СПИСОК ПАТЕНТОВ С УПОМИНАНИЕМ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ
-
- 2017751 Способ получения гиалурона
- 2192150 БАД для профилактики йодной недостаточности
- 2112542 Препарат для лечения патологий соединительных тканей
- 2225206 Препарат для лечения рака молочной железы
- 2299733 Лечение опорно-двигательного аппарата
- 2299732 Способ лечения глаукомы
- 2299726 Противоинфекционная губная помада
- 2299725 Косметическое средство для ухода за кожей
- 2198878 Ароматическое соединение
- 2198702 Способ подготовки трофических язв к аутодермапластике
- 2198653 Вагинальные суппозитории
- 2197946 Композиция для ухода за волосами
- 2197923 Фармацевтическая композиция для лечения отеков роговицы
- 2298410 Биотрансплантант и способ лечения ревматических и аутоиммунных заболеваний
- 2197501 Фотоотверженный гель на основе сшитой гиалуроновой кислоты
- 2197228 Твердые лекарственные формы
- 2197222 Водная компазиция для ухода за волосами, лица и тела
- 2297425 Полипептиды
- 2297240 Композиция с гиалуроновой кислотой
- 2297230 Фармацевтическая компазиция с ксантоновой смолой
- 2196588 Глазные капли
- 2195955 Применение биологически активных веществ
- 2195926 Дерматологические композиции
- 2295954 Микрочастицы для доставки нуклеиновых кислот
- 2295951 Косметика для ухода за кожей лица и век
- 2195262 Фармакологическое средство на основе гиалуроновой кислоты
- 2194512 Способ профилактики и коррекции процесса старения кожи
- 2194478 Лечение экземы
- 2294716 Расширяемый стент
- 2194055 Сшитые сополимеры
- 2099350 Ассоциаты депротонированной гиалуроновой кислоты
- 2293557 Средство для лечения кожи и слизистых
- 2292878 Приготовление микроцастиц, содержащих метопропол
- 2292746 БАД
- 2192256 Защита кишечника
- 2191782 Получение модифицированной гиалуроновой кислоты
- 2292219 Паратиреоидный гормон человека
- 2291686 Микроцастицы
- 2191000 Косметическая маска
- 2290921 Фармацевтические и косметические средства против старения кожи
- 2290900 Модифицированный биоматериал для использования в офтальмологии
- 2290899 Получение биоматерьяла
- 2290397 Новые инданилиденовые соединения
- 2290186 Лечение сирингомиелии
- 2288702 Иррингационный раствор для офтальмологии
- 2288699 Гель для лечения стоматологических заболеваний
- 2188011 Активирующая остеогенез фармацевтическая композиция
- 2187327 Средство с антисептиком
- 2187325 Средство с радиопротекторным действием
- 2287330 Композиции миноксидила
- 2186786 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2186593 Лечение раненого процесса кожи
- 2286801 Очищение воды
- 2286781 Лечение ожогов пищевода у детей
- 2286764 Средство лечения воспалений полости рта
- 2185840 Лечение инфекционных заболеваний
- 2286151 Альфа-2-Дельта-Лиганда
- 2185149 Ранозаживляющий гель
- 2285527 Лечение ИЛ-6 заболеваний
- 2184448 Раствор хранения роговицы, включающий гиалуроновую кислоту
- 2090179 Крем для кожи
- 2183961 Способ лечения кожи
- 2284331 Соли алифотических аминов
- 2284187 Производные амида
- 2089191 Снизить внутрение давление
- 2283320 Получение гликозаминогликанов
- 2283129 Лечение опухолей
- 2283098 Косметические средства с Q
- 2182574 Ароматические соединения
- 2088257 Средство с гипохолестеролемическим действием
- 2088218 Состав для гигиенических салфеток
- 2088206 Способ получения препарата, создающего исскуственный загар
- 2282462 Противомикробные средства
- 2182008 Интровагинальная компазиция
- 2181999 Препарат с отсроченным высвобождением
- 2181998 Новые композиции липидов
- 2181995 Лечение болевого синдрома
- 2181295 Вирионная вакцина
- 2087144 Витамин Е
- 2379336 Способ стирки
- 2379052 Вакцинация
- 2180855Композиция в виде ионного комплекса
- 2379025 Противоинфекционный гель
- 2180825 Лечение травм роговицы
- 2281082 Способ коррекции эстетических и возрастных проблем кожи
- 2180576 Биоактивная добавка для косметических средств
- 2280459 Средство для изменения скорости роста или репродукции клеток
- 2179981 Соли переходного металла
- 2378010 Жидкие вакцины
- 2378008 Комбинированные вакцины
- 2378007 Анаболическое средство
- 2377973 Растительные экстракты
- 2280041 Способ получения водорастворимых комплексов гиалурил
- 2280038 Биополимеры
- 2323733 Йодный обмен
- 2377260 Гель
- 2178693 Противовирусное средство на основе гиалуроновой кислоты
- 2178692 Облегчающие зуд косметическое средство
- 2377022 Гемостатические спреи
- 2376982 Увлажняющая сыворотка для лица
- 2376974 Трансдермальный гель для лица
- 2362784 Гипо-и гиперацетилированные менингокковые капсульные сахариды
- 2177789 Устройство для доставки лекарства к шейке матки
- 2277954 Крем для лица омолаживающий
- 2376378 Способ получения метионина
- 2177332 Биоматериал для предотвращения послеоперационных спаек, с производной гиалуроновой кислотой
- 2177310 Способ получения таблеток
- 2376011 Средство для позвоночника
- 2277410 Косметическое средство
- 2323748 Медицинская повязка
- 2276998 Гидрогелевые композиции
- 2082416 Способ получения препарата с коллагенном из животного сырья
- 2375081 Адсорбирующее изделие
- 2375049 Охлаждающий пластырь
- 2346049 Способ получения гиалурона
- 2275913 Фармацевтические средства
- 2174985 Полисахарид с антиоксидантом
- 2373957 Носитель для лекарственных средств и биологически активных веществ
- 2373941 Способ коррекции возрастных и патологических изменений кожных покров
- 2174845 Композиции и способы доставки генетического материала
- 2174830 Средство для укрепления волос
- 2373769 Синбиотическая композиция
- 2274472 Лечение апорно-двигательного аппарата и болевых синдромов
- 2372929 Профилактическая композиция на основе веществ фенольной природы в липосомной форме
- 2173563 Способ нанесения на поверхность предметов покрытия на основе гиалуроновой кислоты, её производных и полусинтетических полимеров
- 2079304 фармацевтическая композиция, обладающая иммуносупрессорной и антимикробной активностью
- 2273645 Полипептид ожирения
- 2173154 Фракция кератансульфатолигосахаридов и содержащий ее фармацевтический препарат
- 2173136 Грязная мазь
- 2173128 Способ хирургического лечения центральных разрывов сечатки
- 2078561 Косметическое средство предотвращающее старение кожи
- 2172490 Способ прогнозирования воспалительных заболеваний молочной железы при эндопластике
- 2272645 Способ лечения ЦМВ-Инфекции у детей раннего возроста
- 2272636 Фармацевтическая композиция для местного лечения воспаления
- 2272635 Фармацевтически активная субстанция для офтальмологии
- 2272599 Биоматерьял для стабилизации прогрессирующей миопии "Коллаплант"
- 2172168 Средство для заживления ран на основе гиалуроновой кислоты
- 2371172 Фармацевтическая композиция для лечения нервной системы на основе стефаглабрина
- 2171470 Способ прогнозирования послеоперационной трансформации доброкачественных опухолей нервной системы
- 2077317 Состав для ванн
- 2271213 Комбинированные композиции, содержащие экстракты из растений и морских животных
- 2076872 Способ получения окрашенной гиалуроновой кислоты
- 2076671 Раствор для защиты роговицы
- 2370281 Конъюгаты гидроксиалкилкрахмал
- 2370275 Способ лечения (коррекции) косметических и возрастных дефектов кожи
- 2370258 Фармацевтическая композиция для парентальной доставки в форме лиофилизата
- 2270023 Способ экстракции и очистки протеогликана хрящего типа (варианты)
- 2369408 Гемостатическая композиция, включающая гиалуроновую кислоту
- 2369387 Фармацевтическая композиция для лечения нервной системы
- 2369379 Нетаблитированные жевательные формы для индивидуального введения
- 2169136 Производное коричной кислоты
- 70792 Медицинский аппликатор
- 20741717 Способ стабилизации аскорбиновой кислоты
- 2074712 Способ получения препарата, препятствующего преждевременной эякуляции
- 2367954 Способ прогнозирования развития кожной патологии у женщин с синдромом склерополикистозных яичников (СПКЯ)
- 2268075 Устройство для электрокинетической доставки
- 2268052 Средство для лечения воспалительных и дегенеративных заболеваний суставов
- 2167649 Способ получения твердой дисперсии умеренного водорастворимого лекарственного вещества
- 2167647 Гель для бритья
- 2073520 Лечение урологических инфекций
- 2367476 Биопластический материал
- 2367475 Мембрана для использования при направленной регенерации тканей
- 2367469 Фармацевтическая композиция на основе лизоамидазы
- 2367456 Фармацевтическая композиция обладающая антибактериальным и некролитическим действием
- 2367455 Фармацевтическая композиция обладающая некролитическим и антибактериальным действием
- 2267324 Применение антиадгезивных углеводов, препарат для уменьшения и /или блокирования адгезии патогенных веществ
- 2166934 Композиции включающие биологический агент
- 2166510 Псевдодипептиды
- 2366460 Композиции, имеющие высокую противовирусную и антибактериальную активность
- 2360901 Производные феноксиуксусной кислоты
- 2165749 Способ восстановления эндотелия роговицы
- 2265441 Способ укрепления склеры
- 2365382 Композиции и способы для регуляции развития сосудов
- 2070879 Соли гликозаминогликанов
- 2164914 Циклические и гетероциклические N - замещенные - иминогидроксамовые карбоновые кислоты
- 2264627 Хламидийный конъюктивит
- 2364399 Фармацевтический препарат на основе стефаглабрина
- 2264230 Препарат с замедленным высвобождением активного вещества
- 2363497 Фармацевтические композиции
- 2363496 Способ увеличения объема мягких тканей
- 2363473 Способ антифлогистической активации в эксперементе
- 2363461 Фармацевтический препарат на основе сигетина
- 2363459 Средства для введения в роговицу глаз для предотвращения офтальмологических нарушений
- 2363448 Фармацевтические композиции
- 2163123 Глазные капли
- 2162687 Усовершенствованнная лекарственная форма индуктора интерферана
- 2162343 Биосовместимый полимерный материал и способ его получения
- 2162327 Лечение рака
- 2067841 Способ получения ароматизатора
- 2161478 Способ консервированого лечения гонартроза
- 2361617 Вольфрамовые частицы в качестве рентгеноконтрастных веществ
- 2361552 Способы и устройства для дренирования жидкостей и понижения внутриглазного давления
