РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ

(54) МИКРОЧАСТИЦЫ С УЛУЧШЕННЫМ ПРОФИЛЕМ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ И СПОСОБ ИХ ИЗГОТОВЛЕНИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ изготовления микрочастиц для замедленного высвобождения активного вещества, причем а) состав, содержащий активное вещество, добавляют в органический раствор полимера и диспергируют в нем, б) эмульсию или дисперсию, образующуюся на стадии а), добавляют во внешнюю фазу и диспергируют в ней, при этом внешняя фаза в момент добавления имеет температуру от 0°С до 20°С, причем в качестве внешней фазы может быть использована внешняя фаза в виде водного раствора или в виде «масляной» фазы, содержащая эмульгатор и/или защитный коллоид, и в) удаляют органический растворитель, подвергая образующуюся на стадии б) дисперсию или эмульсию воздействию давления менее 1000 мбар или вводя в образующуюся на стадии б) дисперсию или эмульсию инертный газ. Микрочастицы, полученные данным способом, обладают благоприятными свойствами. Количество активного вещества, высвобождаемого во время фазы «всплеска», очень незначительно, но общее высвобождение является высоким. При этом высвобождение активного вещества может длиться несколько недель и даже месяцев. 3 н. и 22 з.п. ф-лы, 1 табл., 8 ил.

Область техники.

Данное изобретение относится к микрочастицам для замедленного высвобождения физиологически активного вещества, содержащего по меньшей мере одно активное вещество и полимерную матрицу. Микрочастицы согласно изобретению имеют особенно благоприятную характеристику высвобождения. Изобретение касается также способа изготовления таких микрочастиц.

Уровень техники.

При применении лекарственных средств во многих случаях желательно на длительное время сохранять в плазме по возможности постоянный уровень активного вещества. Но это затруднительно, в частности, тогда, когда соответствующее активное вещество быстро расщепляется в организме и выделяется из него. Чтобы избежать повторного применения через небольшие промежутки времени, предлагались различные лекарственные формы продленного действия, имеющие целью осуществлять высвобождение по возможности постоянного количества активного вещества в течение длительного периода. Такие лекарственные формы продленного действия часто имеют вид микрочастиц, которые могут вводиться парентерально, например, как имплантат или с помощью подкожной инъекции. Как правило, подобные лекарственные формы включают полимерную матрицу, в которой распределено активное вещество ("микросферы"), или ядро, содержащее активное вещество и окруженное полимерсодержащим слоем (микрокапсулы).

В уровне техники известны различные способы изготовления микрочастиц.

Согласно так называемому способу W/O/W водную фазу (W1), содержащую активное вещество, сначала диспергируют в органическом растворе полимера (О), затем образовавшуюся эмульсию W1/O диспергируют в следующей водной фазе (так называемой внешней фазе W2). Полимер коацервируется за счет удаления органического растворителя и образует микрочастицы. Соответствующий способ диспергирования может влиять на размер частиц. Образование микрочастиц зависит еще и от возможности выпаривания растворителя. Поэтому способ двойной эмульсии W/O/W называют также "техническим методом выделения путем выпаривания растворителя". После отверждения микрочастиц и удаления растворителей получают микрочастицы, содержащие активное вещество. Часто такие микрочастицы содержат вещества, повышающие вязкость, например желатин.

В уровне техники также известны способы S/O/W, в которых активное вещество находится не в водном растворе, а представлено в виде твердого вещества (S). Твердое вещество диспергируют затем непосредственно в органической фазе (О). Дальнейшие приемы соответствуют способу W/O/W.

Наконец, существуют способы S/O/O, в которых внешняя фаза не является водной фазой, а представляет собой неводную фазу, содержащую защитный коллоид или эмульгатор.

Вводимое пациенту количество микрочастиц желательно минимизировать. Так, например, инъецируемый объем микрочастиц должен быть по возможности наименьшим, в частности, для ослабления болей при инъекции. Поэтому содержание в микрочастицах активного вещества должно быть как можно более высоким. Насыщение активным веществом является важной характеристикой микрочастиц. Различают практическую и теоретическую степень насыщения. В качестве синонимов для практической степени насыщения используют также выражения: эффективная степень насыщения или эффективное содержание активного вещества. Теоретическая степень насыщения определяется следующим образом:

При этом речь идет о массе составных частей, применяемых в процессе изготовления. Эффективное содержание активного вещества определяется следующим образом:

Соотношение эффективного содержания активного вещества и теоретической степени насыщения обозначают как выход капсюлирования. Выход капсюлирования является важным параметром процесса и мерой эффективности способа:

Также важным критерием определения свойств микрочастиц является профиль высвобождения. Профиль высвобождения активного вещества по времени можно грубо разделить на три фазы. В начальной фазе - фазе "всплеска" - обычно за сравнительно короткое время высвобождаются значительные количества содержащегося в микрочастицах активного вещества. При этом частично речь идет об активном веществе, находящемся на поверхности или вблизи поверхности частиц. Количество активного вещества, высвобождаемого во время фазы "всплеска", должно быть по возможности минимальным. В последующей лаг-фазе в препаратах, известных из уровня техники, высвобождение активного вещества пренебрежимо мало, особенно при использовании PLGA-полимеров в качестве формирователей матрицы. Желательно, чтобы в лаг-фазе в течение периода высвобождения происходило по возможности постоянное выделение активного вещества. В завершающей фазе биоэрозии частицы высвобождают активное вещество. Было бы идеально, если бы уже во время лаг-фазы высвобождалось все количество активного вещества.

Кашида и др. (1990) в журнале J. Controlled Release 13, 83-89 исследуют влияние степени насыщения, липофилии активного вещества и процента удаления растворителя на примере липофильного вещества судан Ш по сравнению с полярным этопозидом. При использовании поливинилового спирта в качестве стабилизатора оказалось, что удаление растворителя во время фазы отверждения посредством установки различных значений вакуума не оказывает влияния на высвобождение.

Клилэнд и др. (1997) в журнале J. Controlled Release 47, 135-150 исследуют для способа W/O/W с использованием PLGA-полимера для капсюлирования gp120 влияние кинематической вязкости полимера в первичной эмульсии и использование излишнего дихлорметана во внешней фазе на насыщение активным веществом и на высвобождение последнего во время фазы "всплеска".

