РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ

(54) КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДОСТАВКИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

(57) Реферат:

Для выявления эффективности генетической вакцины на мышах против антигена G-белка вируса бешенства человека создан ДНК конструкт. Применяемая модель на животных приведена выше. Клетки опухоля трансфецируют ДНК, кодирующий белок G вируса бешенства, подтверждают экспрессию белка клетками, после чего их имплантируют животному.

Генетически иммунизированных животных вакцинируют плазмидой рВа.РЬ-G, описанной в Примере 10, применением вышеприведенного способа вакцинации. Целевой G-белок вируса бешенства служит примером патогенного антигена. ДНК последовательность находится в Генбанке под N 32751. Контроль включает невакцинированных животных и животных, которым вводился G-белок вируса бешенства.

Пример 33

Для выявления эффективности генетической вакцины на мышах против антигена болезни Лима создан ДНК конструкт. Применяемая модель на животных приведена выше. Клетки опухоли трансфецируют ДНК, кодирующей OspA и OspB, подтверждают экспрессию белка клетками, после чего их имплантируют животному.

Генетически иммунизированных животных вакцинируют плазмидой pOspA.B, описанной в Примере 9. Контроль включает невакцинированных животных и животных, которым вводились белки OspA и OspB.

Пример 34

Для выявления на мышах эффективности генетической вакцины против переменной области Т-клеточного рецептора человека создан ДНК конструкт. Данные опыты предназначались для определения способности вакцины защищать от происходящего из Т-клеточного рецептора белка, ассоциируемого с раком, например: Т-клеточной лимфомой и передаваемой через Т-клетки аутоиммунной болезнью. Применяемая модель на животных приведена выше. Клетки опухоли трансфецируют ДНК, кодирующей Ras, подтверждают экспрессию белка клетками, после чего их имплантируют животному.

Генетически иммунизированных животных вакцинируют плазмидой рВа.V3, описанной в Примере 5, применением вышеприведенного способа вакцинации.

Пример 35

Плазмида рМ160 может быть использована в качестве исходного продукта для получения ряда плазмид, применимых для экспрессии одного или нескольких генов из env части ВИЧ. Описание

конструирования рМ160 приведено выше. Плазмида направлена на gp160, tat и rev область кодирования. Ген nef отсутствует.

Промотором, контролирующим экспрессию gp160/rev/tat гена, является ВОМЖМ ДКП. Промотор может быть изъят и заменен актиновым промотором, миозиновым промотором, ВИЧ ДКП промотором и ЦМВ промотором.

Ген, придающий устойчивость к ампициллину, может быть изъят или каким-то иным путем дезактивирован. Ген, придающий устойчивость к неомицину, может быть помещен под контроль бактериального промотора.

Из плазмиды может быть удален усилитель вируса саркомы Рауса. ВСР усилитель может быть заменен усилителем мышечного креатина.

Гены gp160/rev/tat перекрываются и разделяют одинаковые нуклеотидные последовательности в разных рамках считывания. Ген rev может быть изъят путем замены его инициирующего кодона другим кодоном. Аналогичным путем может быть удален и tat ген. В каждой плазмиде за исключением тех, в которых для контроля gp160/rev/tat применяется ВИЧ ДКП, может быть удален один из rev или tat, или оба rev и tat. В плазмидах, использующих ВИЧ ДКП промотор, присутствие tat обязательно.

В Таблице 3 дается перечень рМ160-модифицированных плазмид. В каждой удален ВСР усилитель. В некоторых из них усилитель отсутствует (нет), в других присутствует усилитель мышечного креатина (УМК). В некоторых из них присутствует ВИЧ rev ген (да), а в других этот ген отсутствует (нет). Некоторые из них имеют ВИЧ tat ген (да), в то время как в других этот ген отсутствует (нет).

Конструкты RA-29 - RA-56 идентичны соответственно конструктам RA-1 - RА-32 за исключением того, что в каждом случае промотор, контролирующий ген неомицина, является бактериальным промотором.

Пример 36

Плазмида pNLpuro может быть использована в качестве исходного продукта в создании нескольких различных плазмид, экспрессирующих ВИЧ gag/pol гены. Как указано выше pNLpuro создана для экспрессии gag/pol. Описанная выше плазмида pNL- purovpr сконструирована с изъятием vpr регуляторного гена из ВИЧ gag pol вектора с целью исключить присутствие необходимого регуляторного белка из ряда генов, вводимых при вакцинации. Помимо изъятия vpr обычным специалистам в данной области в плазмиду pNLpuro могут быть внесены и другие изменения применением стандартных методик молекулярной биологии и широкодоступных исходных продуктов.

Человечьи фланкирующие 5' и 3' последовательности из ВИЧ последовательностей могут быть удалены несколькими способами. К примеру, методом ПЦР могут быть амплифицированы и реконструированы только ВИЧ, OB40-puro и pUC18 последовательности.

Из основанных на pNLpuro плазмид может быть изъята psi область, имеющая важное значение для упаковки вируса. Для удаления psi области pNLpuro плазмиду обрезают в присутствии SacI и SpeI. В результате гидролиза удаляется psi область, а также 5'-ДКП, находящийся в нисходящем направлении, и часть gag/pol области в нисходящем направлении от psi. Для повторной вставки не относящихся к psi последовательностей методом ДКП осуществляют амплификацию с регенерацией этих последовательностей. Созданы праймеры, позволяющие регенерировать часть ВИЧ последовательности 5' и 3' до psi без регенерации psi. Праймеры реформируют SacI сайт в 5'-части из 5'-ДКП плазмиды. Праймеры идут в восходящем направлении от SacI сайта до участка, находящегося непосредственно у 3'-части 5'-конца psi области с образованием у 3'-конца AatI сайта. Праймеры, начинающиеся непосредственно в 5'-части psi области, кроме того, создают AatI сайт, а начинающиеся в 3'-части SpeI сайта, регенерируют этот сайт. Созданные методом ПЦР фрагменты гидролизуют в присутствии SacI, AatI и SpeI и лигируют совместно с гидролизованным в присутствии SacI/SpeI pNLpuro-psi фрагмента. ВИЧ 5'-ДКП промотор может быть удален в заменен промотором вируса Молони, ВОМЖМ ДКП, актиновым промотором, миозиновым промотором и ЦМВ промотором.

ВИЧ 3'-ДКП участок полиаденилирования может быть удален и заменен ОВ40 участком полиаденилирования.

Ген, придающий устойчивость к ампициллину, может быть удален или дезактивирован каким-то иным путем.

В Таблице 4 приводится перечень основанных на pNLpuro конструктов, в которых изъяты ВИЧ psi и vpr области и, кроме того, удалены фланкирующие 5'- и 3'-области ВИЧ последовательности человека.

Конструкты от LA-17 до LA-32 идентичны соответственно конструктам от LA-1 до LA-16, за исключением того, что в каждом случае остается по меньшей мере одна из человечьих фланкирующих последовательностей.

Пример 37

При создании других конструктов для экспрессии env гена эта область ВИЧ может быть вставлена в коммерчески доступную плазмиду рСЕР4 (Инвитроген). рСЕР4 плазмида особенно приемлема, поскольку содержит ориджин репликации вируса Эпштейна-Барра и область кодирования ядерного антигена EBNA-1, создающих высококопийную репликацию без интеграции. рСEР4 содержит также гигромициновый маркер под регуляторным контролем тимидинкиназного промотора и участок полиаденилирования. Область кодирования ВИЧ env помещают под регуляторный контроль промотора ЦМВ и участка полиаденилирования ОВ40. Область кодирования ВИЧ env в виде ПЦР фрагмента в 2.3 к.о. из ВИЧ/3В, последовательность в Генбанке под N К03455. Полученную на основе рСЕР4 плазмиду (pRA-100) внедряют вне хромосомы, и плазмида продуцирует gp160 белок.