- 2066996 Способ изготовления пленочного материала для офтальмохирургии
- 2361417 Корм с глюкозамином и экстрактом ивы для профилактики артроза у животных
- 2161002 Пищевой общеукрепляющий лечебно-профилактический продукт из хрящевой ткани акул
- 2360928 Комплексная матрица для медико-биологического применения
- 2160574 Способ лечения глаукомы
- 2360688 Способ лечения повреждений переферических нервов
- 2360670 Фармацевтическая композиция при климактерических расстройствах
- 2360646 Эндолюминальный протез
- 2260445 Способ усовершенствования транспортировки через легко прспосабливаемый полупроницаемый барьер
- 2260007 Производные амида
- 2359975 Способ получения модифицированных арабиногалактанов
- 2359974 Антигенные Пептиды
- 2159775 Псевдопептидный продукт
- 2259833 Фармацевтическая композиция для лечения роговицы глаза
- 2259816 Ранозаживляющее средство
- 2259815 Способ коррекции возрастных изменений, связанных с процессами старения кожи
- 2359706 Способ сохранения офтальмологических растворов
- 2359704 Антисептическое средство
- 2359662 Микрокапсулы
- 2159253 Катионные полимеры
- 2159111 Средство для ухода за кожей лица
- 2159105 Композиция для защиты кожи от опасных химических веществ Получение
- 2158593 Биосовместимый водный раствор
- 2358728 Способ лечения и предупреждения потери костной ткани
- 2258517 Способ хирургического лечения травмотических повреждений селезенки пленкой на основе гиалуроновой кислоты
- 2357968 Кристалические формы производной имидазола
- 2357957 Ингибиторы P38 и их применение
- 2157647 Пищевая добавка и ее получение
- 2357758 Препараты для чрескожной и чересслизистой добавки
- 2063244 Способ стабилизации растворов
- 2063140 Способ получения препарата для консервирования мяса
- 2157381 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2257198 Композиции микроцастиц
- 2356909 Белковый комплекс
- 2356570 Косметическая композиция
- 2256434 Способ закрытия перфорации барабанной перепонки
- 2356520 Способ лечения постконтузионного повреждения сечатки глаза
- 2156133 Гель
- 2255945 Полимерная композиция
- 2355761 Средства повторной дифференцировки
- 2061043 Способ повышения устойчивости урокиназы к нагреванию
- 2061005 Способ получения красителей для гистологических исследований
- 2355420 Зубная паста
- 2355385 Композиции пролонгированного действия с контролируемым высвобождением
- 2355240 Способ получения пищевого препарата хондропротекторного действия
- 2155057 Пихтово репейный бальзам
- 2354409 Способ производства высвобождающих лекарственные средчтва медицинских устройств
- 2254145 Раневое покрытие на основе коллаген-хитозанового комплекса
- 2254133 Лечение и профилактика ВИЧ-инфекции у человека
- 2253439 Фармацевтическая композиция для защиты и улучшения оптических свойств роговици при проведении эндовитреальных вмешательств
- 2253437 Способ омоложения кожи
- 2153352 Фармацевтическая композиция обладающая ранозаживляющим и противовоспалительным действием
- 2353354 Фармацевтический препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2252787 Способ получения искусственной матрицы кожи
- 2252767 Способ нормализации иммунобиохимического гомеостаза коров в предродовом и послеродовом периодах
- 2352583 Фармацевтическая композиция содержащая Fc-область иммуноглобулина в качестве носителя
- 2152403 Модифицированные полисахариды
- 2352356 Иммуногенная композиция
- 2352342 Исскусственный физиологический солевый раствор Способ его получения
- 2352330 Фармацевтический препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2352323 Фармацевтический препарат с модифицированным высвобождением
- 2152027 Способ подготовки ткани мозга для определения гликозаминогликанов
- 2251842 Интектицидный состав для борьбы с личинками оводов
- 2151580 Способ активации пролиферации эндотелия роговицы
- 2351648 Дифференцировка стромальных клеток, полученных из жировой ткани, в эндокринные клетки поджелудочной железы и их использование
- 2351595 N - гидроксиформамидные соединения в качестве ингибиторов металлопротеина
- 2251411 Косметическое средство в лиофилизированной фармацевтической форме
- 2251405 Косметика...ее композиции для косметических препаратов
- 2251367 Средство со сшитой гиалуроновой кислотой для наращивания тканей
- 2351359 Косметика для профилактики и лечения избыточной массы тела
- 2351322 Препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2351153 Диета при остеортрите собак
- 2350958 Способ определения групповой принадлежности синовальной жидкости
- 2350625 Производные гиалуроновой кислоты с пониженной биодеградируемостью
- 2150266 Крем после бритья
- 2350354 Фармацевтическое средство содержащие антагонист и фактор некроза
- 2350340 Способ коррекции процессов регенерации
- 2350309 Способ лечения избыточной массы тела с помощью рефлексотерапии
- 2250047 Профилактический продукт из хрящевой ткани гидробионтов
- 2249467 Медицинский матерьял и изделия на его основе
- 2055079 Способ получения препарата гиалуроновой кислоты
- 2349599 Биоадгезив мидии
- 2054903 Способ лечения коллагеноза у бычков на откорме
- 2249210 Способ прогнозирования предрасположенности к развитию и тяжести течения деформирующего остеоартроза коленного сустава у взрослых
- 2349339 Средство для соединительной ткани
- 2148988 Человеческий интерферона
- 2148399 Лечение атеросклероза
- 2148396 Способ определения активного вещества в дифильных мазевых основах
- 2148375 Способ диагностики близорукости
- 2348415 Способ противоспаечной терапии после хирургического вмешательства
- 2348400 Препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2348386 Способ непроникающего хирургического лечения первичной открытоугольной глаукомы
- 2248213 Лечение Галактозидальной А недостаточности
- 2347586 Микрофлюидизированные эмульсии типа "масло в воде" и вакцинные средства
- 2147243 Контрастное средство
- 2146526 Лечебный препарат дисбактериоза и урогенитальных инфекций
- 2146148 Терапевтическое применение фактора роста кератиноцитов (ФРК)
- 2146139 Способ повышения активности макрофагов и комбинации для его осуществления
- 2346277 Способ диагностики специфического синовита
- 2345793 Ультразвуковые контрастные вещества и их получение
- 2345782 Терапевтические комбинации на основе PORIFERA для лечения и предотвращения кожных заболеваний
- 2245131 Способ коррекции косметических недостатков кожи
- 2245130 Способ активации восстановительных процессов в коже
- 2144833 Хондроитиназа
- 2344809 Получение твердых дозированных форм с использованием сшитого нетермопластичного носителя
- 2244540 Косметический гель для ухода за кожей лица
- 2244536 Способ лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний тазобедренного сустава
- 2344167 Хмелевый экстракт
- 2143884 Агент регулирования дифференциации клеток кожи, культурная среда для клеток или тканей и способ регулирования дифференциации клеток кожи
- 2343932 Способ получения обладающих пониженной растворимостью в воде пленночных материалов
- 2343903 Устройство доставки лекарств для контролируемого введения препаратов
- 2048817 Способ получения материала для лечения ожогов и гнойно - некронических ран
- 2048803 Гидратантный крем
- 2242974 Средства и способы лечения воспалительных заболнваний
- 2142816 Способ получения антигерпетической вакцины
- 2342923 Средство для обработки рук с увлажняющим эффектом
- 2142781 Косметика для макияжа ресниц и бровей и агент ингирирующий рост микроорганизмов в косметических средствах
- 2242251 Трансплантируемые стенты с биоактивными покрытиями
- 2142257 Способ обработки глазных имплантантов и контакных линз
- 2342389 Мононатриевая соль
- 2342107 Способ устранения западения верхнего века при анофтальме
- 2141828 Средство, пролонгирующее эффективность чесночного порошка
- 2241489 Косметическое средство матриксных протеинов для залечивания ран
- 2241443 Средство для лечения герпеса
- 2241414 Способ получения протезов кровеносных сосудов
- 2341539 Гидрогель
- 2141324 Регулятор скорости воздействия препарата для инъекций
- 2141312 Косметическое средство для ухода за кожей лица
- 2341296 Средства и способы покрытия медицинских имплантантов
- 2341272 Средство для неспецифической иммунотерапии
- 2341266 Стенты с нанесенным покрытием содержащим N - (5-(4-(4-
- 2341257 Иммуномодулирующее средство
- 2341255 Средство для лечения климактерических расстройств
- 2240821 Способ лечения урологических инфекций
- 2140786 Способ лечения лишая
- 2140243 Способ хирургического лечения диабетической ретинопатии и отслоек сечатной оболочки
- 2240140 Медицинская многослойная повязка и изделия на ее основе
- 2240135 Культура клеток, содержащая клетки - предшественники остеонегеза, имплантант на ее основе и его использование для восстановления целостности кости
- 2240123 Экзогенные биологически активные коньюгирующие вещества
- 2139886 Фотоотвержаемое производное гликозаминогликата, сшитое производное гликозаминогликата и способы их получения, способ предотвращения клеточной и тканевой адгезии
- 2139729 Вакцина. Способ стимулирования иммунной системы
- 2339386 Средство обладающее радио - и химиозащитным действием
- 2339369 Лечение офтальмологических нарушений с использованием мочевины и ее производных
- 2139041 Гидратантный регенерирующий крем и способ его получения
- 2139039 Косметический суперкрем для ухода за кожей
- 2139017 Способ получения боисовместимого материала
- 2138503 Производные камптотецина, способы их получения, уникальное средство
- 2338556 Средство содержащие антагонист Р2Х - рецептора и нестероидное противоспалительное лекарственное средство
- 2338514 Косметическое средство для профилактики старения кожи
- 2138297 Медицинские устройства, подверженные вызываемому разложению
- 2138295 Покрытие для ран
- 2337906 Ингибиторы цитозольной фосфолипазы А2 Применение физиологически допустимого корпускулярного ферримагнитного или ферромагнитного материала. Способ формирования магнитометрического изображения
- 2137501 Устройство формирования изображения
- 2137477 Способ лечения заболеваний характеризующихся аутоиммунной агрессией