Сущность изобретения.

Задачей данного изобретения является изготовление микрочастиц, имеющих благоприятный профиль высвобождения.

Неожиданно было обнаружено, что можно получать микрочастицы с более высоким общим высвобождением, если предварительно охлаждать внешнюю фазу, в которую подается первичная эмульсия. В данной заявке общим высвобождением, пригодным для использования, считается процентная доля содержащегося в микрочастицах общего количества активного вещества, выделяемого в течение 900 часов с момента начала высвобождения. Также было обнаружено, что количество высвобождаемого во время фазы "всплеска" активного вещества можно значительно сократить, если ускоренно удалять органический растворитель. Это осуществляется либо тем, что после диспергирования первичной эмульсии во внешней фазе образующуюся эмульсию или дисперсию подвергают воздействию низкого давления, либо тем, что через образующуюся эмульсию или дисперсию пропускают инертный газ, что приводит к более быстрому удалению органического растворителя.

Данное изобретение касается, таким образом, способа изготовления микрочастиц для замедленного высвобождения активного вещества, который отличается тем, что

а) состав, содержащий активное вещество, подают в органический раствор полимера и диспергируют в нем;

б) эмульсию или дисперсию, образующуюся на стадии а), подают во внешнюю фазу и диспергируют в ней, при этом внешняя фаза в момент подачи имеет температуру от 0°С до 20°С; и

в) удаляют органический растворитель, подвергая образующуюся на стадии б) дисперсию или эмульсию воздействию давления менее 1000 мбар или вводя в образующуюся на стадии б) дисперсию или эмульсию инертный газ.

В качестве активных веществ в микрочастицах могут использоваться все физиологически активные вещества. Предпочтительно речь должна идти о водорастворимых веществах. В качестве примеров для активных веществ, которые могут найти применение, следует назвать вакцины, противоопухолевые средства, жаропонижающие средства, анальгетические средства, противовоспалительные вещества, активные вещества, влияющие на свертывание крови, например, гепарин, противокашлевые средства, седативные средства, миорелаксанты, противоязвенные средства, противоаллергические средства, вазодилататоры, антидиабетические вещества, противотуберкулезные средства, гормональные препараты, противозачаточные средства, ингибиторы резорбции кости, ингибиторы ангиогенеза и т.д. Обычно в качестве активных веществ применяют пептиды или протеины. Примерами возможных пептидных или протеиновых активных веществ являются сальмон-кальцитонин (sCT), лизоцим, цитохром С, эритропоэтин (ЕРО), лютеинвысвобождающий гормон (LHRH), бузерелин, гозерелин, трипторелин, лейпрорелин, вазопрессин, гонадорелин, фелипрессин, карбетоцин, альбумин сыворотки крови крупного рогатого скота (BSA), окситоцин, столбнячный токсоид, бромокриптин, гормон, высвобождающий гормон роста (GHRH), соматостатин, инсулин, фактор некроза опухоли (TNF), фактор, стимулирующий рост колоний (GSF), фактор роста эпидермиса (EGF), фактор роста нервов (NGF), брадикинин, урокиназа, аспарагиназа, нейротензин, вещество Р, калликреин, полипептид, подаваляющий гастрит (GIP), фактор высвобождения гормона роста (GRF), пролактин, адренокортикотропный гормон (АСТН), гормон, высвобождающий тиротропин (TRH), гормон, стимулирующий тироид (TSH), гормон, стимулирующий меланоцит (MSH), паратгормон (LH), гастрин, глюкагон, энкефалин, костный морфогенетический протеин (BMP), -, -, -интерферон, ангиотензин, тимопоэтин и тимогуморальный фактор (THF).

Активные вещества, являющиеся пептидами или протеинами, могут иметь естественное происхождение или же изготавливаться и выделяться путем рекомбинации. Рекомбинантно изготавливаемые активные вещества могут отличаться от соответствующих естественных активных веществ, например, по виду и объему посттрансляционных модификаций, а также в первичной последовательности. Столь измененные активные вещества могут обладать иными свойствами, такими как измененная фармакологическая эффективность, измененный характер выделения и т.д. Изобретение охватывает все подобные "варианты" естественных активных веществ. Другими возможными активными веществами являются гепарин и нуклеиновые кислоты, такие как молекулы ДНК и РНК. Молекулы ДНК могут быть представлены в линейной или кругообразной форме. Речь также может идти о плазмидах или векторах, в частности экспрессионных векторах. Примером является экспрессионный вектор рсДНКЗ, описанный в WO 98/51321.

Изобретением охватываются, наконец, и вирусные векторы, применяемые для генной терапии. При этом могут использоваться также комплексы из хитозана, альгината натрия или других катионных полимеров, таких как полиэтиленимин или поли(лизин), или других катионных аминокислот. Применяемая нуклеиновая кислота может быть одно- или двухнитевой. Однонитевая ДНК может применяться, например, в виде антисенсовых олигонуклеотидов. Также возможно использование "голых" фрагментов нуклеиновой кислоты; в этих случаях нуклеиновая кислота не связана с другими веществами.

Концентрация активного вещества зависит, в частности, от соответствующего активного вещества и вида лечения, для которого он предназначен. Пептидные/ протеиновые активные вещества используются, как правило, в концентрации от 0,01 до 30%, предпочтительно от 0,5 до 15%, прежде всего от 1,0 до 7,5% по отношению к применяемой полимерной массе.

Органическая, несмешиваемая с водой фаза служит для растворения полимера, способного к биологическому расщеплению. При этом полимер растворяют в подходящем органическом растворителе, в котором активное вещество не растворяется. Примерами для таких органических растворителей являются этилацетат, ацетон, диметилсульфоксид, толуол, хлороформ, этанол, метанол и т.д. Особенно предпочтителен дихлорметан. Концентрация полимера в органической фазе обычно выше 5% (вес/объем), предпочтительно 5-50%, наиболее предпочтительно 15-40%.