Пример 38

Для получения других конструктов для экспрессии env гена эта область ВИЧ может быть вставлена в коммерчески доступную плазмиду pREP4 (Инвитроген). pREP4 плазмида особенно приемлема, поскольку содержит ориджин репликации вируса Эпштейна-Барра и область кодирования ядерного антигена EBNA-1, обеспечивающих высококопийную репликацию без интеграции. pREP4 содержит также гигромициновый маркер под регуляторным контролем тимидинкиназного промотора и участка полиаденилирования. Область кодирования ВИЧ env помещают под регуляторный контроль ВСР промотора и ОВ40 участка полиаденилирования. Область кодирования ВИЧ env получена в виде ПЦР фрагмента в 2.3 к.о. ВИЧ/3В формы, последовательность в Генбанке N К03455. Полученную на основе рRЕР4 плазмиду (pRA-101) внедряют внехромосомно, и плазмида продуцирует gp160 белок.

Пример 39

Для создания других конструктов, предназначенных для экспрессии gag/pol генов, эта область ВИЧ может быть вставлена в продажную плазмиду pСЕР4 (Инвитроген). рСЕР4 плазмида особенно приемлема, поскольку содержит ориджин репликации вируса Эпштейна-Барра и область кодирования ядерного антигена EBNA-1, обеспечивающий высококопийную эписомальную репликацию без интеграции. рСЕР4 содержит также гигромициновый маркер под регуляторным контролем тимидинкиназного промотора и участка полиаденилирования. Область кодирования ВИЧ gag/pol помещают под регуляторный контроль ЦМВ промотора и ОВ40 участка полиаденилирования Область кодирования ВИЧ gag/pol получена из ВИЧ MN (последовательность в Генбанке N М17449), и включает vif ген. Ген vpr не включен. Полученная на основе рСЕР4 плазмида (pLA-100), внедренная внехромосомно, продуцирует белки GAG55, обратной транскриптазы, протеазы и интегразы.

Пример 40

Для создания других конструктов, предназначенных для экспрессии gag/pol, эта область ВИЧ может быть вставлена в коммерческую плазмиду pREP4 (Инвитроген). pREP4 плазмида особенно приемлема, поскольку содержит ориджин репликации вируса Эпштейна-Барра и область кодирования ядерного антигена EBNA-1, обеспечивающих высококопийную эписомальную репликацию без интеграции. pREP4 содержит также гигромициновый маркер под регуляторным контролем тимидинкиназного маркера и участка полиаденилирования. Область кодирования ВИЧ gag/pol помещают под регуляторный контроль ЦMB промотора и ОВ40 участка полиаденилирования. Область кодирования ВИЧ gag/pol получена из ВИЧ MN (последовательность в Генбанке N М17449), и включает vif ген. Ген vpr не включен. Полученную на основе pREP4 плазмиду (pLA-101) внедряют внехромосомно, и плазмида продуцирует белки GAG55, обратной транскриптазы, протеазы и интегразы.

Пример 41

Следующий конструкт, называемый здесь pGACPOL.rev, применим для экспрессии ВИЧ gag/pol генов.

Плазмида включает ген устойчивости к канамицину и pBR322 ориджин ДНК репликации. Необходимые для регуляции транскрипции последовательности включают: цитомегаловирусный промотор, усилитель вируса саркомы Рауса и ОВ40 сигнал полиаденилирования. Содержащиеся в pGAGPOL.gev ВИЧ-1 последовательности включают: последовательность, кодирующую р17, р24 и р15 из gag открытой рамки считывания, последовательность, кодирующую протеазу, последовательность, кодирующую обратную транскриптазу и содержащую небольшую делецию, и последовательность, кодирующую неактивное аминоокончание интегразы из роl открытой рамки считывания, а также кодирующую rev последовательность. Каждая ВИЧ последовательность происходит из штамма НХВ2 ВИЧ-1.

В pGAGPOL.rev предусмотрено несколько уровней безопасности. Они включают применение ЦМВ промотора и неретровирусный поли (А) участок. Более того, делеция последовательности ограничивает возможности упаковки вирусной РНК. Кроме того, многочисленные мутации в обратной транскриптазе приводят к форментативно неактивному продукту. Более того, большая делеция в интегразе приводит к неактивному продукту, а для стабилизации бактериальных трансформантов применяют маркер устойчивости к канамицину.

Плазмиду pGAGROL.rev конструируют следующим образом.

Стадия 1. Применяют субклон части ВИЧ-1 (НХВ2) генома, клонированный в Bluescript (Стратаген). Субклон ВИЧ-1 содержит полный 5'-ДКП и остальную часть ВИЧ-1 генома до нуклеотида 5795 (нумерация Генбанка). ВИЧ-1 последовательности получены из HXB2D (СПИД хранилище).

Стадия 2. Подвергают ПЦР часть gag из открытой рамки считывания HXB2D плазмиды (СПИД хранилище). ПЦР фрагмент обрезают в присутствии NotI и SpeI и лигируют с вышеописанным ВИЧ-1 субклоном, рестриктированным в присутствии NotI и SpeI.

Стадия 3. Подвергают ПЦР комплекс gag/pol и часть pol-кодирующих последовательностей из HXB2D плазмиды (СПИД хранилище) с праймерами ПОСЛЕД. N 15 и ПОСЛЕД. N 16. Обрезают ПЦР продукт в присутствии ClaI и лигируют друг с другом. Обрезают лигированные фрагменты в присутствии BclI и SalI и лигируют с плазмидой со стадии 2, гидролизованной в присутствии BclI и SalI.

Стадия 4. Обрезают плазмиду со стадии 3 в присутствии BspMI и EcoRI и вновь лигируют с адаптерами, образованными отжигом линкеров (ПОСЛЕД. N 17 и ПОСЛЕД. N 18).

Стадия 5. Плазмиду со стадии 4 обрезают в присутствии NotI и SalI и лигируют либо с плазмидой 4a или 4b из описания, приведенного для pENV (см. ниже). Обрезают также в присутствии NotI и SatI.

Стадия 6. Плазмиду со стадии 5 рестриктируют в присутствии SalI и MluI и лигируют с ПЦР продуктом, полученным ПЦР rev с праймерами ПОСЛЕД. N 19 и ПОСЛЕД. N 20.

Стадия 7. Плазмиду со стадии 6 обрезают в присутствии NotI и лигируют с продуктом, полученным методом ПЦР rev-ответственного элемента в HXB2D плазмиде (СПИД хранилище) с праймерами ПОСЛЕД. N 21 и ПОСЛЕД. N 22.

Стадии 6 и 7 необязательны.

Пример 42

Следующий конструкт, называемый здесь pENV, применим для экспрессии ВИЧ env генов.

Плазмида включает ген устойчивости к канамицину и pBR322 ориджин ДНК репликации. Необходимые для регуляции транскрипции последовательности включают: цитомегаловирусный промотор, усилитель вируса саркомы Рауса и ОВ40 сигнал полиаденилирования. Содержащиеся в pENV ВИЧ-1 последовательности включают последовательность, кодирующую vpu, последовательность, кодирующую rev, последовательность, кодирующую gp160, последовательность, кодирующую 50% nef, последовательность, кодирующую vif, и последовательность, кодирующую vpr с делецией 13 аминокислот карбокси-конца. Последовательности vpu, rev, gp160 и nef происходят ив ВИЧ-1 штамма MN. Источником vif и vpr последовательностей является ВИЧ-1 штамм НХВ2.