- 2137467 Крем для кожи лица и тела
- 2137449 Способ коррекции дефектов преломления в глазу млекопитающего
- 2137402 Пищевая Добавка БАД
- 2336899 Способ стимуляции миелопоэза
- 2336862 Способ получения раствора для лечения роговицы
- 2336830 Способ восстановления костных структур челюсти
- 2136696 Новый полипептид и средство против ВИЧ - Инфекции
- 2336092 Биоадгезивное средство, по существу свободное от воды
- 2336089 Средство и способ лечения заболеваний периодонтальных и пульпы
- 2336074 Средства и способы лечения заднего сегмента глаза
- 2235548 Ранозаживляющее средство
- 2135186 Способ лечения рефлекторных синдромов при остеохондрозе
- 2234945 Стабилизатор водного раствора и водосодержащего сырья
- 2334762 Растворимая ассоциативная карбоксиметилцеллюлоза
- 2234514 Макропористые хитозановые гранулы и способ их получения. Способ культивирования клеток
- 2133615 Средство для лечения неврологических заболеваний
- 2233164 Способ профилактики развития послеоперационных спаек брюшной полости
- 2133127 Неткатный материал, способ его получения и способ лечения
- 2333223 Альдегидные производные сиаловой кислоты и средства на их основе
- 2333007 Полипептидные вакцины для широкой защиты против рядов поколений менингококов с повышенной вирулентностью
- 2332985 Дозированные формы анестезирующих средств с длительным высвобождением для обезболивания
- 2132677 Косметическая маска
- 38603 Пленочный аппликатор
- 2232594 Средство содержащие ингибирующие остеокластогенез фактор и полисахарид
- 2332238 Средство для прокладок, раневых повязок и других изделий, контактирующих с кожей
- 2331668 Стромальные клетки, получение из жировой ткани, для заживления дефектов роговицы и внутриглазных дефектов и их использование
- 2331438 Альфа - 2 - Дельта Лигант для лечения симптомов нижних мочевыводящих путей
- 2331411Электропряденые аморфные фармоцевтические средства
- 2331367 Способ профилактики образования спаек и их рецидива
- 2130767 Масло в воде для получения косметических и дерматологических средств, способ косметической обработки
- 2230752 Поперечносшитые гиалуроновые кислоты и их применение в медицине
- 2230558 Способ восстановления и сохранения здоровья скмьи
- 2230550 Средства длительного высвобождения, способ их получения и применения
- 2230458 Поддержания здоровья суставов
- 2330290 Способ определения состояния метаболических процессов в ткани суставного хряща
- 2230073 Способ поперечного сшивания карбоксилированных полисахаридов
- 2329059 Способ лечения полипозного риносинусита
- 2329037 Комбинированная терапия для лечения иммуновоспалительных заболеваний
- 2128666 Гиалуроновая кислота и ее соли, способ очистки гиалуроновой кислоты, способ получения гиалуроновой кислоты. Фармацевтический препарат с гиалуроновой кислотой и средства с гиалуроновой кислотой используемые в офтальмологии
- 2328740 Способ экспресс - оценки действия зубных паст
- 2128502 Косметический гель
- 2328272 Суппозитории индуктора интерферона
- 2328268 Косметика содержащая амфолитный сополимер
- 2128057 Композиционная мембрана, способ ее получения и способ направленной регенерации тканей с ее применением
- 2128055 Средство замедленного освобождения и способ его получения
- 2128049 Свечи
- 2227743 Полипептидные варианты с повышенной гепаринсвязывающей способностью
- 2326893 Ковалентное и нековалентное сшивание гидрофильных полимеров
- 2326697 Новый перевязочный материал для быстрого заживления раневой поверхности кожи
- 2126264 Фармацевтическое средство с гиалуроновой кислотой
- 2326137 Способ получения содержащих альгинат пористых формованных изделий
- 2325902 Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани
- 2225195 Репелленты против насекомых
- 2325193 Сосудистый стент
- 2325184 Улучшенные везикулы наружной мембраны бактерий
- 2325153 Многокомпонентная фармацевтическая дозированная форма
- 2325152 Удерживаемая в желудке система регулируемой доставки лекарственного средства
- 2029955 Способ предоперационного определения помутнения задней капсулы хрусталика при экстракции катаракты
- 2324688 Производные бисбензизоселеназолонила с противоопухолевым, противовоспалительным и антитромбоническим действием
- 2323017 Устройство и способ контролируемый доставки активных веществ в кожу
- 2323011 Содержащий Коллаген I и Коллаген II способный к рассасыванию внеклеточный матрикс, предназначенный для реконструирования хряща
- 2322955 Способ изготовления имплантанта для пластики дефектов хрящевой ткани
- 2322454 Антитело против CCR5
- 2322263 Система продолжительного высвобождения растворимого лекарственного средства
- 2221561 Витамин Е и его сложные эфиры
- 2321634 Гены участвующие в метаболизме углерода и продуцировании энергии
- 2321597 Биоматерьял, способ его приготовления и его применение, медицинское средство, имплантант и вкладыш
- 2121340 Средство для похудения
- 2220737 Средство для улучшения состояния опорно-двигательного аппарата
- 2220729 Гель используемый в стоматологии
- 2320720 Способ культивирования фибропластов для заместительной терапии
- 2320378 Накожный аппликатор
- 2320369 Средства, содержащие Альфа - 2 - Дельта Лиганды и ингибиторы обратного захвата серотонина/норадреналина
- 2320362 Местные фармацевтические средства, содержащие проантоцианидины, для лечения дерматитов
- 2320322 Биоадгезивная доставка лекарств
- 2320318 Чувствительное к температуре изменяющие состояние средство гидрогеля
- 2025120 Способ получения препарата, содержащего Фактор /G-CSF/, стимулирующий рост колоний гранулоцитов
- 2319490 Средство для введения железа при лечении синдрома беспокойных ног
- 25995 Содержащее адгезив приспособление для фиксации зубных протезов в полости рта
- 2218907 Средство для ухода за кожей лица и веками
- 2318830 Способ получения модифицированного дерматансульфата
- 2118153 Косметика - туш для ресниц
- 2217441 Способ получения полимера
- 2317296 Изетионатная соль селективного ингибитора CDK4
- 2217171 Мембрана для использования при направленной регенерации тканей
- 2317095 Экстракты ECHINACEA ANGUSTIFOLIA
- 2216332 Препарат для лечения астроза
- 2216314 Крем - маска для обезвоженной кожи
- 2316333 Средство оздоровительно-восстановительных косметических панто-магниевых ванн
- 2021304 Способ получения биологически активного средства
- 2115662 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2315627 Впрыскиваемые имплантанты на керамической основе для заполнения морщин, кожных впадин, шрамов
- 2315623 Средство получаемое путем лиофилизации препарата
- 2114862 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2314791 Лечебно-Косметическое средство
- 2314791 Косметический крем-бальзам для ухода за кожей лица и шеи
- 2214600 Способ оценки эффективности лечения неврологических проявлений
- 2114602 Способ косметической обработки
- 2114587 Раствор для защиты роговицы
- 2214283 Имплантант для подкожного или внутрикожного введения
- 2313370 Медицинские протезы, имеющие улучшенную биологическую совместимость
- 2313356 Препарат для лечения демодекоза
- 2313338 Средство на основе этиллинолеата и триэтилцитрата для лечения себореи и угрей
- 2313328 Косметика содержащая тонкодисперный и пористый порошок
- 2212880 Способ получения препарата содержащего антибиотик, с замедленным высвобождением активного вещества
- 2312640 Способ лечения Блефароконьюнктивальной формы синдрома сухого глаза
- 2017751 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2312145 Гены CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM, кодирующие белки, участвующие в синтезе мембран и мембранном транспорте
- 2311458 Белки вызывающие измененную иммуногенную реакцию. Способ их получения и использования
- 2311183 Улучшенное разделение с использованием гталуроновой кислоты
- 2311177 Ингибиторы интегрина для лечения заболевания глаз
- 2300069 Косметическая маска
- 2211024 Уход за сухой кожей
- 2310440 Раствор для защиты роговицы от повреждений
- 2309684 Лечение межфалангового остеоатроза узелковой формы
- 2309406 Способ мониторинга фиброза печени у больных хроническим гепатитом с (ХГС)
- 2209088 Опосредованная рецепторами доставка генов с использованием векторов на основе бактериофагов
- 2308967 Уменьшение объема ткани
- 2308962 Средство для опорно-дигательного аппарата
- 2308957 Способ получения препарата для мезотерапии
- 2308954 Средство для лечения ран, содержащее плазму или сыворотку крови
- 2308951 Комплексный способ профилактики вагинальных дисбактериозов
- 2308937 Косметическая биологически активная добавка и косметический литофитокомплекс на ее основе
- 2208638 ДНК (варианты), способ получения белка
- 2207885 Способ подачи небольшого объема лечебного раствора к целевому месту
- 2207858 Лишенные побочных эффектов производные простагландинов для лечения глаукомы
- 2207845 Твердая лекарственная форма пролонгированного действия
- 2207844 Препарат для местного неинвазивного применения
- 2207841 Средства с антиферментативным действием
- 2306335 Стволовые клетки и решетки полученные из жировой ткани
- 2306140 Новые рецепторы для Helicobacter pylori и их применение
- 2205612 Способ эндотелизации IN VITRO протезов кровеносных сосудов
- 2105540 Депигментирующее средство
- 2304960 Косметическое средство для кожи
- 2304616 Гены участвующие в гомеостазе и адаптации
- 2204550Способ получения длинноцепочечной N-Ацилированной кислотой Аминокислот
- 2204415 Способ получения изображения
- 2204394 Средство для лечения грибковых инфекций, желудочных язв
- 2204366 Способ хирургического лечения глаукомы
- 2104034 Вагинальное увлажняющие средство, способ его получения
- 2303991 Биологически активная добавка
- 2303990 БАД
- 2303973 Адсорбирующее изделие
- 2203676 Средство обладающее иммунокорригирующим действием
- 2203672 Способ предупреждения беременности
- 2303635 Гены кодирующие белки резистентности и толерантности к стрессам
- 2303529 Способ фиксации альгинатного геля на твердой фазе, способ получения клеточного чипа на его основе
- 2203078 Способ лечения гнойных ран
- 2302412 Гидразоно-малонитрилы