В качестве полимеров, образующих полимерную матрицу микрочастиц, могут использоваться все способные к биологическому расщеплению и биологически совместимые полимеры. Они могут быть естественного или синтетического происхождения. Примерами полимеров естественного происхождения являются альбумин, желатин, карраген. Примерами синтетических полимеров, которые могут использоваться в заявленном способе, являются полимеры из кислот жирного ряда (например, полимолочная кислота, полигликолевая кислота, полилимонная кислота, полияблочная кислота, капролактон полимолочной кислоты и т.д.), эфир поли--цианоакриловой кислоты, поли--гидроксимасляная кислота, полиалкиленоксалаты (например, политриметиленоксалат, политетраметиленоксалат и т.д.), полиортоэфир, полиортокарбонаты и другие поликарбонаты (например, полиэтиленкарбонат, полиэтиленпропиленкарбонат и т.д.), полиаминокислоты (например, поли--бензил-L-глутаминовая кислота, поли-L-аланин, поли--метил-L-глутаминовая кислота и т.д.) и эфир гиалуроновой кислоты и т.д. Другими биологически совместимыми сополимерами являются полистирол, полиметакриловая кислота, сополимеры из акриловой и метакриловой кислоты, полиаминокислоты, декстранстеарат, этилцеллюлоза, ацетилцеллюлоза, нитроцеллюлоза, сополимеры на основе малеинового ангидрида, этилен-винилацетатные сополимеры, такие как поливинилацетат, полиакриламид и т.д. Указанные полимеры могут применяться отдельно или в сочетании друг с другом. Их можно применять в виде сополимеров или в виде смеси двух или нескольких полимеров. Можно использовать также их соли. Среди названных полимеров предпочтительны сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты (PLGA). Предпочтительными являются PLGA-полимеры с составом от 0:100 до 100:0 молочной кислоты по отношению к гликолевой кислоте и с молекулярным весом от 2.000 до 2.000.000 Да. Особенно предпочтительны PLGA-полимеры с молекулярным весом от 2.000 до 200.000 Да и соотношением молочная кислота - гликолевая кислота от 25:75 до 75:25 или 50:50. При этом можно использовать также L-PLA или D, L-PLA или их смеси или их сополимеры.

Состав, содержащий активное вещество, может представлять собой водный раствор, например, в случае применения способа W/O/W. Обычно в этом случае активное вещество растворяют в воде или буферном растворе и диспергируют непосредственно в органический раствор полимера. Образующуюся W1/0- или первичную эмульсию впрыскивают затем во внешнюю водную фазу (W2), содержащую в случае необходимости защитный коллоид, и диспергируют с помощью обычных вспомогательных средств. В результате образуется двойная эмульсия или W1/O/W2-эмульсия. После фазы отверждения образовавшиеся микрочастицы отделяют от внешней водной фазы, после чего их можно лиофилизировать. При большом объеме W1 и низкой вязкости раствора полимера в способе W/O/W получают микрокапсулы. Например, соотношение объемов W1:O:W2, равное 1:10:1000, привело бы к образованию "микросфер", а соотношение объемов, равное 9:10:1000, - к образованию микрокапсул.

Состав, содержащий активное вещество, может быть также представлен в виде твердого вещества. В этом случае активное вещество диспергируют непосредственно в органический раствор полимера. Следующие стадии процесса изготовления соответствуют таковым способа W/O/W. Другими технологическими приемами можно осуществить либо способ S/O/W, либо способ S/O/O.

В определенных вариантах осуществления заявленного способа внешняя фаза представляет собой водный раствор (W2). Этот водный раствор может содержать эмульгатор или защитный коллоид. Примерами защитных коллоидов являются поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и т.д. Предпочтителен поливиниловый спирт. Например, могут применяться различные поливиниловые спирты, получаемые фирмой "Клариант", такие как Мовиол® 18-88, Мовиол® 4-88, Мовиол® 47-88 или Мовиол® 20-98. Защитные коллоиды обычно используются в концентрации от 0,01% до 10%, предпочтительно от 0,01 до 5%. Молекулярный вес защитных коллоидов может составлять от 2.000 до 1.000.000 Да, предпочтительно от 2.000 до 200.000 Да. Объемы первичной W1/О-эмульсии и внешней фазы должны находиться между собой в соотношении от 1:5 до 1:1.000.

Альтернативно в качестве внешней фазы может использоваться и так называемая "масляная" фаза, не смешиваемая с первичной эмульсией ("способ W/O/O или S/O/O"). Например, может применяться силиконовое или парафиновое масло, которые содержат эмульгатор и/или защитный коллоид. В противоположность применению водной внешней фазы при использовании "масляной" внешней фазы должен присутствовать эмульгатор или защитный коллоид. Примерами эмульгаторов во внешней масляной фазе являются спэн, твин или брий, предпочтительно в концентрации от 0,01 до 10 мас.%.

В соответствии с изобретением внешняя фаза в момент подачи и диспергирования в ней первичной эмульсии имеет температуру от 0 до 20°С. Предпочтительно эта температура составляет 0°С-10°С, более предпочтительно 3-7°С, наиболее предпочтительно - около 5°С. Также предпочтительно темперировать затем, например, в лабораторном реакторе, образующуюся при этом эмульсию или дисперсию в названных интервалах температур. Наиболее предпочтительно после диспергирования первичной эмульсии во внешней фазе выдерживать предложенную согласно изобретению температуру до конца отверждения микрочастиц.

Согласно заявленному способу производят также ускоренное удаление органического растворителя. Это осуществляется тем, что эмульсию или дисперсию, образующуюся в результате диспергирования первичной эмульсии во внешней фазе, подвергают воздействию пониженного давления, то есть давления ниже атмосферного. В соответствии с изобретением эмульсия или дисперсия может подвергаться давлению менее 1000 мбар, предпочтительно - давлению 500 мбар или меньше, наиболее предпочтительно - давлению от 50 до 150 мбар. Благодаря такому вакууму органический растворитель удаляется быстрее. Вакуум предпочтительно создавать в процессе отверждения микрочастиц, когда для их изготовления используется лабораторный реактор. В качестве альтернативы созданию пониженного давления можно также ускоренно удалять органический растворитель путем введения в эмульсию или дисперсию инертного газа. В качестве инертных газов можно использовать, например, благородные газы, однако предпочтительным является азот. За счет вдувания азота летучий органический растворитель удаляется быстрее.