В pGAGROL.rev предусмотрено несколько уровней безопасности. Они включают применение ЦМВ промотора и неретровирусно поли (А) участка. Более того, удален tat, а 50-ая делеция nef приводит к "неактивному" nef продукта. Кроме того, vif и vpr выведены из нормальной последовательности, а частичная делеция vpr дополнительно гарантирует неактивный vpr продукт.

Плазмида pENV создана следующим образом.

Стадия 1. Исходную плазмиду pUC18 гидролизуют в присутствии HindIII и EcoRI. Полученный фрагмент, содержащий ColEl ориджин репликации и laci ген, необходимо лигировать с EcoRI/HindIII фрагментом из pMAMneoBlue, содержащий наш усилитель вируса саркомы. Полученная плазмида или pMAMneoBlue от фирмы Клонтех (Пало Альто, КА) может быть затем гидролизована в присутствии HindIII и BglI. С помощью стандартных методик лигируют с фрагментом, содержащим kan ген, полученным методом ПЦР из генблочной плазмиды (Фармация).

Стадия 2. Если в качестве исходной плазмиды применяют pMAMneoBlue, ее гидролизуют в присутствии MluI и EcoRI, наполняют концы фрагментом Кленова из полимеразы I и повторно лигируют.

Стадия 3. Затем плазмиду, полученную из pMAMneoBlue либо из pUC18, гидролизуют в присутствии HindIII и лигируют с OB40 поли (А) участком и областью раннего сплайсинга, полученную методом ПЦР из рCEP4 (Инвитроген, Сан-Диего, КА) с праймерами ПОСЛЕД N 23 и ПОСЛЕД. N 24.

Стадия 4a. Гидролизуют в присутствии BamHI и лигируют с ЦМВ промотором, полученным методом ПЦР из рСЕР4 (Инвитроген, Сан-Диего, КА) с праймерами ПОСЛЕД. N 25 и ПОСЛЕД. N 26.

Стадия 4b. Гидролизуют в присутствии BamHI и лигируют с MoMLV ДКП, полученным методом ПЦР с праймерами ПОСЛЕД. N 27 и ПОСЛЕД. N 28.

Стадия 5. Гидролизуют в присутствии NotI и MluI и лигируют с областью кодирования gp160, полученной из pMN-ST1 методом ПЦР с праймерами ПОСЛЕД. N 29 и ПОСЛЕД. N 30.

Стадия 6. Гидролизуют в присутствии MluI и лигируют с последовательностями, кодирующими vif во всей его полноте и vpr с делецией 13 а. к. у карбокси-конца, получены из HX2BD плазмиды (СПИД хранилище) методом ПЦР с праймерами ПОСЛЕД. N 31 и ПОСЛЕД. N 32.

Пример 43

Дается система вакцинации, включающая:

фармацевтический препарат, содержащий около 100 мкг pGAGPOL.rev в изотоническом фармацевтически приемлемом растворе и фармацевтический препарат, содержащий 100 мкг pENV в изотоническом фармацевтически приемлемом растворе. Кроме того, система вакцинации предпочтительно включает фармацевтический препарат, содержащий 1 мл 0.5% бупивакаин-HCl и 0.1% метилпарабена в изотоническом фармацевтическом носителе.

В случае применения такой рекомендуемой системы вакцинации вначале проводят первую серию введений, в которой бупивакаин и один из двух фармацевтических препаратов вводят индивидууму внутримышечно, предпочтительно в мышцы руки и ягодицы. Бупивакаин и второй из двух фармацевтических препаратов вводят индивидууму внутримышечно в другом месте, предпочтительно удаленном от места введения первого фармацевтического препарата, предпочтительно в другую руку или ягодицу. Последовательность серии введений может быть разделена во времени, предпочтительно от 48 часов до двух или более недель между двумя введениями.

Система вакцинации может быть использована для вакцинации индивидуума с целью его защиты от ВИЧ инфекции или для лечения ВИЧ-инфицированного индивидуума иммунотерапевтическим средством.

Пример 44

В некоторых своих воплощениях изобретение относится к способу вакцинации индивидуума от ВИЧ введением единственного инокулята. Такой инокулят включает генетический конструкт, содержащий по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно более двух или ряд генов ВИЧ вируса или все структурные гены. Однако инокулят не содержит полный набор всех ВИЧ генов. При попадании в единичную клетку полного набора вирусных генов возникает вероятность сборки в пределах клетки целого инфекционного вируса. Соответственно, в генетическом конструкте настоящего изобретения отсутствует такой полный набор генов. В целях безопасности один или несколько существенных генов может быть удалено или преднамеренно изменено с дополнительной гарантией исключения образования инфекционной вирусной частицы.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения дается по меньшей мере части одного, двух или всех ВИЧ структурных генов. Структурные гены ВИЧ включают; gag, pol и env. В генетическом конструкте даются части по меньшей мере одного из этих генов. Соответственно, в некоторых вариантах в генетическом конструкте даются по меньшей мере части каждого из gag и pol; в отдельных вариантах в генетическом конструкте дается по меньшей мере часть env; в других вариантах в генетическом конструкте дается по меньшей мере часть gag; в отдельных вариантах в генетическом конструкте дается по меньшей мере часть каждого из pol и env; в отдельных вариантах в генетическом конструкте дается по меньшей мере часть каждого из gag и env; в других вариантах в генетическом конструкте дается по меньшей мере часть pol. Возможно присутствие гена целиком. В любом из указанных конструктов возможно также присутствие ВИЧ регуляторных генов. ВИЧ регуляторные гены включают: vpr, vif, nef, vpu, tat и rev.

Пример 45

В применяемом здесь значении термин "экспрессионная единица" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей промотор, операбельно связанный с кодирующей последовательностью, в свою очередь операбельно связанной с сигналом полиаденилирования. Кодирующая последовательность может кодировать один или несколько белков или их фрагментов. В рекомендуемых вариантах экспрессионная единица находится в пределах плазмиды.