- 2102400 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2202356 Способ стимуляции репаративных процессов длительно незаживающих ран и трофических язв
- 2202336 Средство для ухода за кожей
- 2302231 Глазные капли
- 2102082 Способ магнитометрического исследования тела человека или животного
- 2301814 Полиакриламидный гидрогель
- 2201765 Гибридные матричные имплантанты и эксплантанты
- 2301677 Биотрансплантант для лечения дегенеративных и трвматических заболеваний хрящевой ткани и способ его получения
- 2301676 Способ лечения ревматизма
- 2301674 Способ лечения больных с переломами нижней челюсти
- 2301661 Средство с регулируемым освобождением и способ его получения
- 2005488 Средство для лечения болезней соединительной ткани
- 2200001 Крем для кожи
|
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
|
Патент №2136696 |
(54) НОВЫЙ ПОЛИПЕПТИД И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ПРОТИВ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ
(57) Реферат:
Полипептид формулы A1-Trp-Cys-A2-A3-A3-X-A2-A3-A3-Cyr-A3-А4, где A1 - пептидный остаток, имеющий две основные аминокислоты, выбранные из лизина, аргинина и орнитина, причем остаток, в котором N- атом водорода аминоконца аминокислотного остатка может быть замещен ацильной группой или тиокарбамоильной группой, образует N- замещенный пептидный остаток, N- замещенный замещенной тиокарбамоильной группой пептидный остаток; А2 - остаток тирозина, А3 -остаток лизина или аргинина; А4 - NH2; Х - остаток пептида D-лизил-пролин, пролил-D-лизин, лизил-глицин, D-орнитил-пролин, в которых атом водорода:  -аминогруппы, D-лизина, L-лизина, D-лизина, D-орнитинаил и L-орнитина может быть заменен -аминоацильной группой и пептидный остаток соединен с амино-кислотными остатками в положениях 6 и 8 через пептидную связь per se; Trp - остаток триптофана, Cys - остаток цистеина или его соль, можно применять в фармацевтической композиции в качестве ативирусного агента, например, против ВИЧ-инфекции. 4 c. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл. Данное изобретение касается нового полипептида (полипептидов) или его фармацевтически приемлемой соли, проявляющих сильное сродство к липолисахаридам, в частности эндотоксинам. Полипептид можно применять в фармацевтической композиции в качестве антивирусного агента (например, агента против ВИЧ-инфекции). Из мечехвоста были выделены два семейства антимикробных полипептидов, которые проявляют сродство к эндотоксинам (см., например, Shigenaga et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 21350-21354; Kawano et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 15365-15367; Muta et al., 1990, J. Biol. Chem. 108: 261-266; Japanese Laid-Open Patent Publication N 167230/1990; Japanese Laid-Open Patent Publication N 152987/1990; Japanese Laid-Open Patent Publication N 53799/1990; Published Searched Application 500194/1990; Miyata et al., 1989, J. Bio Chem. 106:663-668; Akaji et al., 1989, Chem. Pharm. Bull. 37:2661-2664; Tokunaga and Iwanaga, 1989, Taisha (Metabolism) 26:429-439; Shieh et al., 1989, FEBS Lett. 252: 121-124; u Nakamira et al. , 1989, J. Biol. Chem. 263: 16709-16713). Одно семейство, семейство тахиплезинов, было выделено из Японского мечехвоста Tachypleus. Были идентифицированы три тахиплезина, I, II и III. Второе семейство, семейство полифемузинов, было выделено из Американского мечехвоста Limubus polyphemus. Были идентифицированы два полифемузина, I и II; их аминокислотные последовательности показаны на фиг. 1. Полипептиды в обоих семействах состоят из 17 или 18 аминокислотиных остатков и имеют 4 консервативных района, общие для всех, и два дисульфидных мостика (см. фиг.1). Было обнаружено, что как тахиплезины, так и полифемизины ингибируют рост грамотрицательных, так и грамположительных бактерий при низких концентрациях, а также грибов, таких как Candida albicans, и образуют комплексы с бактериальными диполисахаридами (Shigenaga et al.m, 1990, J.Biol. Chem. 265: 21350-21354 и Muta et al., 1990, J.Biochem. 108:261-266). Также было обнаружено, что полипептиды в семействе тахиплезинов проявляют некоторую ингибирующую активность в отношении вируса, такого, как вирус гриппа, вирус везикулярного стоматита (Murakami et al., 1991, Chem therapy, 37:327-334) или вирус иммунного дефицита человека (Morimoto et al., 1991, Chemtherapy, 37, 206-211). Очень интересно, что такой полипептид c указанными выше свойствами может быть одним из ключевых веществ, которое позволяет мечехвосту адаптироваться к изменениям в наружной среде их обитания и сохранить их виды с древних времен до настоящего времени в виде живого ископаемого. С другой стороны, что касается выживания высокоэволюционировавших существ, людей, чрезвычайно желательно развитие таких лекарственных средств, которые обладают профилактическим или терапевтическим действием на синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), вызываемый инфекцией вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Авторы данной заявки и сотрудники исследовали корреляцию между молекулярной структурой и анти-ВИЧ активностью этих полипептидов с изменением или модификацией аминокислоты компонентов, обращая внимание на те полипептиды, которые имеют отношение к длительному сохранению мечехвоста. В результате нами были изобретены новые полипептиды, фундаментально отличающиеся от общей структуры таких известных полипептидов мечехвоста. Неожиданно было обнаружено, что эти предшествующие новые полипептиды имеют превосходную биологическую активность. Их величины анти-ВИЧ активности по меньшей мере в 5 или более раз выше, чем эти величины известных полипептидов мечехвоста. Появились следующие публикации: Nakashima et al., 1992, Antimicrob. Agents Chemother., 36:1249-1255; Masuda et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. , 189, 845-850; Tamamura et al., 1993, Chem. Phatm. Bull., 41, 978-980; Tamamura et al., 1993, Biochem. Biophys. Acta, 1163, 209-216; Masuda et al. , 1992, J, Pharmacobio. Dyn., 15, S-90; International Laid-Open Publication WO 92/04374; Jananese Laid-Open Patent Publication N 163298/1993. (Далее среди новых полипептидов соединение T-22 называют соединением наивысшего действия из типичных представителей этих полипептидов). После испытания структурных требований для проявления активности этого нового полипептида, состоящего из 16-18 аминокислот, представленного соединением T-22, заявители и их сотрудники пришли к концепции о минимальной существенной (основной) структуре. Обычно при введении в тело человека экзогенного пептида с относительно высоким молекулярным весом этот пептид часто воспринимается как чуждое вещество функцией защитных сил организма человека. В результате он становится антигенным веществом. При использовании для целей медицины желательно, чтобы биологически активное вещество на основе пептида было низкомолекулярным соединением, чтобы уменьшить вероятность восприятия его в качестве чуждого вещества. Необходимо также, чтобы это вещество имело высокую биологическую активность. Было обнаружено, что соединение T-22 является полипептидом, состоящим из 18 аминокислотных остатков. Целью нашего исследования было сохранение того же самого уровня анти-ВИЧ активности, который имеется у соединения T-22, при уменьшении числа аминокислотных остатков. В результате нам удалось уменьшить число остатков на 4 (четыре). Пока соединение имеет основную структуру, его активность не снижается, даже при модификации специфического района. Кроме того, при помощи такой модификации мы обнаружили новый полипептид, имеющий такую существенную (основную) структуру, который может обеспечить более широкий диапазон физико-химических свойств и также более широкую селекцию в терапевтических способах, т.е. увеличение/уменьшение гидрофильности и липофильности (сродство к липиду); избирательное накопление в определенном органе и (или) в определенной клетке; увеличение/уменьшение времени его нахождения внутри тела человека; и возможное развитие препаратов. Данное изобретение касается нового полипептида (полипептидов), который произведен из уже заявленных новых полипептидов с высокой анти-ВИЧ активностью, основанных на известных полипептидах мечехвоста с высокой аффинностью по отношению к эндотоксинам, но имеет значительное отличие. Прежние новые полипептиды состоят из 16-18 аминокислотных остатков, 4 цистеиновых или 2 цистиновых остатков и антипараллельной  пластинчатой структуры с -витком в качестве положения поворота. Подобно прежним новым полипептидам, полипептиды данного изобретения имеют антипараллельную пластинчатую структуру с возможным -витком, расположенным в X при положении 7. Однако в полипептидах данного изобретения число аминокислотных остатков и число цистеиновых остатков уменьшены на четыре и два соответственно. Кроме того, биологическая активность не уменьшается, даже при модификации специфического района. Полипептиды данного изобретения можно использовать в качестве агента против ВИЧ и в качестве компонента ДНК-трансфицирующих систем для генной терапии. Как будет детализировано в разделе 6, infra, полипептиды данного изобретения имеют анти-ВИЧ величины, которые значительно выше, чем величины прежних новых полипептидов, произведенных из известных полипептидов с высоким сродством к эндотоксинам мечехвоста. 3.1. Определения. Пептидные последовательности, описанные здесь, представлены при помощи трехбуквенных сокращений для аминокислотных остатков и замещенных аминокислотных остатков следующим образом:
Ala (аланин); Arg (аргинин); Cys (цистеин); Ile (изолейцил); Gly (глицин); Leu (лейцин); Lys (лизин); Orn (орнитин); Phe (фенилаланин); Pro (пролин); Trp (триптофан); Tyr (тирозин); Val (валин); D Arg (D-аргинин); D Lys (D-лизин); D Orn (D-орнитин); As-Arg (N- -ацетиларгинин); FTC-Arg (N- -флуоресцеинтиокарбамоиларгинин); Laur-Arg (N-альфа -лауроиларгинин); Myr-Arg (N- -миристоиларгинин); Nicot-Arg (N- -никотиноиларгинин); Oct-Arg (N- -октаноиларгинин); Parm-Arg (N- -пальмитоиларгинин); Parm-Oru (N- -пальмитоилорнитин); PCT-Arg (N- -фенилтиокарбамоиларгинин);  -N-Ac-D Lys ( - N- -аминоацетил-D-лизин) и -N-Beet-G Lys ( -N- -аминобутирил-D-лизин). Следующие термины, примененные здесь, будут иметь указанные значения: HIV = вирус иммунодефицита человека (все разновидности); MOI = множественность заражения; SI = индекс селективности (отношение CC50 к EC50). 4. Краткое описание рисунков