В особенно предпочтительном варианте осуществления способа микрочастицы отверждаются при низкой температуре, то есть в температурном интервале примерно от 0°С до 10°С, предпочтительно около 5°С, и при пониженном давлении, то есть при давлении 500 мбар или меньше. При этом особенно предпочтительным является создание вакуума, то есть давления примерно от 50 до 100 мбар.

Было также обнаружено, что присутствие хитозана в микрочастицах позволяет достигать более высоких степеней насыщения активным веществом, чем в микрочастицах согласно уровню техники. Для изготовления микрочастиц согласно данному изобретению можно, таким образом, применять и хитозан. Хитозан представляет собой полимер, получаемый путем деацетилирования хитина, то есть полисахарида, встречающегося у насекомых и раков. Обычно это полисахарид с линейной цепью, построенной из 2-амино-2-дезокси--D-глюкопиранозы (GlcN), причем мономеры связаны по -(1,4) (100% деацетилирования). Однако при неполном деацетилировании образуются хитозансодержащие составы, которые в полисахаридной цепи еще имеют различные доли 2-ацетамидо-2-дезокси--D-глюкопиранозы (GlcNAc).

Согласно изобретению хитозан может иметь разные степени деацетилирования. Хитозан, деацетилированный практически на 100%, по существу, содержит еще лишь GlcN и уже не содержит GlcNAc. Хитозан в соответствии с изобретением имеет степень деацетилирования преимущественно от 25 до 100%, наиболее предпочтительно - от 50 до 100%.

Весовое соотношение физиологически активного вещества и хитозана составляет предпочтительно 1:0,01-1:25, более предпочтительно - 1:0,01-1:10, наиболее предпочтительно -1:1. Соотношение указано в мас./мас.

Обычно хитозан применяют с молекулярным весом от 10 000 до 2 000 000 Да, преимущественно от 40 000 до 400 000 Да. Чаще всего хитозан растворяют в 0,001 - 70-процентной уксусной кислоте, предпочтительно в 0,01 - 10-процентной уксусной кислоте (мас./мас.). В соответствии с изобретением частицы могут изготавливаться способами W/O/W/, S/O/W или S/O/O. Активное вещество можно растворять с хитозаном в уксусной кислоте или же сначала растворять активное вещество в воде, а затем диспергировать с растворенным хитозаном. Такой гель из хитозана и активного вещества диспергируют затем непосредственно в органический раствор полимера (W/O/W). Раствор хитозан - активное вещество можно также подвергнуть распылительной сушке, а твердый порошок затем диспергировать непосредственно в органический раствор полимера (S/O/W; S/O/O).

Концентрация хитозана во внутренней фазе в способе W/O/W составляет в общем и целом 0,01-50% хитозана по отношению к полимерной массе, предпочтительно же 0,01-25% хитозана по отношению к полимерной массе. Весовое соотношение физиологически активного вещества и хитозана должно составлять от 1:0,01 до 1:25, предпочтительно - от 1:0,1 до 1:10, наиболее предпочтительно - 1:1. При использовании способа S/O/W концентрация комплекса хитозан - активное вещество по отношению к полимерной массе должно составлять от 0,01% до 50%, предпочтительно от 0,1 до 25%.

Изобретение касается также микрочастиц, которые могут изготавливаться заявленным способом. Такие микрочастицы по своему профилю высвобождения обладают благоприятными свойствами. Так количество активного вещества, высвобождаемого во время фазы "всплеска", очень незначительно. Большей же частью активное вещество, содержащееся в микрочастицах, высвобождается в процессе лаг-фазы. Следовательно, общее высвобождение активного вещества очень велико. Данное изобретение относится, таким образом, к микрочастицам, содержащим полимерную матрицу и, по меньшей мере, одно физиологически активное вещество, которые отличаются тем, что согласно профилю in vitro-высвобождения из микрочастиц

а) в течение 24 часов с момента начала высвобождения высвобождается менее 25% общего количества активного вещества; и

б) в течение 900 часов с момента начала высвобождения высвобождается по меньшей мере 80% общего количества активного вещества.

Данные о высвобождении активного вещества относятся в этой заявке к высвобождению, выявленному in vitro, в предназначенном для этой цели аппарате согласно способу, описанному в примере 5. Известно, что высвобождение активного вещества в этом способе in vitro почти равносильно высвобождению in vivo.

Микрочастицы со столь благоприятным профилем высвобождения до настоящего времени в уровне техники не известны. Микрочастицы согласно уровню техники имеют более высокое высвобождение во время фазы "всплеска" и/или очень низкое высвобождение во время лаг-фазы, в результате чего общее высвобождение является низким. Вследствие этого существует опасность, что только во время последующей фазы биоэрозии вновь будет высвобождаться большое количество активного вещества.

Заявленные микрочастицы высвобождают в течение 24 часов с момента начала высвобождения менее 25% общего количества активного вещества, преимущественно менее 20%, наиболее предпочтительно менее 15%.

Свойство микрочастиц заключается также в том, что в течение 900 часов с момента начала высвобождения высвобождается не менее 80% общего количества активного вещества, преимущественно - не менее 85%, наиболее предпочтительно - не менее 90%.

Микрочастицы согласно изобретению характеризуются высвобождением, которое происходит за период времени от 48 до 900 часов после начала высвобождения, преимущественно за период времени от 24 до 900 часов после начала высвобождения, в основном по кинетике нулевого порядка. Это означает, что в течение более 30 суток ежедневно высвобождается в сущности постоянное количество активного вещества. В период времени от 48 часов до 900 часов после начала высвобождения ежедневно высвобождается преимущественно 1,5-2,5% общего количества активного вещества, предпочтительно - 2-2,5%.

Микрочастицы согласно изобретению обычно имеют диаметр от 1 до 500 мкм, предпочтительно - от 1 до 200 мкм, более предпочтительно - от 1 до менее 150 мкм, наиболее предпочтительно - от 1 до 100 мкм. Они могут быть в основном шаровидными или иметь другую форму. Если частицы не являются шаровидными, то под диаметром следует понимать наибольший пространственный размер частицы. При этом полимерная матрица может быть выполнена в виде оболочки, окружающей ядро, или в виде "каркаса", проходящего через всю частицу. Поэтому микрочастицы данного изобретения охватывают как частицы, которые имеют окруженное полимерным слоем ядро, содержащее активное вещество (микрокапсулы), так и частицы, имеющие полимерную матрицу, в которой распределено активное вещество ("микросферы").