В применяемом здесь значении термин "ВИЧ экспрессионная единица" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей промотор, операбельно связанный с кодирующей последовательностью, в свою очередь операбельно связанной с сигналом полиаденилирования, причем кодирующая последовательность кодирует пептид, имеющий эпитоп, который идентичен или по существу аналогичен эпитопу, обнаруживаемому в ВИЧ белке. Выражение "по существу аналогичный эпитоп" относится к эпитопу, строение которого не идентично строению эпитопа ВИЧ белка, но который, тем не менее, создает клеточную или гуморальную иммунную реакцию, перекрестно реакционную к ВИЧ белку. В рекомендуемых вариантах ВИЧ экспрессионная единица содержит последовательность, кодирующую один или несколько ВИЧ белков или их фрагменты. В рекомендуемых вариантах ВИЧ экспрессионная единица находится в пределах плазмиды.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения дается единичный генетический конструкт, содержащий единственную ВИЧ экспрессионную единицу, включающую ДНК последовательности, кодирующие один или несколько ВИЧ белков или их фрагменты. В применяемом здесь значении термин "конструкт с единственной ВИЧ экспрессионной единицей" относится к единичному генетическому конструкту, содержащему единственную ВИЧ экспрессионную единицу. В рекомендуемых вариантах конструкт с единственной ВИЧ экспрессионной единицей имеет вид плазмиды.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения дается единичный генетический конструкт, включающий более одной ВИЧ экспрессионной единицы, каждая из которых содержит ДНК последовательности, кодирующие один или несколько ВИЧ белков или их фрагменты. В применяемом здесь значении термин "генетический конструкт с рядом ВИЧ экспрессионных единиц" относится к единичной плазмиде, содержащей более одной ВИЧ экспрессионной единицы. В рекомендуемых вариантах конструкт с рядом ВИЧ экспрессионных единиц имеет вид плазмиды.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения дается единичный генетический конструкт, включающий две ВИЧ экспрессионных единицы, каждая из которых содержит ДНК последовательности, кодирующие один или более ВИЧ белков или их фрагменты. В применяемом здесь значении термин "генетический конструкт с двумя ВИЧ экспрессионными единицами" относится к единичной плазмиде, содержащей две ВИЧ экспрессионные единицы, т.е. к генетическому конструкту с рядом ВИЧ экспрессионных единиц, содержащему две ВИЧ экспрессионных единицы. В случае генетического конструкта с двумя ВИЧ экспрессионными единицами рекомендуется, чтобы одна из ВИЧ экспрессионных единиц функционировала в направлении, противоположном функционированию другой ВИЧ экспрессионной единицы. В рекомендуемых вариантах генетический конструкт с двумя ВИЧ экспрессионными единицами имеет вид плазмиды.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения дается ВИЧ генетическая вакцина, содержащая единственный генетический конструкт. Единственный генетический конструкт может представлять собой генетический конструкт с единственной ВИЧ экспрессионной единицей, двумя ВИЧ экспрессионными единицами или генетический конструкт с рядом ВИЧ экспрессионных единиц, в котором содержится более двух ВИЧ экспрессионных единиц.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения дается ВИЧ генетическая вакцина, содержащая более одного генетического конструкта в единственном инокуляте.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения дается ВИЧ генетическая вакцина, содержащая более одного генетического конструкта в более чем одном инокуляте. В применяемом здесь значении термин "множественный инокулят" относится к генетической вакцине, включающей более одного генетического конструкта, каждый из которых вводят отдельно. В некоторых воплощениях настоящего изобретения дается ВИЧ генетическая вакцина, содержащая два генетических конструкта. Каждый генетический конструкт может представлять собой независимо от другого генетический конструкт с единственной ВИЧ экспрессиониой единицей, генетический конструкт с двумя ВИЧ экспрессионными единицами или генетический конструкт с рядом ВИЧ экспрессионных единиц, в котором содержится более двух ВИЧ экспрессионных единиц. В некоторых вариантах оба генетических конструкта представляют собой генетический конструкт с единственной ВИЧ экспрессионной единицей. В отдельных вариантах оба генетических конструкта представлены генетическими конструктами с двумя ВИЧ экспрессионными единицами. В других вариантах оба генетических конструкта представлены генетическими конструктами с рядом ВИЧ экспрессионных единиц. В некоторых вариантах один генетический конструкт является генетическим конструктом с единственной ВИЧ экспрессионной единицей, а другой - генетическим конструктом с двумя ВИЧ экспрессионными единицами. Для обычного специалиста совершенно очевидны многие вариации, зависящие от числа генетических конструктов, применяемых в генетической вакцине, и числа ВИЧ экспрессионных единиц, которые могут присутствовать в каждом генетическом конструкте.

Рекомендуется, чтобы генетические конструкты настоящего изобретения не содержали определенных ВИЧ последовательностей, в частности, тех, которые принимают участие в интеграции ВИЧ генома в хромосомное вещество клетки, в которую вводится конструкт. Рекомендуется, чтобы генетические конструкты настоящего изобретения не содержали ПДК из ВИЧ. Рекомендуется также, чтобы генетические конструкты настоящего изобретения не содержали psi сайта ВИЧ. Кроме того, рекомендуется, чтобы были подвергнуты делеции ген обратной транскриптазы и ген интегразы. Делеции включают делецию только некоторых кодонов или замену отдельных кодонов с целью существенного изменения гена. К примеру, инициирующий кодон может быть делетирован, изменен или смещен за рамку с образованием нуклеотидной последовательности, кодирующей неполный или нефункциональный продукт.

Рекомендуется также, чтобы генетические конструкты настоящего изобретения не содержали транскрибируемый tat из ВИЧ. Ген tat, перекрывающий rev ген, может быть полностью изъят путем замены кодонов, кодирующих rev, другими кодонами, кодирующими ту же аминокислоту для rev, но не кодирующими необходимую tat аминокислоту в рамке считывания, в которой кодируется tat. Или же отключаются только некоторые кодоны путем замены, а по существу делеции инициирующего кодона для tat и/или путем замены, а по существу делеции достаточных кодонов с образованием в результате нуклеотидной последовательности, кодирующей неполный или нефункциональный tat.

Рекомендуется, чтобы генетический конструкт включал кодирующие последовательности, кодирующие пептиды, имеющие по меньшей мере один эпитоп, идентичный или по существу аналогичный эпитопу из ВИЧ gag, pol, env или rev белков. Еще более предпочтительно, если генетический конструкт включает кодирующие последовательности, которые кодируют по меньшей мере один из ВИЧ gag, pol, env или rev белков или их фрагменты. Рекомендуется, чтобы генетический конструкт включал кодирующие последовательности, кодирующие пептиды, содержащие более одного эпитопа, идентичного или по существу аналогичного эпитопу из ВИЧ gag, pol, env или rev белков. Более предпочтительно, если генетический конструкт включает последовательности, кодирующие более одного ВИЧ gag, pol, env или rev белков или их фрагменты.

В некоторых вариантах генетический конструкт включает последовательности, кодирующие пептиды, имеющие по меньшей мере один эпитоп, идентичный или по существу аналогичный эпитопу из ВИЧ vif, vpr, vpu или nef белков. В отдельных вариантах генетический конструкт включает последовательности, кодирующие по меньшей мере один из ВИЧ vif, vpr, vpu или nef белков.

Генетический конструкт с единственной ВИЧ экспрессионной единицей может включать области кодирования одного или нескольких пептидов, разделяющих по меньшей мере один эпитоп с ВИЧ белком или его фрагментом в единственной экспрессионной единице под регуляторным контролем единственного промотора и сигнала полиаденилирования. Рекомендуется, чтобы генетические конструкты кодировали более одного ВИЧ белка или его фрагменты. Промотором может быть любой, функциональный в клетке человека промотор. В качестве промотора рекомендуется ОВ40 промотор или ЦМВ промотор, предпочтительно ЦМВ непосредственно ранний промотор. Сигналом полиаденилирования может служить любой функциональный в клетке человека сигнал полиаденилирования. В качестве сигнала полиаденилирования рекомендуется ОВ40 сигнал полиаденилирования, предпочтительно ОВ40 малый сигнал полиаденилирования. Если в единственной экспрессионной единице имеются более одной области кодирования, эти области могут непосредственно примыкать друг к другу или могут быть разделены некодирующими областями. Для правильной экспрессии область кодирования должна иметь инициирующий кодон и терминирующий кодон.

Генетический конструкт с двумя ВИЧ экспрессионными единицами может включать области кодирования одного или нескольких пептидов, разделяющих по меньшей мере один эпитоп с ВИЧ белком или его фрагментом в каждой из двух экспрессионных единиц. Каждая экспрессионная единица находится под регуляторным контролем единственного промотора и сигнала полиаденилирования. В некоторых вариантах рекомендуется, чтобы генетические конструкты кодировали более одного ВИЧ белка или его фрагмента. В некоторых вариантах рекомендуется, чтобы в одной экспрессионной единице присутствовали нуклеотидные последовательности, кодирующие gag и pol, а в другой присутствовали нуклеотидные последовательности, кодирующие env и rev. Промотор может быть представлен любым функциональным в клетке человека промотором. В качестве промотора рекомендуется ОВ40 промотор или ЦМВ промотор, предпочтительно непосредственно ранний ЦМВ промотор. Сигнал полиаденилирования может быть представлен любым функциональным в клетке человека сигналом полиаденилирования. В качестве сигнала полиаденилирования рекомендуется ОВ40 сигнал полиаденилирования, предпочтительно ОВ40 малый сигнал полиаденилирования. Если в экспрессионной единице имеется более одной области кодирования, эти области могут непосредственно примыкать друг к другу или могут быть разделены некодирующими областями. Для правильной экспрессии области кодирования должны иметь инициирующий кодон и терминирующий кодон.

Согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения МНС Класса II перекрестно реакционный эпитоп в env изъят и заменен аналогичной областью из ВИЧ II.

Если генетический конструкт содержит gag и/или pol, как правило, важно, чтобы в этом случае присутствовал и rev. Для повышенной экспрессии gag и pol вместе с этими генами помимо rev может быть предусмотрен и rev-респондирующий элемент.

При получении генетических конструктов рекомендуется, чтобы применяемый в плазмиде 1 env ген происходил из MN или MN-подобных изолятов, включая клинические MN-подобные изоляты, предпочтительно несинцитиально индуцируемые клинические изоляты, предпочтительно те клинические изоляты, которые являются макрофаговыми тропиками из клинических изолятов ранней стадии.

Альтернативным сплайсингом из единственной экспрессионной единицы может быть получен целый ряд белков. Обеспечением сигналов сплайсинга можно достигнуть альтернативного сплайсинга, в котором создаются различные матрицы, кодирующие разные белки.

Пример 46

На фиг. 8 показаны четыре скелета: A, B, C и D. На фиг. 9 показаны вставки: 1, 2, 3 и 4. Вставка 1 поддерживает экспрессию gag и pol; rev-респондирующий элемент клонирован путем, при котором сохраняется ВИЧ сплайс-акцептор. Вставка 2 аналогична вставке 1 в том, что также поддерживает экспрессию gag и pol, но при этом rev-респондирующий элемент клонируют без сохранения ВИЧ сплайс-акцептора. Вставка 3 поддерживает экспрессию gag и pol, включает делецию гена интегразы и не включает цис-действующего rev-респондирующего элемента. Вставка 4 поддерживает экспрессию rev, vpu и env. Ген env может иметь МНС Класса II перекрестно реакционный эпитоп, измененный с удалением перекрестной реакционности; петля V3 может быть изменена с целью исключения возможности образования синцитий.

В некоторых вариантах скелет А используют со вставкой 1. Подобные конструкты возможно содержат ОВ40 ориджин репликации. Плазмида pAlori+ представляет собой скелет А со вставкой 1 и ОВ40 ориджином репликации. Плазмида pAlori- представляет собой скелет А со вставкой 1 и без ОВ40 ориджина-репликации. Кроме того, как pAlori+, так и pAlori- могут включать интегразу, что приводит к плазмидам pAlori+int+ и pAlori-int+ соответственно. Плазмиды pAlori+, pAlori-, pAlori+int+ и pAlori-int+ могут быть дополнительно модифицированы функциональной делецией гена обратной транскриптазы (RT) с образованием соответственно pAlori+RT-, pAlori-RT-, pAlori+int+RT-и pAlori-int+RT-.

В некоторых вариантах скелет А применяют со вставкой 2. Подобные конструкты возможно содержат ОВ40 ориджин репликации. Плазмида pA2ori+ состоит из скелета А со вставкой 2 и ОВ40 ориджина репликации. Плазмида pA2ori- состоит из скелета А со вставкой 2, но без ОВ40 ориджина репликации. Кроме того, как pA2ori+, так и pA2ori- могут включать интегразу, что приводит к плазмидам pA2ori+int+ и pA2ori-int+ соответственно. Плазмиды pA2ori+, pA2ori-, pA2ori+int+ и pA2ori-int+ могут быть дополнительно модифицированы функциональной делецией гена обратной транскриптазы (RT) с образованием соответственно pA2ori+RT-, pA2ori-RT-, pA2ori+int+RT- и pA2ori-int+RT-.

В некоторых вариантах скелет В применяют со вставкой 1. Подобные конструкты возможно содержат ОВ40 ориджин репликации. Плазмида pBlori+ состоит из скелета В со вставкой 1 и ОВ40 ориджином репликации. Плазмида pBlori- состоит из скелета В со вставкой 1, но без ОВ40 ориджина репликации. Кроме того, как плазмида pBlori+, так и pBlori- могут включать интегразу, что приводит к плазмидам pBlori+int+ и pBlori-int+ соответственно. Плазмиды pBlori+, pBlori-, pBlori+int+ и pBlori-int+ могут быть дополнительно модифицированы функциональной делецией гена обратной транскриптазы (RT) с образованием соответственно pBlori+RT-, pBlori-RT-, pBlori+int+RT- и pBlori-int+RT-.

В некоторых вариантах скелет В применяют со вставкой 2. Такие конструкты возможно содержат ОВ40 ориджин репликации Плазмида pB2ori+ состоит из скелета В со вставкой 2 и ОВ40 ориджина репликации. Плазмида pB2ori- состоит из скелета В со вставкой 2, но без ОВ40 ориджина репликации. Кроме того, как pB2ori+, так и pB2ori- могут включать интегразу, что приводит к плазмидам pB2ori+int+ и pB2ori-int+ соответственно. Плазмиды pB2ori+, pB2ori-, pB2ori+int+ и pB2ori-int+ могут быть дополнительно модифицированы с функциональной делецией гена обратной транскриптазы (RT) с образованием соответственно pB2ori+RT-, pB2ori-RT-, pB2ori+int+RT- и pB2ori-int+RT-.

В некоторых вариантах скелет А минус rev применяют со вставкой 3. Такие конструкты возможно содержат ОВ40 ориджин репликации. Плазмида pA/r-3ori+ имеет скелет А со вставкой 3 и ОВ40 ориджином репликации. Плазмида pA/r-3ori- имеет скелет А минус rev со вставкой 3 и без ОВ40 ориджина репликации. Кроме того, как pA/r-3ori+, так и pA/r-3ori- могут включать интегразу, что приводит к плазмидам pA/r-3ori+int+ и pA/r-3ori-int+ соответственно. Плазмиды pA/r-3ori+, pA/r-3ori-, pA/r-3ori+int+ и pA/r-3ori-int+ могут быть дополнительно модифицированы функциональной делецией гена обратной транскрип-тазы (RT) с образованием соответственно pA/r-3ori+RT-, pA/r-3ori-RT-, pA/r-3ori+int+RT- и pA/r-3ori-int+RT-.

В некоторых вариантах скелет С применяют со вставкой 1. Такие конструкты возможно содержат ОВ40 ориджин репликации. Плазмида pClori+ имеет скелет С со вставкой 1 и ОВ40 ориджином репликации. Плазмида pClori- имеет скелет С со вставкой 1, но без ОВ40 ориджина репликации. Кроме того, как pClori+ так и pClori- могут включать интегразу, что приводит к плазмидам pClori+int+ и pClori-int+ соответственно. Плазмиды pClori+, pClori-, pClori+int+ и pClori-int+ могут быть дополнительно модифицированы функциональной делецией гена обратной транскриптазы (RT) с образованием соответственно pClori+RT-, pClori-RT-, pClori+int+RT- и pClori-int+RT-.

В некоторых вариантах скелет С применяют со вставкой 2. Такие конструкты возможно содержат ОВ40 ориджин репликации. Плазмида pC2ori+ имеет скелет С со вставкой 2 и ОВ40 ориджином репликации. Плазмида pC2ori- имеет скелет С со вставкой 2, но без ОВ40 ориджнна репликации. Кроме того, как pC2ori+, так и pC2ori- могут включать интегразу, что приводит к плазмидам pC2ori+int+ и pC2ori-int+ соответственно. Плазмиды pC2ori+, pC2ori-, pC2ori+int+ и pC2ori-int+ могут быть дополнительно модифицированы функциональной делецией гена обратной транскриптазы (RT) с образованием соответственно pC2ori+RT-, pC2ori-RT-, pC2ori+int+RT- и pC2ori-int+RT-.