Фиг. 1 показывает аминокислотные последовательности Тахиплезина I, Тахиплезина II, Тахиплезина III, Полифемузина I и Полифемузина II. Консервативные аминокислоты помещены в блоки. Дисульфидные связи между Cys-3 или -4 и Cys-16 или -17 и Cys-7 или -8 и Cys-12 или -13 обозначены толстыми линиями. Фиг. 2 представляет схему синтеза полипептида (1) данного изобретения. Данное изобретение выполнено на основе описанных выше аспектов и касается нового полипептида, представленного формулой I (см. в конце описания), или его соли, в которых
A1 представляет собой остаток основной аминокислоты или остаток пептида, имеющий одну или по меньшей мере две основные аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из лизина, аргинина и орнитина, причем остаток основной аминокислоты или остаток пептида, в котором N- атом водорода амино-конца этого аминокислотного остатка может быть замещен ацильной группой или замещенной тиокарбамоильной группой, образует N- замещенный ацилом основной аминокислотный остаток, N- замещенный ацилом пептидный остаток, N- замещенный замещенной тиокарбамоильной группой основной аминокислотный остаток или N- замещенный замещенной тиокарбамоильной группой пептидный остаток;
A2 представляет собой остаток тирозина или фенилаланина;
A3 представляет собой остаток лизина или аргинина;
A4 представляет собой -OH (происходящий из карбоксильной группы) или -NH2 (происходящий из кислой амидной группы);
X представляет собой остаток пептида, выбранный из группы, состоящей из пептидов, таких как D-орнитил-пролин, пролил-D-орнитин, D-лизил-пролин, пролил-D-лизин, D-аргинил-пролин, пролил-D-аргинин, глицил-орнитин, орнитил-глицин, глицил-лизин, лизил-глицин, глицил-аргинин и аргинил-глицин, в которых атом водорода -аминогруппы D-лизина, L-лизина, D-орнитина или L-орнитина может быть заменен -аминоацильной группой, и этот пептидный остаток соединен с аминокислотными остатками в положениях 6 и 8 через пептидную связь per se;
Trp представляет собой остаток триптофана;
Cys представляет собой остаток цистеина; и остатка цистеина в положениях 3 и 11 могут быть соединены дисульфидной связью. Характерные примеры полипептидов изобретения, представленных формулой (I), показаны в табл. 1 и пронумерованы (1) - (25). Каждый символ обозначает соответствующий аминокислотный остаток при помощи международно признанного трехбуквенного выражения (см. раздел 3.0, supra). Вышеупомянутый полипептид с высокой активностью против ВИЧ состоит из 16 - 18 аминокислотных остатков. В случае соединения наилучшего способа действия (далее сокращаемого как "n-18 полипептид" или Т-22) обращается внимание на то, что структурным фактором, существенным для проявления высокой активности, является присутствие четырех остатков цистеина, четырех или пяти остатков ароматических аминокислот, восьми остатков основных аминокислот и одного остатка глицина. Кроме того, что касается позиционной взаимосвязи n-18 полипептида, как показывает формула (A), свойства аминокислотных остатков при положениях 2-17 прочно фиксированы. И при положении 1-18 полипептида была обнаружена корреляция структуры с активностью, выражающаяся в том, что относительные величины проявляемой анти-ВИЧ активности увеличиваются с увеличением числа аминокислотных остатков. Полипептид n-18 выражают в виде формулы (A) (см. в конце описания). в которой A1 обозначает не более двух аминокислот, выбранных из группы, состоящей из лизина и аргинина; A2 обозначает остаток тирозина, фенилаланина или триптофана; A3 обозначает остаток аргинина или лизина; A4 обозначает по меньшей мере одну или не более двух аминокислот, выбранных из группы, состоящей из лизина и аргинина; A5 обозначает -OH (происходящий из карбоксильной группы); или -NH2 (происходящий из амидной группы); Cys обозначает остаток цистеина; Gly обозначает остаток глицина. В характерном варианте остатки цистеина в положениях 3 и 16 и (или) остатки цистеина в положениях 7 и 12 могут быть соединены дисульфидной связью (-S-S-). В полипептиде n-18 положение поворота с возможной структурой -витка находится при положениях 9 и 10. И пептидная часть от положения 3 до положения 8 и часть пептида от положения 11 до положения 16 обращены друг к другу. Подобно полипептиду n-18, полипептиды данного изобретения имеют антипараллельную -пластинчатую структуру, обусловленную существованием внутримолекулярных водородных связей и дисульфидных связей (-S-S-) между остатками цистеина. Хотя в полипептидах данного изобретения положение поворота с возможной структурой -витка расположено в X при положении 7, так что часть пептида от положения 3 до положения 6 и часть пептида от положения 8 до положения 11 обращены друг к другу. В данном изобретении корреляция числа аминокислотных остатков при положении 1 формулы данного изобретения с активностью такая же, какая установлена для полипептида n-18. Подтверждено, что замена атома водорода -аминогруппы N-концевого остатка аминокислоты в этом положении ацильной группой или замещенной тиокарбамоильной группой важна для проявления высокой активности против ВИЧ нового полипептида, представленного указанной формулой. Путем подбора различных свойств ацила или замещенной тиокарбамоильной группы стало возможным придание новому полипептиду гидрофильности, сродства к липидам, отличающихся свойств флуоресценции и т.д. Например, характеристики флуоресценции замещенной флуоресцеином тиокарбамоильной группы в полипептидах данного изобретения можно использовать в качестве высоко чувствительного репортерного красителя для различных целей. См., например, Brand and Withold in "Metods in Euzymology", Vol. 11, p. 776 - 856, ed. by Hirr, Academic Press, New York, New York (1967); Brand and Gohlke, 1972, Annu. Rev. Biochem. 41: 843 - 868; Stryer, 1978, Annu. Rev. Biochem. 47: 819 - 846. Кроме того, очень важно и ценно, что замещенные флуоресцеином полипептиды данного изобретения могут проявлять даже более высокую активность против ВИЧ. Таким образом, полипептиды изобретения со свойствами флуоресценции могут быть использованы в качестве важного инструмента для выяснения механизма манифестации активности против ВИЧ полипептидов изобретения. Например, судьба, метаболизм или распределение внутри тела, органа, ткани или клетки, инфицированных или неинфицированных ВИЧ, после введения может быть детектирована при помощи флуоресцентной микроскопии. На молекулярном уровне информация о тончайших конформационных изменениях этих полипептидов, взаимодействующих с рецепторной молекулой внутри клеток, может быть получена путем применения внутренних флуоресцентных зондов этих полипептидов. С применением таких флуоресцентных зондов возможны выделение и идентификация самой молекулы рецептора. Далее, при помощи ацильной группы или замещенного тиокарбамоила стало возможным получить биологическую активность новых полипептидов у соединений, таких, как соединения с сахарной цепью, липидные соединения, нуклеиновые кислоты, другие типы пептидов или белков и т.д. Важную роль в манифестации активности нового полипептида данного изобретения играет то, что свойства аминокислотных остатков при положениях 4 - 6 и положениях 8 - 10 формулы изобретения являются одними и теми же. Что касается образования трехмерной структуры нового полипептида изобретения, важен порядок аминокислот пептида, который легко образует структурные части пептида, представленные в положениях 3 - 7 и в положениях 7 - 11 в виде одной и той же плоской структуры, расположенной напротив друг друга, а пептидный остаток, состоящий из двух аминокислот, обозначенных X, в положении 7 является точкой поворота. В случае, когда цистеины при положениях 3 и 7 соединены дисульфидной связью, трехмерная структура, образованная пептидным каркасом нового полипептида данного изобретения, является важной чертой изобретения. Следует сказать, что повернутая структура полипептидого остатка X при положении 7, состоящего из пары глицин и основная аминокислота или пролин и D-форма основной аминокислоты (в принципе, гидроксипролин может быть заменен пролином, имеющим тот же самый эффект), является необходимым фактором для образования той же самой плоскостной структуры с -пластинчатой структурой. Соединенные дисульфидной боковой цепью положения 3 и 11 остатков цистеина и основные боковые цепи основных аминокислот в положениях 5 и 6 находятся на одной и той же стороне каркасной плоскости, тогда как ароматические боковые цепи остатков ароматических аминокислот в положениях 6 и 10 находятся на противоположной стороне плоскости каркаса. Образование этой трехмерной указанной выше структуры является важным. Поэтому новый полипептид, представленный указанной выше формулой, был изобретен с такой трехмерной структурой, приведшей к уменьшению на четыре аминокислотных остатка по сравнению с полипептидом n-18. Кроме того, подобно полипептиду (полипептидам) n-18, полипептиды данного изобретения проявляют очень основные свойства. Благодаря их основной природе, эти полипептиды могут образовать соль с кислотой. Например, такой полипептид образует соль с неорганической кислотой (соляной кислотой, бромистоводородной кислотой, фосфорной кислотой, азотной кислотой, серной кислотой или т.п.) или с органической карбоновой кислотой (уксусной кислотой, галогенуксусной кислотой, такой, как трифторуксусная кислота, пропионовой кислотой, малеиновой кислотой, янтарной кислотой, яблочной кислотой, лимонной кислотой, винной кислотой, салициловой кислотой) и кислым сахаром (глюкуроновой кислотой, галактуроновой кислотой, глюконовой кислотой, аскорбиновой кислотой или т.п.), кислым полисахаридом (гиалуроновой кислотой, сульфатом хондроитина, альгиновой кислотой или т.