В специальном варианте осуществления изобретения микрочастицы могут содержать также хитозан. Свойства хитозана и его концентрации, предложенные согласно изобретению, указаны выше. Такие частицы характеризуются более высокой эффективной степенью насыщения активным веществом.

Другим аспектом данного изобретения является лекарственное средство, включающее заявленные микрочастицы, содержащие, в случае необходимости, фармацевтически совместимые вспомогательные вещества.

С помощью данного изобретения впервые создаются микрочастицы, сочетающие низкое высвобождение активного вещества во время фазы "всплеска" с высоким общим высвобождением. Кроме того, микрочастицы согласно изобретению характеризуются по существу линейным протеканием высвобождения активного вещества во время лаг-фазы. Благодаря заявленным микрочастицам высвобождение активного вещества может длиться нескольких недель и даже месяцев. Поэтому они особенно пригодны для подкожного/внутримышечного применения.

Перечень фигур.

Фигура 1 показывает зависимость выхода капсюлирования (VE) от применяемого давления в процессе отверждения микрочастиц в лабораторном реакторе при постоянной температуре 5°С. Выход капсюлирования возрастает с понижением давления.

На фигуре 2 показана зависимость выхода капсюлирования (VE) от применяемого давления в процессе отверждения микрочастиц в лабораторном реакторе при постоянной температуре 20°С. В противоположность фигуре 1 здесь исследуются только два вида давления, а именно атмосферное давление и 500 мбар. Видно, что и при температуре 20°С более низкое давление в процессе отверждения приводит к более высокому выходу капсюлирования.

Фигура 3 показывает зависимость in vitro-высвобождения от лизоцима при вдувании азота (N2) в процессе отверждения микрочастиц в лабораторном реакторе при разных температурах (5°С и 20°С). Далее показан профиль in vitro-высвобождения для микрочастиц, у которых растворитель выпаривался во время фазы отверждения при 50°С. При этом очевидно, что при использовании высоких температур общее высвобождение является более низким. При снижении температуры с 20°С до 5°С происходит понижение начального высвобождения на 6% и повышение общего высвобождения до 99,7% по сравнению с 79,3% при 20°С по истечении 1074 часов процесса высвобождения. Далее кривая "N2 при 5°С" показывает более низкое высвобождение во время фазы "всплеска".

На фиг.4 показан результат примера 9. За счет использования низкого давления и низких температур при 5°С и вакууме 100 мбар через 5 часов происходит низкий "всплеск", равный 22,4%, и наблюдается более высокое общее высвобождение, составляющее 90,5%. При 20°С и давлении 100 мбар общее высвобождение по истечении 912 часов составляет лишь 62,8%.

Фигура 5 показывает профиль высвобождения двух независимых друг от друга исходных смесей при давлении 100 мбар и температуре 5°С в процессе отверждения микрочастиц в лабораторном реакторе. С помощью заявленного способа можно, таким образом, воспроизводить микрочастицы, имеющие по существу одинаковый профиль высвобождения. Как видно из приведенных данных, микрочастицы характеризуются преобладающим линейным высвобождением.

Изобретение более подробно поясняется с помощью нижеследующих примеров.

Пример 1: Изготовление микрочастиц способом W/O/W

Микрочастицы с лизоцимом.

Для изготовления пептидсодержащих микрочастиц из полимеров PLA или PLGA применяли следующий способ "выделения путем выпаривания растворителя": в соответствии со стандартом 2,00 г полимера PLGA (RG 503 Н фирмы Берингер Ингельхайм) в 20 мл шприце "Омнификс", снабженном запором Луэра и подходящей комбинированной глухой пробкой, полностью растворяют (35% мас./объем) в 5,7 мл дихлорметана (DCM) (плотность дихлорметана = 1,32 г/мл) /индекс Меркля/. 100,00 мг/мл лизоцима при легком помешивании посредством магнитной мешалки растворяют в 4 мл флаконе для высокоэффективной жидкостной хроматографии в дистиллированной воде или буферном растворе до состояния прозрачности. Затем 1000 мкл раствора пептида впрыскивают в раствор полимера и с помощью приспособления "SN-10 G Ультратурракс" диспергируют в течение 60 с при скорости вращения 13.500 об/мин. Первичную эмульсию (W1/O) впрыскивают затем из шприца "Омнификс" в 500 мл предварительно охлажденного до 5°С 0,1-процентного раствора поливинилового спирта (PVA) (Мовиол 18-88: мол. вес = 130 кДА, степень гидролиза 88%) и одновременно диспергируют с помощью приспособления "SN-10 G Ультратурракс" в течение 60 с при скорости 13.500 об/мин, в результате чего образуется двойная эмульсия W1/O/W2. Эту эмульсию отверждают в течение 3 часов при комнатной температуре в открытом химическом стакане емкостью 600 мл под атмосферным давлением при скорости вращения 240 об/мин посредством рядной IKA-мешалки и двухлопастных центробежных мешалок.

Затем всю двойную эмульсию с содержащимися в ней отвержденными микрочастицами центрифугируют в центрифужных пробирках на мегафуге "Хэреус 1.0" при скорости вращения 3 000 об/мин в течение трех минут и декантируют верхнюю часть фазы 2W. Вслед за этим микрочастицы пропускают через 500 мл нутч-фильтр (боросиликат 3.3; размер пор 4) и по меньшей мере трижды промывают дистиллированной водой. При этом микрочастицы, получаемые на фритте, время от времени суспендируют и промывают небольшим количеством дистиллированной воды для удаления остатков поливинилового спирта (PVA).

Полученные микрочастицы собирают, подают в предварительно тарированные сосуды и лиофилизируют. Микрочастицы помещают в установку "Дельта 1 А", включенную в режим эксплуатации, и подвергают основной сушке в течение по меньшей мере 120 часов при -60°С и вакууме 0,01 мбар. За этим следует досушивание в течение более 24 часов при 10°С и вакууме 0,01 мбар с целью удаления последних остатков растворителя и воды. Производят взвешивание микрочастиц в сосудах и расчет выхода.