В некоторых вариантах скелет С применяют со вставкой 3. Такие конструкты возможно содержат ОВ40 ориджин репликации. Плазмида pC3ori+ имеет скелет С со вставкой 3 и ОВ40 ориджином репликации. Плазмида pC3ori- имеет скелет С со вставкой 3, но без ОВ40 ориджина репликации. Кроме того, как pC3ori+, так и pC3ori- могут включать интегразу, что приводит к плазмидам pC3ori+int+ и pC3ori-int+ соответственно. Плазмиды pC3ori+, pC3ori-, pC3ori+int+ и pC3ori-int+ могут быть дополнительно модифицированы функциональной делецией гена обратной транскриптазы (RT) с образованием соответственно pC3ori+RT-, pC3ori-RT-, pC3ori+int+RT- и pC3ori-int+RT-.

В некоторых вариантах скелет D применяют со вставкой 4. Такие конструкты возможно содержат ОВ40 ориджин репликации. Плазмида pD4ori+ имеет скелет D со вставкой 4 и ОВ40 ориджином репликации. Плазмида pD4ori- имеет скелет D со вставкой 4, но без ОВ40 ориджина репликации.

Пример 47

В некоторых вариантах в качестве генетической вакцины дается единственная экспрессионная единица/единственный инокулят. Вакцина представляет собой генетический конструкт, включающий последовательность, кодирующую пептид, в состав которого входит по меньшей мере один эпитоп, идентичный или по существу аналогичный эпитопам ВИЧ белков. Кодирующая последовательность находится под регуляторным контролем непосредственно раннего промотора ЦМВ и малого сигнала полиаденилирования ОВ40.

В некоторых вариантах в качестве генетической вакцины дается единственная экспрессионная единица/единственный инокулят. Вакцина представляет собой генетический конструкт, включающий последовательность, кодирующую по меньшей мере один ВИЧ белок или его фрагмент. Кодирующая последовательность находится под регуляторным контролем непосредственно раннего промотора ЦМВ и малого сигнала полиаденилирования ОВ40. ВИЧ белок выбирают из группы, включающей: gag, pol, env и rev. В некоторых рекомендуемых вариантах генетическая вакцина представляет собой генетический конструкт, включающий последовательность, кодирующую по меньшей мере два ВИЧ белка или их фрагменты, выбранных из группы, включающей: gag, pol, env и rev или их фрагменты. В отдельных рекомендуемых вариантах генетическая вакцина представляет собой генетический конструкт, включающий последовательность, кодирующую по меньшей мере три ВИЧ белка или их фрагменты, выбранных на группы, включающей: gag, pol, env и rev или их фрагменты. В некоторых рекомендуемых вариантах дается генетическая вакцина, представляющая собой генетический конструкт, включающий последовательность, кодирующая gag, pol, env и rev или их фрагменты.

В некоторых вариантах дается двойная экспрессионная единица/единственный инокулят в качестве генетической вакцины. Вакцина представляет собой генетический конструкт, включающий две экспрессионные единицы, каждая из которых содержит последовательности, кодирующие пептид, имеющий по меньшей мере один эпитоп, идентичный или по существу аналогичный эпитопам ВИЧ белков. Кодирующая последовательность находится под контролем ЦМВ непосредственно раннего промотора ЦМВ и ОВ40 малого сигнала полиаденилирования.

В некоторых вариантах в качестве генетической вакцины дается двойная экспрессионная единица/единственный инокулят. Вакцина представляет собой генетический конструкт, включающий две экспрессионные единицы, каждая из которых содержит последовательность, кодирующую по меньшей мере один ВИЧ белок или его фрагмент. Каждая экспрессионная единица содержит кодирующую последовательность, находящуюся под регуляторным контролем ЦМВ непосредственно раннего промотора и ОВ40 малого сигнала полиаденилирования. ВИЧ белки выбирают из группы, включающей: gag, pol, env и rev. В некоторых рекомендуемых вариантах дается генетическая вакцина представляющая собой генетический конструкт, включающий две экспрессионные единицы, по меньшей мере одна из которых содержит последовательность, кодирующую по меньшей мере два ВИЧ белка или их фрагменты, выбранные из группы, включающей: gag, rol, env и rev или их фрагменты, а другая содержит по меньшей мере один ВИЧ белок или его фрагменты, выбранные из группы, включающей gag, pol, env и rev или их фрагменты. В отдельных рекомендуемых вариантах дается генетическая вакцина, представляющая собой генетический конструкт, включающий две экспрессионные единицы, по меньшей мере одна из которых содержит последовательность, кодирующую по меньшей мере три ВИЧ белка или их фрагменты, выбранные из группы, включающей: gag, pol, env и rev или их фрагменты, а другая содержит по меньшей мере один ВИЧ белок или его фрагменты, выбранный из группы, включающей: gag, pol, env и rev или их фрагменты. В других рекомендуемых вариантах дается генетическая вакцина, представляющая собой генетический конструкт, состоящий из двух экспрессионных единиц и включающий последовательность, кодирующую gag, pol, env и rev или их фрагменты.

Пример 48

Для применения в анти-ВИЧ фармацевтическом наборе или фармацевтическом препарате создан генетический конструкт (плазмида pCMN16016). pCMN16016 конструируют следующим образом.

Стадия 1. Для получения из ВИЧ/MN геномной ДНК ПЦР фрагмента применяют праймеры ПОСЛЕД. N 35 и ПОСЛЕД. N 34.

Стадия 2. Для получения ПЦР фрагмента из ВИЧ/MN геномной ДНК применяют праймеры ПОСЛЕД. N 33 и ПОСЛЕД. N 36.

Стадия 3. Праймеры ПОСЛЕД. N 35 и ПОСЛЕД. N 36 смешивают с 2 мкл продукта реакции стадий 1 и 2.

Стадия 4. Продукт реакции стадии 3 разрезают с помощью NotI и MluI и вставляют в скелет А, описанный в Примере 46 и разрезанный NotI и Mlul.

В результате создают плазмиду pCMN16016, содержащую в качестве вставки в скелет А область кодирования, кодирующую ENV белок MN штамма с rev областью и половиной nef, имеющий изменения в HLA-DB области ВИЧ-2.

Пример 49

Плазмиду pGAGPOL. rev2 получают следующим образом. Сначала готовят скелет. Затем образуют вставку с ВИЧ gag и pol генами, которую вставляют в скелет.

Скелет получают следующим образом.

Стадия 1. Плазмиду pMAMneo (Клонтех) гидролизуют в присутствии BglI. Наполняют фрагментом Кленова полимеразы I. Разрезают HindIII. Выделяют на геле фрагмент в 1763 п.о.

Стадия 2. Из плазмиды pJ4kan+ амплифицируют KanR ген (ген устойчивости к канамицину, получен от фирмы Фармация Инк., клонирован в pJ4, полученную в виде дара от Имперского Фонда раковых исследований, Великобритания; впервые сообщения о конструировании pJ4 появились в работе: Morgenstern J. P., Н. Land, Nucl. Acids Res. 18(4), 1068, которая вводится здесь в качестве ссылки, с олигонуклеотидами ПОСЛЕД. N 37 и ПОСЛЕД. N 38. Затупляют ПЦР продукт. Разрезают HindIII. ПЦР фрагмент очищают на геле.

Стадия 3. Лигируют векторный скелет, образованный из pMAMneo и описанный для стадии 1, с ПЦР продуктом, кодирующим KanR ген и описанным для стадии 2. Выделяют плазмиду, содержащую KanR ген и бактериальный ориджии репликации.

Стадия 4. Полученную плазмиду гидролизуют в присутствии MluI, наполняют фрагментом Кленова из ДНК полимеразы I. Лигируют с SacII линкером (Нью Ингланд Биолабз).

