естественного происхождения (также и модифицированные) или полученные синтетически. Матрицы могут быть биологически неразлагаемыми, как, например, керамика, алюминаты или биостекло. Но особенно предпочтительны биосовместимые пористые матрицы, которые на месте повреждения создают структуру и заполняют пораженный участок, однако затем с ростом или после роста нового хряща и/или кости in vivo разрушаются. К таким матрицам относятся, например, производные коллагена, трикальцийфосфаты, гидроксилапатит, производные полигликолевой или полимолочной кислоты или их смеси. При трансплантациях белки могут наноситься локально непосредственно на участок хряща, кости или искусственных протезов, которым предварительно сообщена шероховатость. В отдельных случаях может быть эффективна локальная инъекция белков без матрицы. При локальном применении белков дозировка составляет от 5 мкг до 50 мг на 1 г матрицы, соответственно на одно место имплантации. Дозировка зависит от отдельных факторов, таких как, например, вид и локализация повреждения хряща или кости, величина подлежащего регенерации хряща или кости, характер матрицы, однократность применения или повторные последующие инъекции, возраст и общая конституция пациента, начало и вид лечения, а также других клинических факторов, решение по которым в каждом отдельном случае принимает лечащий врач.
Формула изобретения
1. Последовательность ДНК, кодирующая белок (МР-52) TGF-бета семейства и характеризующаяся нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей: а) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID N 1,
б) нуклеотидную последовательность, соотносящуюся с последовательностью (а) в рамках вырожденности генетического кода,
в) нуклеотидную последовательность, включающую фрагмент последовательности (а) или (б), соответствующий части, кодирующей зрелую форму белка. 2. Последовательность ДНК по п.1, отличающаяся тем, что представляет собой ДНК млекопитающего. 3. Способ получения белка TGF-бета семейства, предусматривающий включение последовательности ДНК, кодирующей названный белок, в вектор экспрессии, трансформацию подходящих клеток-хозяев полученным вектором экспрессии, инкубацию трансформированных клеток в условиях, благоприятных для экспрессии белка, и извлечение целевого продукта из культуры, отличающийся тем, что в вектор экспрессии включают последовательность ДНК по п.1. 4. Экспрессированный зрелый белок (МР-52) TGF-бета семейства, кодируемый последовательностью ДНК по п.1 и обладающий способностью индуцировать рост костной и хрящевой тканей. 5. Фармацевтическая композиция для индуцирования роста костной или хрящевой ткани, содержащая белок TGF-бета семейства в качестве активного начала и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что содержит белок (МР-52) TGF-бета семейства по п.4. 6. Последовательность ДНК, кодирующая фрагмент белка (МР-121) TGF-бета семейства и характеризующаяся нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей: а) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID N 2, и б) нуклеотидную последовательность, соотносящуюся с последовательностью (а) в рамках вырожденности генетического кода. 7. Последовательность ДНК по п.6, отличающаяся тем, что представляет собой ДНК млекопитающего. |