Пример 2: Изготовление микрочастиц способом S/O/W

Изготовление осуществляется по условиям способа W/O/W, но с вариацией на первом этапе изготовления, когда определенное количество пептида или протеина не растворяют, а подают в лиофилизированном или высушенном распылительной сушкой виде непосредственно в растворенный в дихлорметане полимер (35% мас./мас.) и с помощью приспособления "SN-10 G Ультратурракс" в течение 30 с диспергируют при скорости вращения 13.500 об/мин. Образовавшуюся S/O- или первичную суспензию диспергируют затем во внешней фазе, в результате чего образуется эмульсия S/O/W. Дальнейшее изготовление аналогично условиям способа W/O/W.

Пример 3: Изготовление микрочастиц посредством лабораторного реактора

Для изготовления W/O/W- или S/O/W-микрочастиц с помощью технологической установки в контролируемых условиях применялся IKA-лабораторный реактор LA-R 1000. Использовались условия способа W/O/W или S/O/W (см. пример 1 и 2). При этом первичную эмульсию приготавливают в шприце "Омнификс" и затем через одно из отверстий крышки реактора впрыскивают в предварительно доведенный до определенной температуры 0,1-процентный раствор поливинилового спирта (500 мл), размещенный в IKA-лабораторном реакторе, проводя диспергирование в течение 60 с посредством вращающегося со скоростью 13.500 об/мин приспособления "Ультратурракс Т 25" с инструментом SN 18 G. По окончании диспергирования "Ультратурракс" удаляют из IKA-реактора и закрывают его корпус. Теперь может быть приложено определенное давление. В следующих примерах наряду с атмосферным давлением главным образом использовали 500 мбар или 100 мбар. Вслед за этим осуществлялось отверждение микрочастиц при постоянном перемешивании анкерной мешалкой при 40 об/мин и постоянной температуре. Температуры могут устанавливаться разные. Большей частью это 20°С или 5°С. Отделение и лиофилизация микрочастиц производятся таким же образом, как уже было описано для способа W/O/W или S/O/W.

Установка содержит корпус реактора вместимостью 1 л и через двухстенное дно корпуса может подвергаться термостатированию в пределах от -30°С до 180°С. Термостатирование производят с помощью циркуляционого термостата. Вакуум создают вакуумным насосом MZ 2 С фирмы Янке & Кункель. Затем измерительными датчиками (РТ 100 предназначен для измерения температуры) снимают данные о температуре содержимого реактора, охлаждающей жидкости, вакууме, скорости перемешивания и скорости вращения приспособления "Ультратурракс" и переносят их в программное обеспечение. Управление технологической установкой осуществляется через программное обеспечение "Версия Лэбворлдсофт 2.6".

Пример 4: Метод определения насыщения микрочастиц активным веществом

Определение насыщения микрочастиц активным веществом проводилось по модифицированному методу Заха и др. (Новая стратегия определения действительного содержания протеина в поли(лактидно-гликолидных) микросферах; журнал Journal of Pharm. Sciences; 1997; 86; (11); стр.1315-1318). Микрочастицы растворяют в растворе ДМСО/0,5% ДСН/0,1 н. NaOH, затем из этого раствора проводят анализ ВСА (Лоури и др. "Измерение протеина при помощи фолин-фенольного реагента; журнал J. Biol. Chem.; 193; стр.265-275; 1951). Этим определяется эффективная степень насыщения микрочастиц.

Пример 5: Определение in vitro-высвобождения

Кумулятивное высвобождение лизоцима в процентах к общему содержанию лизоцима в микрочастицах исследовалось следующим образом.

Для определения высвобождения активного вещества из микрочастиц брали навески по 20 мг микрочастиц (на каждую партию - тройная исходная смесь). Микрочастицы помещали в пробирки из стекла "пирекс", имеющие пробку-диафрагму с резьбой GL18 и тефлоновым уплотнением. К микрочастицам примешивали по 5 мл буфера высвобождения Мк.Илвейн-Уайтинга (состав см. ниже). Затем пробы помещали в аппарат для высвобождения (6 об/мин; 37°С). Аппарат для высвобождения содержит универсальную удерживающую пластину из полипропилена для размещения на ней сосудов Эппендорфа или пробирок из стекла "пирекс". Пластина с сосудами может приводиться во вращательное движение в термостатируемом корпусе, при этом сосуды вращаются вокруг своей поперечной оси. Число оборотов регулируется плавно от 6 до 60 об/мин. Термостатирование всей внутренней полости производится за счет циркуляции теплого воздуха. Первую пробу извлекали примерно через два часа, вторую пробу - примерно через шесть часов, третью пробу - примерно через 24 часа, четвертую пробу - через 48 часов и остальные - с интервалом в трое суток. Пробирки "пирекс" центрифугировали на центрифуге (мегафуга 1.0, Хэреус, Ганау) при скорости вращения 3000 об/мин (4700 г) в течение трех минут, затем пипеткой Пастера по возможности полностью удаляли верхнюю часть буфера. Вслед за этим в пробирки вновь добавляли буфер в количестве 5 мл и устанавливали пробы в аппарат для высвобождения. Буфер защищали от света и хранили в холодильном шкафу при 4°С.

Состав буфера высвобождения Мк.Илвейн-Уайтинга:

лимонная кислота	0,0094 М
динатриумгидрофосфат	0,1812 М
"твин 20" для молекулярной биологии	0,1% (вес/объем)
азид натрия	0,025 (вес/объем)
рН	7,4

в дистиллированной воде.

Пипетированный раствор пептида переносили из сосудов Эппендорфа или пробирок "пирекс" в хроматографические 4 мл флаконы с прокалываемым тефлоновым уплотнением и поворотным запором и либо сразу подвергали высокоэффективному жидкостному хроматографическому анализу (HPLC-анализ), либо хранили при -30°С. В этом случае пробы перед HPLC-анализом оттаивали при комнатной температуре в течение двух часов, неоднократно быстрым движением встряхивая их вручную. После оттаивания следили за полной прозрачностью раствора.