Стадия 5. Полученную на стадии 4 плазмиду гидролизуют в присутствии AseI и SspI.

Стадия 6. Подвергают ПЦР часть KanR гена из плазмиды, описанной для стадии 3, с применением праймеров ПОСЛЕД. N 39 и ПОСЛЕД. 40. Разрезают ПНР продукт SspI и AseI.

Стадия 7. Лигируют самый крупный фрагмент, полученный на стадии 5, с ПЦР продуктом, полученным на стадии 6.

Стадия 8. Разрезают продукт лигирования/плазмиду,

полученный на стадии 7, в присутствии HindIII. Наполняют фрагментом Кленова ДНК полимеразы I.

Стадия 9. В присутствии SelI разрезают рСЕР4 (Инвитроген) с выделением ДНК фрагмента, содержащего промотор ЦМВ, полилинкер и поли(А) участок ОВ40. Полученный фрагмент очищают и затупляют фрагментом Кленова ДНК полимеразы I.

Стадия 10. Лигируют полученную на стадии 8 плазмиду с полученным на стадии 9 фрагментом. Выделяют плазмиду, содержащую бактериальный ориджин репликации, KanR ген, ВСР усилитель, ЦМВ промотор, полилинкер и ОВ40 поли(А) участок.

Стадия 11. Полученную на стадии 10 плазмиду разрезают BamHI и NbeI.

Стадия 12. Отжигают олигонуклеотиды ПОСЛЕД. N 41 и ПОСЛЕД. N 42.

Стадия 13. Лигируют полученную на стадии 10 плазмиду с полученными на стадии 12 олигонуклеотидами. Выделяют плазмиду, содержащую адаптор со стадии 12.

Стадия 14. Полученную на стадии 13 плазмиду гидролизуют в присутствии SalI и MluI.

Стадия 15. Методом ПЦР амплифицируют rev открытую рамку считывания с применением BBG35 (РД Системс Инк. Миннеаполис, МН, содержит область кодирования rev из ВИЧ штамма НХ3В в pUC19) в качестве матрицы и праймеров ПОСЛЕД. N 43 и ПОСЛЕД. N 44. ПЦР продукт гидролизуют в присутствии SalI и MluI.

Стадия 16. Полученную на стадии 14 плазмиду лигируют с полученным на стадии 15 ПЦР продуктом. Выделяют плазмиду, содержащую область кодирования rev.

Получение gag/pol вставки.

Стадия 1. Субклонируют часть ВИЧ-1 (НХВ2) генома, клонированного в Bluescript (Стратаген). Субклон ВИЧ-1 содержит полный 5'-ДКП и остаток ВИЧ-1 генома до нуклеотида 5795 (Нумерация Генбанка), клонированные в XbaI и SalI сайтах Blue-script. Из HXB2D плазмиды (СПИД хранилище) получают ВИЧ-1 последовательности.

Стадия 2. Подвергают ПЦР часть области кодирования gag из открытой рамки считывания плазмиды, описанной на стадии 1 (субклон части ВИЧ-1 НХВ2 генома, клонированного в Blue-script), с применением праймеров ПОСЛЕД. N 45 и ПОСЛЕД. N 46.

Стадия 3. Описанную на стадии 1 плазмиду (субклон части ВИЧ-1 НХВ2 генома, клонированного в Bluescript) гидролизуют в присутствии EcoRI. Очищают плазмиду, содержащую скелет pBluescript, 5' ВИЧ-1 ДКП, область кодирования gag и часть области кодирования pol, и религируют.

Стадия 4. Обрезают полученную на стадии 3 плазмиду в присутствии NotI и SpeI и лигируют с описанным для стадии 2 ПЦР фрагментом после его гидролиза в присутствии NotI и SpeI. Выделяют плазмиду, содержащую ПЦР фрагмент вместо NotI/SpeI фрагмента, включающего 5' ВИЧ-1 ДКП.

Стадия 5. Полученную на стадии 4 плазмиду гидролизуют в присутствии EcoRI и SalI.

Стадия 6. Отжигают олигонуклеотиды ПОСЛЕД. N 47 и ПОСЛЕД. N 48.

Стадия 7. Лигируют полученную на стадии 5 плазмиду с полученным на стадии 6 адаптором. Выделяют плазмиду, содержащую адаптор, клонированный в EcoRI/SalI сайтах.

Стадия 8. Полученную на стадии 7 плазмиду гидролизуют в присутствии NdeI и EcoRI.

Стадия 9. Методом ПЦР амплифицируют Rev-респондирующий элемент (RRE) из плазмиды, содержащей RRE последовательности из ВИЧ-1 штамма НХВ2, с применением праймеров ПОСЛЕД. N 49 и ПОСЛЕД. N 50. ПЦР продукт гидролизуют в присутствии NdeI и EcoRI.

Стадия 10. Лигируют полученную на стадии 8 плазмиду с полученным на стадии 9 ПЦР продуктом. Выделяют плазмиду, содержащую вставку с RRE последовательностью.

Стадия 11. Полученную на стадии 10 плазмиду гидролизуют в присутствии NotI и SalI и выделяют фрагмент, содержащий область кодирования gag, область кодирования модифицированного pol и RRE последовательность.

Стадия 12. По вышеприведенной методике получения скелета в присутствии NotI и SalI гидролизуют полученную на стадии 16 плазмиду.

Стадия 13. Полученную на стадии 12 плазмиду лигируют со вставкой, полученной на стадии 11. Выделяют плазмиды, содержащие вставку, включающую область кодирования gag, область кодирования модифицированного pol и RRE последовательность.

Стадия 14. Полученную на стадии 13 плазмиду гидролизуют в присутствии XbaI и NheI, концы затупляют и повторно лигируют.

Стадия 15. Получение на стадии 14 плазмиду гидролизуют в присутствии KpnI и выделяют самый крупный фрагмент.

Стадия 16. Отжигают олигонуклеотиды ПОСЛЕД. N 51 и ПОСЛЕД. N 52.

Стадия 17. Очищенный плазмидный фрагмент, полученный на стадии 15, лигируют с полученным на стадии 16 адаптором. Выделяют плазмиду, содержащую адаптор, вставленный в KpnI сайт полученной на стадии 15 плазмиды.

Пример 50. Генетическая вакцинация генами регуляторных белков

Затруднения, возникающие при борьбе с ВИЧ, частично связаны с чрезвычайной изменчивостью вируса и его способностью быстро мутировать в новые формы. Существуют существенные изменения белковой последовательности не только в ВИЧ изолятов, обнаруженные среди населения земли в целом, но вирус мутирует настолько быстро, что каждый ВИЧ-инфицированный индивидуум на деле является носителем целого ряда микровариантов ВИЧ. Такие ВИЧ изоляты характеризуются отличиями в эффективности репликации, тропизме, склонности к нейтрализации и устойчивости к лекарственному средству. С появлением устойчивых к лекарству мутантов преимущества лекарственной терапии исчезают. В случае АЗТ устойчивость к лекарственному средству обычно возникает в течение первого года лечения. Такое постоянное возникновение "ускользнувших" мутантов может частично влиять на способность ВИЧ в конце концов подавлять защиту хозяина после длительного периода, в течение которого вирус, видимо, находится под контролем.

Имеются сообщения о таком мутационном дрейфе в различных участках gp120 оболочечного гликопротеина, включая принципиальные нейтрализующие домены V3 петли, а также в белках ядра ВИЧ. ВИЧ регуляторные белки гораздо более консервативны, чем структурные белки, и, кроме того, характеризуются меньшим мутационным дрейфом во времени. Таким образом, регуляторные белки представляются привлекательной целью для противовирусной атаки.