п.) или органической сульфоновой кислотой (метансульфоновой кислотой, п-толуолсульфоновой кислотой или т. п. , в том числе с эфиром сульфоновой кислоты и сахара, таким, как сульфаты хондроитина). Далее следует более детальное описание нового полипептида данного изобретения. Получение полипептидов. Новый полипептид изобретения может быть получен известными в этой области способами, например способами твердофазного синтеза, описанными в "Solid-Phase Peptide Synthesis", Stewart and Young, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984). А именно, полипептид с прямой цепью данного изобретения указанной выше формулы (I) можно получить путем соединения карбоксильной группы N-защищенного аргинина при положении 12 с нерастворимой смолой, имеющей аминогруппы, присоединенные непосредственно или присоединенные через спейсер, имеющие функциональную группу, способную соединяться с карбоксильной группой (например, функциональную группу, способную превращать карбоксильную группу аргинина в п-карбоксиметилбензиловый эфир). Аминогруппа нерастворимой смолы, имеющая остаток аргинина (Arg) в положении 12, после деблокирования N-защищающей группы способна успешно соединяться, согласно твердофазному способу, с соответствующими защищенными аминокислотами положения 11 к положению 1 аминокислотной последовательности, представленной формулой (I) (см.в конце текста). где A1, A2, A3, A4, Cys, Trp и X означают то же, что и в приведенной выше формуле (I). В случае, когда N- -ациламинокислотный остаток или ацилпептидный остаток выбран для A1, в которых атом водорода при N- -положении аминоконцевого аминокислотного остатка заменен ацильными группами, N-концевая аминогруппа содержащей пептид смолы ацилируется соответствующим ангидридом карбоновой кислоты или соответствующей кислотой с применением конденсирующих агентов с ацильной группой для получения N-ацил-пептидной смолы. Путем последующего отщепления нерастворимой смолы и защитных групп на аминокислотах можно получить полипептид с прямой цепью данного изобретения, имеющий указанную выше формулу (I). В случае, когда N- -замещенный тиокарбамоиламинокислотный остаток или N- -замещенный тиокарбамоилпептидный остаток выбран в A1 вышеупомянутой формулы, где атом водорода в положении N- аминоконцевого аминокислотного остатка заменен замещенными тиокарбамоильными группами, N-концевой N- -замещенный тиокарбамоил-полипептид данного изобретения может быть получен реакцией с замещенным изотиоцианатным соединением при слабощелочных условиях. В этом случае карбоксильный конец аминокислотного остатка в положении 12 может быть либо свободен (A4 соответствует -OH), либо превращен в амид кислоты (A4 соответствует -NH2). Далее, в полученном полипептид два цистеина в положениях 3 и 11 могут образовать дисульфидную связь (-S-S-) через меркаптогруппы. Эта дисульфидная связь может быть образована окислением кислородом воздуха или по способу Atherton, E. et al., 1985, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 2065. Если нет других указаний, отдельная аминокислота, применяемая в упомянутом выше твердофазном способе, представляет собой L-форму, а основная аминокислота, соединенная с пролином в положении 7, обозначенном X, может быть только в D-форме. Любая нерастворимая смола, имеющая аминогруппы, может быть использована в синтезе нового полипептида данного изобретения, если она может соединяться через ее аминогруппу с карбоксильной группой N-защищенного аргинина или лизина при C-конце или в некоторых случаях с крабоксильной группой спейсера, соединенного с ней, и после этого может быть удалена. Примеры таких нерастворимых смол включают в себя (но не ограничены ими) аминометильные смолы (аминометилированные сополимеры стирола и бензола), бензгидриламиновые смолы и их производные. При использовании бензгидриламиновой смолы, метилбензгидриламиновой смолы, диметоксибензгидриламиновой (DMBHA) смолы или аминометилфеноксиметильной смолы амид получают непосредственно путем отщепления, но ввиду большего выхода предпочтительна аминометильная смола. В качестве спейсера, имеющего функциональную группу, способную соединяться с карбоксильной группой или имеющую карбоксильную группу, может быть применен спейсер, способный превращать карбоксильную группу аргинина в п-карбоксиметилбензиловый эфир, однако особых ограничений в отношении спейсера нет. Защищенная аминокислота представляет собой аминокислоту, функциональные группы которой могут быть защищены защитной группой при помощи известных способов, или различные защищенные аминокислоты могут быть приобретены в фирмах. Специалистам в данной области понятно, что способы синтеза полипептидов требуют применения защитных групп для стабилизации лабильной боковой цепи от химического изменения во время процесса синтеза. Защитную группу для -аминогруппы аминокислоты выбирают из группы, включающей в себя (но не ограниченной) Вoc(т-бутилоксикарбонил) или Fmoc (9-фторенилметилоксикарбонил). Защитная группа для гуанидиногруппы аргинина (Arg) выбрана из группы, включающей в себя (но не ограниченной) Tos (тозил), NO2(нитро), Mtr (4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонил) или Pmc (2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил). Защитная группа для меркаптогруппы цистеина (Cys) может быть выбрана из группы, включающей в себя (но не ограниченной) Bzl (бензил), MBzl (4-метоксибензил),4-MeBzl (4-метилбензил), Acm (ацетамидометил), Trt (тритил), Npys (3-нитро-2-пиридинсульфенил), t-Bu (T-бутил) или t-Bus (т-бутилтио) и Mbzl, 4-MeBzl, Trt, Acm и Npyc являются предпочтительными. Защитную группу для гидроксигруппы тирозина (Tyr) выбирают из группы, включающей в себя (но не ограниченной) Brl, C12Bzl (2,6-дихлорбензил) или t-Bu, и гидроксигруппа может быть незащищенной. Защитную группу для -аминогруппы лизина (Lys) выбирают из группы, включающей в себя (но не ограниченной) Z (бензилоксикарбонил), C/Z (2-хлорбензилоксикарбонил), Boc или Npys. В случае атома водорода -аминогруппы боковой цепи D-или L-лизина, совпадающего с X в положении 7, эта аминогруппа может быть защищена Z, C/Z, Boc или Npys. Предпочтительно выбирать из этих защитных групп такие, о которых известно, что они пригодны для условий синтеза. Соединение защищенных аминокислот можно проводить конденсационными методами, известными в этой области, например, такими как ДСС (дициклогексилкарбодиимидный) метод, D/PCD/ (диизопропилкарбодиимидный) метод (Tartar, A. et al., 1979, J. Org. Chem. 44:5000), метод активного эфира, метод с применением смешанного D или симметричного ангидрида карбоновой кислоты, карбонилдиимидазольный метод, DCC-HOBt (1-гидроксибензотриазольный) метод (Konig W. et. al., 1970, Chem. Ber, 103: 788, 2024, 2034) или дифенилфосфорилазидный метод, но предпочтительно при помощи DCC метода, DCC-HOBt метода, D/PCD/-HOBt метода или метода с применением симметричного ангидрида карбоновой кислоты. Реакцию конденсации можно проводить в органическом растворителе, таком, как дихлорметан, диметилформамид, N-метилпирролидон (NMP) или смешанном из них растворителе. Деблокирующий реагент, такой, как трифторуксусная кислота/дихлорметан, HCl /диоксан, пиперидин/диметилформамид (DMF) или NMP применяют для деблокирования защитной группы для -аминогруппы. За степенью прогресса реакции конденсации в каждой стадии синтеза следят при помощи способа E. Kaiser et al., 1970, Anal. Biochem 34, 595 (способ с применением нингидриновой реакции). Согласно предшествующим способам может быть получена смола с защищенным пептидом, имеющим желаемую аминокислотную последовательность. При применении в качестве нерастворимой смолы производного аминометильной смолы защищенный полипептид может быть удален из смолы обработкой ее подходящим растворителем. Полученный защищенный пептид затем обрабатывают фтороводородом для получения амида полипептида, представленного приведенной выше формулой и свободного от всех защитных групп. При применении в качестве нерастворимой смолы бензгидриламиновой смолы, метилбензгидриламиновой смолы, аминометилфеноксиметильной смолы или DMBHA смолы (Funakoshi, S. et al, 1988, J. Chem. Sos., Chem. Commun., 382) полипептид может быть удален из смолы и одновременно защитные группы могут быть удалены из полипептида путем обработки смолы с защищенным полипептидом фтороводородом, TPMSA (трифторметансульфоновой кислотой) (Yajima, H.et al; "The Peptids", vol. 5, p. 65 (1983), Publishem by Academic Press, edited by E. Gross), TMSTf (тиметилсилилтрифлатом) (Fujii, N, et. al., 1987, J.Chem.Soc., Chem. Commun 274) или THSBr, (триметилсилилбромидом) (Fujii, N, et al., 1987, Chem. Pharm. Ball, 35, 3880) или т.п. В предпочтительном варианте полученный полипептид восстанавливают 2-меркаптоэтанолом, ДТТ (дитиотреитолом) или т. п. для гарантии того, что меркаптогруппы цистеинов находятся в восстановленном виде. Меркаптогруппы могут затем быть окислены для получения циклического полипептида. Окислительную обработку можно проводить известным способом. Обычно применяют такой окислительный агент, как воздух или феррицианат (например, феррицианид калия). Альтернативно полипептид (полипептиды) данного изобретения могут быть получены при помощи технологии рекомбинантных ДНК. В соответствии с этим нуклеотидные кодирующие последовательности для полипептида (полипептидов) могут быть клонированы и экспрессированы при помощи известных способов. См. , например, Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N 9, 1991. Полипептиды изобретения могут быть выделены и очищены способами, известными в данной области для полипептидов, например при помощи экстракции, перекристаллизации, различных хроматографических способов (гель-фильтрации, ионообменной хроматографии, распределительной хроматографии, адсорбционной хроматографии, хроматографии с обращенной фазой), электрофореза, противоточного распределения и т.