HPLC-анализ проводился на хроматографической установке "Уотерс", содержащей насос W600, автоматический пробоотборник 717, флюоресцентный детектор "Сатин 474" и программное обеспечение "Миллениум 3.15". Для лизоцима были установлены параметры:

- скорость течения 1 мл/мин;

- буфер А=0,1% TFA (трифторуксусная кислота) в воде;

буфер Б=0,1% TFA в ацетонитриле;

- градиент: 80% А, 20% Б за 10 минут до 60% А, 40% Б;

примерно за 12 минут до 80% А, 20% Б;

- длина волны возбуждения = 280 нм;

длина волны излучения = 340 нм при коэфф. усиления = 100;

"Аттентион 256" и сверхпроводящий туннельный прибор (STD);

- термостатирование в колоночной печи 40°С;

- колонка: TSK Gel RP 18, NP; 5 мкм; 35 мм × 4,6 мм;

- газ из элюентов предварительно удаляли гелием или ультразвуком, а в процессе проведения анализа - посредством дегазатора;

- для каждого образца в качестве стандарта анализировали стандартные ряды от 0,05 до 4 мкг лизоцима/мл буфера высвобождения при объеме инъекции 100 мкл и от 10 до 100 мкг лизоцима/мл буфера высвобождения при объеме инъекции 10 мкл.

Описанный выше метод определения in vitro-высвобождения относится к лизоциму как активному веществу и не применим для лейпрорелина. Для определения других активных веществ, таких как, например, лейпрорелин, необходимо изменять некоторые параметры, например, применяемую колонку, буферные среды и длину волны. Такие изменения понятны для специалиста.

Пример 6.

Исследовалось влияние пониженного давления во время отверждения микрочастиц в лабораторном реакторе при 5°С на выход капсюлирования. Согласно примеру 3 способом S/O/W в разных условиях изготавливали три композиции микрочастиц. Для исходной смеси 1 отверждение микрочастиц осуществляли при атмосферном давлении, для исходной смеси 2 - при 500 мбар, для исходной смеси 3 - при 100 мбар. Для всех исходных смесей отверждение проводилось при 5°С.Эффективное насыщение композиций микрочастиц активным веществом определяли способом, описанным в примере 4, и на основе этого рассчитывали выход капсюлирования (VE). Результат показан на фигуре 1. Выход капсюлирования возрастает с понижением давления.

Пример 7.

Как и в примере 6, композиции микрочастиц, изготовленные в разных условиях в лабораторном реакторе, исследовались на предмет выхода капсюлирования. Для исходной смеси 1 отверждение микрочастиц осуществляли под атмосферным давлением, для исходной смеси 2 - при давлении 500 мбар. В обоих случаях отверждение проводили при 20°С. Затем определяли выход капсюлирования. Как явствует из фигуры 2, при температуре обработки 20°С выход капсюлирования также возрастает с понижением давления.

Пример 8.

Микрочастицы изготавливали в лабораторном реакторе способом S/O/W в трех разных условиях. Для исходных смесей 1 и 2 во время отверждения микрочастиц в лабораторном реакторе при 5°С и соответственно 20°С вдували азот. В случае исходной смеси 3 во время фазы отверждения при 50°С выпаривали растворитель. In vitro-высвобождение лизоцима из микрочастиц трех исходных смесей определяли способом, описанным в примере 5.

Результат показан на фигуре 3. При использовании повышенных температур наблюдается более низкое общее высвобождение. В результате снижения температуры с 20°С до 5°С происходит понижение начального высвобождения на 6% и повышение общего высвобождения до 99,7% через 1074 часов по сравнению с 79,3% при 20°С.

Пример 9.

Способом S/O/W при различных условиях было изготовлено пять композиций микрочастиц:

- 20°С в процессе отверждения микрочастиц в лабораторном реакторе под атмосферным давлением ("20°С");

- 5°С в процессе отверждения микрочастиц в лабораторном реакторе под атмосферным давлением ("5°С");

- 20°С в процессе отверждения микрочастиц в лабораторном реакторе под давлением 100 мбар ("20°С сразу при 100 мбар");

- 5°С в процессе отверждения микрочастиц в лабораторном реакторе под давлением 100 мбар ("5°С сразу при 100 мбар");

- согласно примеру 2 в химическом стакане, при этом внешнюю фазу предварительно охлаждали до 5°С и после диспергирования S/O-фазы во внешней фазе размешивали эмульсию S/O/W при температуре и атмосферном давлении. При этом в течение 30 минут происходило уравнивание температуры отверждающихся микрочастиц с комнатной температурой ("5°С и только начальное предварительное охлаждение в химическом стакане").

Определяли in vitro-высвобождение лизоцима из микрочастиц пяти исходных смесей. Результат показан на фигуре 4.

Часть результатов приведена в таблице.

	"Всплеск" через 5 час	Общее высвобождение через 912 час	Линейно высвобожденное количество (разница между "всплеском" и общим высвобождением)
S/O/W химический стакан с начальным охлаждением 5°С	27,5%	100%	около 72,5%
Лабораторный реактор 20°С, 1013 мбар	37,6%	71,1%	около 33,5%
Лабораторный реактор 5°С, 1013 мбар	26,1%	85,5%	около 59,5%
Лабораторный реактор 20°С, 100 мбар	17,6%	62,8%	около 45,2%
Лабораторный реактор 5°С, 100 мбар	22,4%	90,5%	около 68%

У исходной смеси в химическом стакане наблюдается "всплеск" величиной 27,5% через 5 часов. Заметно выше "всплеск" величиной 37,6% при 20°С и 1013 мбар. При охлаждении отверждающихся микрочастиц уровень "всплеска" понижается. Далее при 5°С и 1013 мбар общее высвобождение величиной 85,5% по истечении 912 часов заметно выше, чем при 20°С и 1013 мбар. Применение вакуума позволят и дальше снижать высвобождение в фазе "всплеска".

Пример 10.

В лабораторном реакторе согласно способу, описанному в примере 3, в идентичных условиях независимо друг от друга изготавливали две композиции микрочастиц. Условия были следующие: 5°С и 100 мбар в процессе отверждения микрочастиц.

In vitro-высвобождение у обеих композиций микрочастиц определяли согласно примеру 2. Результат показан на фигуре 5. Возможно воспроизведение композиций микрочастиц, имеющих в основном идентичные свойства высвобождения.

Пример 11.

Влияние давления и температуры на микрочастицы с лейпролином согласно способу W/O/W.

Исследовалось влияние пониженного давления и температуры на свойства микрочастиц в процессе их отверждения в лабораторном реакторе при 5°С. Как описано в примере 1, способом W/O/W в разных условиях изготавливали две композиции микрочастиц. При этом в качестве активного вещества использовали лейпрорелинацетат.