д. и жидкостной хроматографии высокого разрешения, которая является наиболее эффективной. Применение полипептидов. Полипептид (полипептиды) изобретения, представленные формулой (I), обладают способностью связываться с эндоксинами, антибактериальной активностью и активностью гемолиза чувствительных к эндотоксинам гемоцитов (форменных элементов крови). Кроме того, они обладают антивирусной активностью. В характерном варианте полипептиды изобретения имеют активность против ВИЧ. Как будет описано в деталях в разделе 6, полипептиды изобретения проявляют значительно более высокую анти-ВИЧ активность, чем известные полипептиды с высокой аффинностью в отношении эндотоксинов (например, Тахиплезины I, II или III или Полифемузины I или II). Недавнее развитие систем доставки, способных эффективно вводить ДНК в клетку-мишень, сделало практической генную терапию человека для генетических заболеваний, рака, СПИДа и т.д. (Morgan and Anderson, Annu. Rev. Biochem., 62, 191-217 (1993)). ДНК-трансфекционные системы предусматривают применение поликатионов, фосфата кальция, слияния липосом, ретровирусов, микроинъекции, электропорации и слияния протопластов. Однако все эти способы страдают от одной или нескольких проблем, относящихся либо к клеточной токсичности, слабой воспроизводимости, неудобству, либо к неэффективности доставки ДНК (Flegner et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 84, 7413-7417 (1987)). Недавно было сообщено о высокоэффективном способе трансфекции ДНК с применением катионного комплекса липид-ДНК или комплекса амфипатический пептид-ДНК (Legendre and Szoka, Jr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 983-897 (1993)). Пептиды, которые могут образовать трансфицирующий комплекс с ДНК, включают в себя грамицидин S, тироцидин, полимиксин В, полилизин и мелиттин, все они имеют катионную природу. Среди них наиболее эффективным катионным пептидом является грамицидин S, который известен как амфипатический циклический декапептидный антибиотик с -пластинчатой конформацией и может делать проницаемыми и разрушать клеточные мембраны. Считают, что как положительный заряд, так и амфипатический характер грамицидина S важны для высокого уровня трансфекции. С учетом этих структурных характеристик полипептида данного изобретения могут быть альтернативным кандидатом для образования комплекса с ДНК с высокой трансфицирующей способностью, вследствие их сильной катионной и амфипатической природы с -пластинчатой конформацией. Действительно, тахиплезин I, одна из родительских молекул полипептидов данного изобретения, может проникать через мембраны и связываться с ДНК подобно грамицидину S (Matsuzaki et al. , Biochem. Biophys. Acta, 1070, 259-264 (1991) и Yonezawa et al., Biochemistry, 31, 2998-3004 (1992). Кроме того, было подтверждено, что структура Т-22, одного из полипептидов этого изобретения (I), очень похожа на структуру Тахиплезина I с амфипатической антипараллельной -пластинчатой структурой (Tamamure et al., Biochem. Biophys. Acta, 1163, 209-216 (1993)). Таким образом, полипептиды данного изобретения могут быть использованы в качестве компонента ДНК-трансфицирующих систем для генной терапии. Поэтому полипептиды данного изобретения могут быть использованы в фармацевтической композиции, содержащей полипептид (полипептиды) изобретения или их соль и фармацевтически приемлемый носитель, выбранный в соответствии со способом введения и формой введения этой фармацевтической композиции. Фармацевтическими носителями могут быть такие фармацевтически совместимые буферы, как раствор Хенка или Рингера, физиологический раствор, смесь, содержащая солевой раствор и глюкозу, и гепаринизированный раствор цитрата натрия - лимонной кислоты - декстрозы. Фармацевтическую композицию вводят перорально или парентерально в соответствии с объектом лечения. Композиция может быть приготовлена в виде таких препаратов, как порошок, гранулы, раствор для инъекции или для перорального введения, таблетки, суппозитории, пессарии, мазь, крем или аэрозоль, с применением подходящих носителей в соответствии со способом введения. При прямом введении фармацевтической композиции в виде инъекции больному полипептид или его соль могут вводиться непрерывно или прерывисто в количестве 10 - 5000 мг на кг веса тела больного и на один день и при помощи капельного внутривенного вливания в виде растворов в физиологическом растворе. 6. Примеры. Далее изобретение описано в примерах, которые не предназначены для ограничения данного изобретения. В приведенных здесь примерах описан синтез полипептида (I). Кроме того, описаны результаты определений активности против ВИЧ для полипептидов изобретения и известных полипептидов с высокой аффинностью в отношении эндотоксинов. Полипептиды данного изобретения имеют значительно более высокую активность против ВИЧ, чем известные полипептиды с высокой аффинностью в отношении эндотоксинов. В следующих далее примерах применяли следующие устройства и реагенты:
Прибор для жидкостной хроматографии высокого давления Shimadzu Corporation, Model LC-6A
Колонка прибора: Asahipak ODP-90 (Asahi Chemical Industry Co, Ltd). Fmoc аминокислота и амино-смола: изготовленная Watanabe Chemical Industries, Ltd. Конденсирующий агент: изготовленный в Peptide Institude, INC and Applied Biosystems Japan. FAB-MS (FAB - масс-спектрометр): VC Co. (USA), Mod ZAB-SE DMF-диметилформамид
Пример 1: синтез полипептида (1)
Синтез полипептида (1)(имеющий формулу, представленную в конце описания) в разделах 6.1.1 - 6.1.7, infra. Полипетпиды (2-13, 22, 23) и предшественники-пептиды полипетпидов (14 - 21, 24, 25) (см. табл. 1 в конце текста, supra в отношении структур) синтезированы при помощи сходных процедур. В формуле (1). Arg, Trp, Cys, Tyr, Lys, DLys и Pro обозначают упомянутые выше аминокислотные остатки, а линия между Cys в положениях 3 и 11 обозначает дисульфидную связь. Введение в аминометильную смолу Fmoc-DMBHA-CH2CH2COOH
6.1.1. [(3-( -Fmoc-амино-4-метоксибензил)-4- метоксифенил)пропионовой кислоты]. 270 мг (0,2 ммоль) аминометильной смолы (0,74 мэкв/г) и 268,5 мг (0,5 ммоль, 2,5 эквз.) Fmoc-DMBHA-CH2CH2COOH (мол. маса 537) помещали в колонку для твердофазного синтеза и конденсационную реакцию проводили в течение 2 часов по методу D|PCD| - HOBt в DMF согласно Guo, L. et. al., (Chem. Pharm. Bull 36, 4989, (1988)). После завершения реакции конденсации проводили реакцию сочетания для защиты свободных аминогрупп с применением уксусного ангидрида (смола DMBHA). 6.1.2. Введение аргинина в положении 12 в смолу DMBHA. После удаления Fmoc групп из смолы DMBHA, приготовленной в разделе 6.1.1. , supra, смесью 20% пиперидин/DMF 2,5 эквивалента (экв) Fmoc - Arg (Pmc)-OH в расчете на смолу DMBHA добавляли и проводили реакцию конденсации в DMF согласно D|PCD|-HOBt по способу. Степень прогресса реакции конденсации прослеживали при помощи нингидринового теста Kaiser, E. et. al. [Anal. Biochem. 34, 595 (1980)]. Введение цистеина в положение 11
После удаления Fmoc групп из смолы DMBHA, приготовленной в 6.1.2, при помощи смеси 20% пиперидин/DMF 2,5 экв Fmoc-Cys(Trt)-OH в расчете на смолу DMBHA добавляли и реакцию конденсации проводили в DMF по методу D|PCD|-HOBt. Степень прогресса реакции конденсации прослеживали, как в 6.1.2, supra при помощи нингидринового теста. Введение аминокислот в положениях 10 - 1
Так же, как описано выше, Lys(Boc), Arg(Pmc), Tyr(tBu), Pro, DLys(Boc), Lys(Boc), Arg(Pmc), Tyr(tBu), Cys(Trt), Trp, Arg(Pmc) и Arg(Pmc) последовательно вводили в смолу DMBHA для получения смолы с защищенным защитными группами пептидом (I). Каждую реакцию конденсации аминокислот в твердофазном синтезе проводили в соответствии с рабочими условиями табл. 2. Получение полипептида (I) путем удаления защитных групп, удаления полипептида (I) из смолы и частичной очистки
Смолу с защищенным защитными группами полипептидом (I) подвергали обработке смесью 20% пиперидин/DMF для удаления Fmoc из группы и затем подвергали реакции при 25oC в течение 2 часов в системе 1M TMSOTf-тиоанизол/TFA (трифторуксусная кислота) (10 мл трифторуксусной кислоты в присутствии м-крезола (100 экв. ) и этандитиола (300 экв.)) на 100 мг смолы. Затем смолу отфильтровывали от реакционной смеси и промывали дважды 1 мл трифторуксусной кислоты. Затем к смеси фильтрата и промывки добавляли 100 мл охлажденного на льду сухого эфира. Образовавшийся осадок центрифугировали и осадок отделяли от супернатанта декантацей. Полученный осадок промывали холодным эфиром, растворяли в 10 мл 4N AcOH и добавляли 830 мг, 80 экв. дитиотреитола. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционный раствор центрифугировали, супернатант обрабатывали Сефадексом G-10 (3,7 x 5 см), подвергали гель-фильтрации с 4N уксусной кислотой (AcOH) и собирали протекающие через Сефадекс фракции в виде основной части элюата и лиофилизировали, получая в виде порошка частично очищенный нециклизованный полипептид (I). Получение полипептида (I) окислением кислородом воздуха