Для исходной смеси 1 отверждение микрочастиц осуществляли при 5°C и 100 мбар, а для исходной смеси 2 - при 25°С и 1000 мбар. Эффективное насыщение композиций микрочастиц активным веществом определяли так же, как в способе, более подробно описанном в примере 4, и на основе этого рассчитывали выход капсюлирования (VE). Результат показан на фигуре 6. Выход капсюлирования возрастает с понижением давления.

Пример 12.

Влияние давления, температуры и добавления хитозана

Исследовалось влияние пониженного давления и температуры на свойства микрочастиц в процессе их отверждения в лабораторном реакторе при 5°С. Как описано в примере 1, способом W/O/W изготавливали одну композицию микрочастиц с добавлением хитозана (мол.вес = 150.000). При этом в качестве активного вещества использовали лейпрорелинацетат.

Для исходной смеси 1 отверждение микрочастиц осуществляли при 5°C и 100 мбар. Эффективное насыщение композиции микрочастиц активным веществом определяли способом, описанном в примере 4, и на основе этого рассчитывали выход капсюлирования (VE). Результат показан на фигуре 7.

При этом видно, что по сравнению с исходной смесью 1 в примере 11 (изготовление способом W/O/W без добавления хитозана, но с применением вакуума и температуры) имеет место увеличение выхода капсюлирования (VE) и замедление высвобождения. Эта исходная смесь подтверждает, что за счет добавления хитозана можно получить еще лучшие результаты.

Пример 13.

Влияние давления и температуры на микрочастицы с лейпрорелинацетатом согласно способу S/O/W.

Исследовалось влияние пониженного давления и температуры на свойства микрочастиц в процессе их отверждения в лабораторном реакторе при 5°С. Согласно примеру 12 способом S/O/W в различных условиях изготавливали две композиции микрочастиц. При этом в качестве активного вещества использовали лейпрорелинацетат. Для исходной смеси 1 отверждение микрочастиц осуществляли при 5°С и 100 мбар, а для исходной смеси 2 - при 25°С и 1000 мбар. Эффективное насыщение композиций микрочастиц активным веществом определяли способом, описанном в примере 4, и на основе этого рассчитывали выход капсюлирования (VE). Выход капсюлирования при использовании вакуума и пониженной температуры выше в 2,25 раза. На фигуре 8 показано in vitro-высвобождение лейпрорелинацета из этих микрочастиц.

Формула изобретения

1. Способ изготовления микрочастиц для замедленного высвобождения активного вещества, отличающийся тем, что

а) состав, содержащий активное вещество, добавляют в органический раствор полимера и диспергируют в нем,

б) эмульсию или дисперсию, образующуюся на стадии а), добавляют во внешнюю фазу и диспергируют в ней, при этом внешняя фаза в момент добавления имеет температуру от 0 до 20°С, причем в качестве внешней фазы может быть использована внешняя фаза в виде водного раствора или в виде «масляной» фазы, содержащая эмульгатор и/или защитный коллоид, и

в) удаляют органический растворитель, подвергая образующуюся на стадии б) дисперсию или эмульсию воздействию давления менее 1000 мбар или вводя в образующуюся на стадии б) дисперсию или эмульсию инертный газ.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что температура составляет от 0 до 10°С.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что температура составляет от 3 до 7°С.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что дисперсию или эмульсию, образующуюся на стадии б), в процессе удаления органического растворителя термостатируют далее до температуры 0-20°С.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что дисперсию или эмульсию, образующуюся на стадии б), в процессе удаления органического растворителя термостатируют далее до температуры 0-10°С.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что при удалении органического растворителя дисперсию или эмульсию, образующуюся на стадии б), подвергают воздействию давления от 50 до 150 мбар.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что при удалении органического растворителя в дисперсию или эмульсию, образующуюся на стадии б), вводят инертный газ, предпочтительно азот.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве полимера используется полимолочная кислота, полигликолевая кислота или сополимер молочной и гликолевой кислот.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что органический раствор полимера в качестве растворителя содержит дихлорметан.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что концентрация полимера в органическом растворе полимера составляет 5-50% (вес/объем).

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что состав, содержащий активное вещество, представляет собой водный раствор.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что состав, содержащий активное вещество, состоит из твердых веществ.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что состав, содержащий активное вещество, приготавливают распылительной сушкой раствора, содержащего активное вещество.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что водная внешняя фаза содержит эмульгатор и/или защитный коллоид.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что защитный коллоид выбран из группы, включающей поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и полиэтиленгликоль.

16. Способ по п.1, отличающийся тем, что внешняя фаза содержит спэн, твин или брий.

17. Способ по п.1, отличающийся тем, что состав, содержащий активное вещество, содержит также хитозан.

18. Микрочастицы, получаемые способом по п.1.

19. Микрочастицы по п.18, отличающиеся тем, что согласно профилю in vitro-высвобождения из микрочастиц

а) в течение 24 ч с момента начала высвобождения высвобождается менее 25% от общего количества активного вещества и

б) в течение 900 ч с момента начала высвобождения высвобождается по меньшей мере 80% от общего количества активного вещества;

в) высвобождение осуществляется в период времени от 24 до 900 ч после начала высвобождения в основном по кинетике нулевого порядка.

20. Микрочастицы по п.19, отличающиеся тем, что согласно профилю in vitro-высвобождения из микрочастиц в течение 24 ч с момента начала высвобождения высвобождается менее 20% от общего количества активного вещества.

21. Микрочастицы по п.19, отличающиеся тем, что согласно профилю in vitro-высвобождения из микрочастиц в течение 900 ч с момента начала высвобождения высвобождается по меньшей мере 90% от общего количества активного вещества.

22. Микрочастицы по п.19, отличающиеся тем, что в период времени от 48 до 900 ч после начала высвобождения ежедневно высвобождается 1,75-2,5% от общего количества активного вещества.

23. Микрочастицы по п.18, отличающиеся тем, что в качестве физиологически активного вещества в них содержится пептид или протеин.

24. Лекарственное средство, содержащее микрочастицы по п.18.

25. Лекарственное средство по п.24, отличающееся тем, что оно изготовлено для парентерального применения.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6