Половинное количество протекающей через Сефадекс при гель-фильтрации фракции доводили до pH 7,5 концентрированным водным аммиаком и подвергали окислению кислородом воздуха путем аэрации для проведения реакции циклизации. После завершения окисления кислородом воздуха циклизованный полипептид (I) адсорбировали на 10 г смолы Diaion HP-20 и затем элюировали 60% CH3CN (в 1 N AcOH). Элюат концентрировали при комнатной температуре при пониженном давлении для удаления CH3CN и затем лиофилизировали, получая порошок. Порошок растворяли в небольшом количестве воды и раствор наносили на колонку Asahipak ODP-90 и очищали жидкостной хроматографией высокого разрешения (HPLC-Model LC-6A, получаемая Shimadzu Corp.) с применением градиентной элюции при помощи CH3CN, получая единственный пик полипептида (I) с выходом 27% (величина рассчитана на основе смолы с защищенным защитными группами полипептидом (I). Анализ полипептида. Было обнаружено, что аминокислотный состав после кислотного гидролиза по методу Liu et al., [J. Biol. Chem., 251 1936 (1976)] и аминокислотный состав, полученный расщеплением лейцинаминопептидазой полипептида, очищенного, как описано в разделе 6.1.6, хорошо соответствует рассчитанным величинам аминокислотного состава, основанного на аминокислотной последовательности формулы (I). Далее, величина мол. массы, полученная при помощи FAB-MS была 1996,3, тогда как рассчитанная величина [M + H]+ равна 1996, 1. Удельное вращение []2D0: полученного полипептида было -17,2o(C=0,11, 1N уксусная кислота). Пример 3: синтез полипептида (14) [N- ацетилирование аминоконцевого аминокислотного остатка полипептида (1)]. Синтез полипептида (14) формулы 9 описан в разделах 6.2.1-6.2.2. [Формула 9](см. в конце текста). В этой формуле (14)Ac-Arg, Arg, Trp, Cys, Tyr, Lys, D Lys и Pro обозначают упомянутые выше аминокислотные остатки и линия между Cys в положениях 3 и 11 обозначает дисульфидную связь. Ацетилирование смолы с частично защищенным защитными группами пептидом (I). 1,301 г (0,25 ммоль) смолы с защищенным защитными группами пептидом (I), полученной в стадии (4) (Раздел 6,1.4) примера 1, брали в реакционный сосуд для проводимого вручную твердофазного синтеза. После удаления Fmoc группы N-концевую аминогруппу ацетилировали по методу Hudson [J.Org. Chem. 53, 617, (1988)] , получая 1,241 г смолы с пептидом (1), защищенным ацетилированной N-концевой аминокислотной защитной группой (выход сухого веса 100%). Процедура суммирована в табл. 3. Ацетилирование проводили повторением операций 1 -3 до тех пор, пока нингидриновая реакция не переставала быть положительной. Получение пептида (14) путем удаления защитных групп и смолы из смолы с пептидом (1), защищенным ацетилированной N-концевой аминокислотной защитной группой частичной очистки и окисления
Полипептид (14) получали так же, как описано в 6.1.6 supra .Удельное вращение []2D0 полипептида (14) было -18,3o (C=0,08, 1N уксусная кислота). Полипептид (14) гидролизовали кислотой в 4 М метансульфоновой кислоте, содержащей 0,2% триптамин, при 115oC в течение 24 часов согласно методу Liu et al. [J.Biol. Chem. 251, 1936 (1976)]
Результат аминокислотного анализа хорошо согласовался с рассчитанными величинами. Пример 4: синтез полипептида (19) [N- флуоресцеинтиокарбамоилполипептида (1)]. Синтез полипептида (19)) формулы 10 проводили путем N- флуоресцеинтикарбамоилирования аминоконцевого аминокислотного остатка полипептида (1). [Формула 10] (см. в конце текста). В формуле (19) FTC-Arg, Arg, Trp, Cys, Tyr, Lys, D Lys и Pro обозначают упомянутые выше аминокислотные остатки и твердая линия между Cys в положениях 3 и 11 обозначает дисульфидную связь. 10 мг (3,9 мкмоль) соли уксусной кислоты полипептида (1), полученной в 6.1.6, растворяли в 1 мл PBS буфера (солевой раствор с фосфатным буфером, pH 7,5). К этому раствору добавляли 2,8 мг (7,2 мкмоль) изомера-1 флуоресцеинизотиоцианата (FITC) (Wako Pure Chemical Ind., Ltd), растворенного в 1 мл DMSO, при охлаждении на льду. После 6 - 7 часов перемешивания при комнатной температуре свободная аминогруппа была флуоресцеинтиокарбамоилирована. Реакционную смесь наносили на колонку Сефадекса G-25 (fine) [уравновешенную 50 мМ PB (фосфатным буфером), pH 4,2], предварительно обессоленную, и фракционировали. Пептидную фракцию поглощали на Sep-Pak C 18 plus ENV cartridge колонке (Millipore Co), элюировали раствором 80% ацетонитрил/уксусная кислота с pH 4,2 и лиофилизировали, получая 3,93 мг соли уксусной кислоты полипептида (19) (выход 35%)
Удельное вращение []2D0 соли уксусной кислоты полученного полипептида (19) было -5,9o (C=0,06, H2O). Аминокислотный анализ кислотного гидролизата этого соединения по методу Liu показал на 1 меньшее число остатков аргинина, чем рассчитанная величина для политпептида (1). При помощи тонкослойной хроматографии (н-бутанол: уксусная кислота:вода= 4: 1: 1) частичных кислотных гидролизатов этого соединения в трифторуксусной кислоте (комнатная температура, в течение 2 часов) обнаружили одно основное пятно, которое соответствует пятну FTH-Arg (флуоресцеинаргинин-тиогидантоина). Результаты этих анализов свидетельствует о том, что аминогруппа N-концевого остатка аргинина избирательно тиокарбамоилирована. Пример 2 и сравнительные примеры 1 и 2: антивирусная активность против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ)
Антивирусную активность против ВИЧ полипептида (1), синтезированного в примере 1, тестировали и оценивали согласно следующему способу. Инфицированные ВИЧ МТ-4 клетки (2,5 104 клеток на лунку, множественность заражения (MOI):0,001) сразу же после инфицирования добавляли на 96-луночный микротитрационный планшет. После инкубирования при 37oC в течение 5 дней в инкубаторе с CO2 число выживших клеток измеряли по MТТ методу [Pauwels et al., J.Virol. Methods, 20, 309-321 (1982)]
Антивирусную активность выражали в виде концентрации, при которой смерть клеток, вызываемая инфекцией ВИЧ, ингибируется на 50% (EC50:50% эффективная концентрация). С другой стороны, для того чтобы знать цитотоксичность тест-вещества на МТ-4 клетках, не инфицированные вирусом клетки инкубировали, как описано выше, вместе с тест-соединением с различными концентрациями. Цитотоксичность выражали в виде 50% цитотоксичной концентрации (CC50), обнаруживаемой тест-веществом. Далее, приблизительное отношение CC50 к EC50 (CC50/EC50) выражали как эффективное отношение (SI). Следующая далее формула 8 представляет пептидный антивирусный агент, применяемый для сравнения с полипептидом (1): (Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Lys -Cys-Arg-NH2........Т-22)
Табл. 4 показывает величины EC50, CC50 и SI полипептида (1), пептида Т-22 и анти-ВИЧ агента AZT. Эта таблица ясно показывает, что полипептид (1) данного изобретения имеет ту же самую цитотоксичность, что и Т-22, антивирусная активность которого была обнаружена ранее, но проявляет антивирусную активность при 1/3 концентрации Т-22. Даже хотя 4 аминокислотных остатка были удалены из этого пептида и мол. масса была понижена, полипептид данного изобретения обнаруживал даже более высокую активность. По сравнению а азидотимидином (AZT) величина EC50 полипептида (1) была несколько выше, но он проявлял чрезвычайно низкую цитотоксичность. Поэтому мы ожидаем, что он может быть использован как более безопасный анти-ВИЧ агнт. Пример 5: Характеристики полипептидов и их анти-ВИЧ активность
Табл. 5 показывает структурные формулы и характеристики полипептидов данного изобретения, полученных при помощи процедур примеров 1,3 и 4. Табл. 5 также показывает антивирусную активность этих полипептидов, тестированную и оцениваемую по способу примера 2. Если нет других указаний, Cys в положениях 3 и 11 приводимых в качестве примеров соединений, представленных в приведенных таблицах, соединены дисульфидной связью. Далее, в таблице "AZT" обозначает азидотомидин (обычно известный как зидовудин), а Т-22 обозначает полипептид, представленный в формуле 8. Эффективность изобретения
Данное изобретение обеспечивает новый полипептид, обладающий антивирусной активностью против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), и позволяет получить гидрофильность, аффинность в отношении липидов, более высокую активность и применимо для выяснения механизма манифестации активности против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).
Формула изобретения
1. Полипептид формулы
где A1 представляет собой пептидный остаток, имеющий две основные аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из лизина, аргинина и орнитина, причем остаток, в котором N- атом водорода амино-конца аминокислотного остатка может быть замещен ацильной группой или замещенной тиокарбамоильной группой, образует N- замещенный ацилом пептидный остаток, N- замещенный замещенной тиокарбамоильной группой пептидный остаток;
A2 представляет собой остаток тирозина;
A3 представляет собой остаток лизина или аргинина;
A4 представляет собой -NH2;
X представляет собой остаток пептида, выбранный из группы, состоящей из таких пептидов, как D-лизил-пролин, пролил-D-лизин, лизил-глицин, D-орнитил-пролин, в которых атом водорода -аминогруппы, D-лизина, L-лизина, D-орнитина или L-орнитина может быть заменен -аминоацильной группой, и пептидный остаток соединен с аминокислотными остатками в положениях 6 и 8 через пептидную связь per se;
Trp представляет собой остаток триптофана;
Cys представляет собой остаток цистеина или его соль. 2. Полипептид по п. 1, где A1 представляет собой пептидный остаток из двух основных аминокислот, выбранных из группы, состоящей из лизина, аргинина и орнитина. 3. Полипептид формулы
где A1 представляет собой пептидный остаток, имеющий две основные аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из лизина, аргинина и орнитина, причем пептидный остаток, в котором N- атом водорода амино-конца аминокислотного остатка может быть замещен ацильной группой или замещенной тиокарбамоильной группой, образует N- замещенный ацилом пептидный остаток, N- замещенный замещенной тиокарбамоильной группой пептидный остаток;
A2 представляет собой остаток тирозина;
A3 представляет собой остаток лизина или аргинина;
A4 представляет собой -OH (происходящий из карбоксильной группы) или -NH2 (происходящий из кислой амидной группы);
X представляет собой пептидный остаток, выбранный из группы, состоящей из таких пептидов, как D-лизил-пролин, пролил-D-лизин, лизил-глицин, D-орнитил-пролин, в которых атом водорода -аминогруппы D-лизина, -лизина, D-орнитина или L-орнитина может быть заменен -аминоацильной группой, и пептидный остаток соединен с аминокислотными остатками в положениях 6 и 8 при помощи пептидной связи per se;
Trp представляет собой остаток триптофана;
Cys представляет собой остаток цистеина,
где остатки цистеина в положениях 3 и 11 соединены дисульфидной связью или его соль. 4. Фармацевтическая композиция для ингибирования активности ВИЧ у пациента, отличающаяся тем, что содержит эффективное количество полипептида или его соли по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель. 5. Фармацевтическая композиция для ингибирования активности ВИЧ у пациента, отличающаяся тем, что содержит эффективное количество полипептида или его соли по п.3 и фармацевтически приемлемый носитель. |