ВИЧ отличается заметной временной регуляцией экспрессии регуляторных белков по сравнению со структурными. На ранних этапах вирусной репликации преобладает мРНК, кодирующая регуляторные белки Tat, Rev и Nef в то время, как на поздних этапах наблюдается повышенная экспрессия мРНК, кодирующей структурные белки, в том числе Gag, Pol и Env предшественники и многие вспомогательные белки. Такое смещение от ранних к поздним этапам прекращается при достижении определенного уровня Rev белка. Преобладание Tat, Rev и Nef на ранних этапах вирусного цикла также делает эти белки благоприятными целями для противовирусной атаки. Это особенно справедливо для tat и rev, играющих абсолютно важную роль в транскрипционной и посттранскрипционной регуляции ВИЧ генной экспрессии, и которые преобладают на ранних этапах цикла вирусной репликации перед транскрипцией вирусных структурных белков и продуцированием инфекционных вирусных частиц.

В отличие от tat и rev, однозначно играющих существенную роль в ВИЧ репликации, другие белки, например: nef, vpr, vif и vpu иногда называют "вспомогательными" белками. Их функции менее хорошо изучены, и степень, в которой может быть ослаблена вирусная репликация при потере определенной функции, колеблется в широких пределах и может зависеть от инфицированной клетки-хозяина. Тем не менее, сильная степень консервативности таких функций в самых различных ВИЧ изолятах, а также в других приматных вирусах иммунодефицита предполагает важность таких "вспомогательных" функций в процессе естественного инфицирования (см. в целом: Terwilliger E.F. (1992) AIDS Research Peviews 2, 3-27, ред. W.C. Koff, F. Wong-Staal, R.C. Kennedy, Нью-Йорк, Марсель Деккер, Инк.). В самом деле, приматные рекомбинантные вирусы с делецией vpr, nef или vif непатогены in vivo, что еще больше подчеркивает важность этих вспомогательных генов в жизненном цикле вируса.

Существуют некоторые свидетельства того, что защитной иммунной реакции против ВИЧ на более высоком уровне можно достигнуть проведением отбора нескольких регуляторных и/или ферментативных белков, но не всего набора ВИЧ генов. Соответственно, стратегия сфокусированной вакцинации желательно включает генетическую вакцинацию с применением последовательностей, кодирующих один или несколько регуляторных, неструктурных ВИЧ белков, в том числе tat, rev, vpr, nef, vpu или vif. Только vpr, как найдено, ассоциируется с вирусными частицами, в то время как другие регуляторные белки, включая tat, rev, nef, vif и vpu не связаны с вирионом.

В некоторых вариантах генетической вакцинации от ВИЧ с применением регуляторных генов один из tat, rev, nef, vif или vpu генов или несколько таких генов вставляют в описанный в Примере 46 скелет А. Рекомендуется применение tat и/или rev. Е некоторых вариантах в скелет А, описанный в Примере 46, вставляют tat или rev. В некоторых вариантах применяют (далее следует перечень в порядке снижения приемлемости в качестве целей) nef, vpr, vif и vpu. Рекомендуется применение более одного регуляторного гена, в том числе: tat и rev; tat, rev и nef; tat, rev, nef и vpr; tat, rev, nef, vpr и vif; tat, rev, nef, vpr, vif и vpu, а также их комбинаций и возможно таких дополнительных регуляторных генов, как tev.

Tat белок является трансактиватором ДКП-направленной генной экспрессии. Белок абсолютно необходим для ВИЧ репликации. Tat. продуцируется на ранних этапах цикла вирусной репликации, и функциональный Tat необходим для экспрессии Gag, Pol, Env и Vpr. Преобладающей формой Tat является белок из 86 аминокислот, происходящий из двухэкзонной мРНК. Амино-концевых 58 аминокислот достаточно для трансактивации, хотя и с пониженной активностью. Tat влияет на цис-действующую последовательность, называемую tar, с обеспечением значительного повышения ДКП-ведомой генной экспрессии. Влияние Tat может осуществляться частично путем повышения синтеза РНК и частично путем увеличения количества белка, синтезируемого через РНК транскрипт. До недавнего времени считалось, что Tat влияет только на ВИЧ-1 ДКП. Однако появились также сообщения о Tat-активируемой экспрессии из позднего промотора JC вируса. В качестве экзогенного фактора Tat может также стимулировать клеточную пролиферацию и может вносить свой вклад в промотирование роста саркомы Капоши у ВИЧ-инфицированных индивидуумов. Вследствие такого потенциально опасного действия на ВИЧ-инфицированных и неинфицированных индивидуумов рекомендуемые tat конструкты, применяемые для генетической вакцинации, модифицированы с экспрессией только нефункционального Tat. Мутации, способные дезактивировать Tat или Rev, могут, кроме того, действовать, как трансдоминантные мутации с потенциальной дезактивацией в результате любого функционального Tat, продуцируемого в организме ВИЧ-инфицированных индивидуумов.

Rev является вторым регуляторным белком ВИЧ, необходимым для вирусной репликации. Rev является белком в 19 кД (116 аминокислот), экспрессируемым из двух кодирующих экзонов, в широком спектре сплайсированных мРНК. Идентифицированы два отличных друг от друга домена: основная область, участвующая в связывании с RRE (Rev-респондирующий элемент) содержащими транскриптами, и домен "активации", индуцирующий в результате связывания ядерный экспорт таких транскриптов. В ходе естественной вирусной инфекции Rev необходим для экспрессии ВИЧ структурных белков Gag, Pol и Env, а также Vpr.

Vpr, являющийся белком в 15 кД (96 аминокислот), находится в большинстве ВИЧ-1 штаммов, хотя Vpr открытая рамка считывания интенсивно усекается во многих вирусных штаммах при интенсивном прохождении в клеточной культуре. Vpr открытая рамка считывания присутствует также в ВИЧ-2 и большинстве изолятах. Vpr является первым ретровирусным регуляторным белком, для которого обнаружена связь с ВИЧ вирусными частицами. Его присутствие в ВИЧ вирионах предполагает возможность участия белка в некоторых ранних этапах цикла вирусной репликации. Vpr ускоряет репликацию ВИЧ, особенно на ранних этапах инфекции. Vpr примерно в три раза повышает уровень экспрессии генов-репортеров, связанных в ВИЧ ДКП. Более того, Vpr и Tat, видимо, действуют синергически на ДКП-связанные гены. Vpr может быть выделен из сыворотки ВИЧ-инфицированных индивидуумов, и, видимо, повышает способность вируса инфицировать новые клетки. Найдено также, что Vpr подавляет клеточную пролиферацию и индуцирует дифференцировку клеток (Levy D.M. и др. Cell (1993) 72, 1-20), открытие, которое может оказаться важным ввиду сообщений о том, что первичные моноциты/макрофаги оказываются инфекционными in vitro только претерпевая дифференцировку (Schuitemaker Н. и др. , J. Clin. Invest. 89, 1154-1160 (1992)). Одинаковые клетки, неспособные поддерживать репликацию ВИЧ, под влиянием Vpr могут быть разрегулированы. К примеру, Vpr может нести ответственность за потерю) мышечной ткани, часто наблюдаемую у больных СПИДом. Вследствие потенциально опасной активности Vpr генетическую вакцинацию следует предпочтительно проводить с модифицированным vpr конструктом, экспрессирующим нефункциональный Vpr белок.

Nef (называемый также в более старых источниках 3'orf) является белком в 25-27 кД. Предполагалось, что Nef может участвовать в разрегулировании CD4+ Т-лимфоцитов. Кроме того, Nef может участвовать в клеточных сигналах. Nef, видимо, имеет важное значение для установления ВИЧ инфекции in vivo. Полагают, что Nef-специфичные ЦТЛ имеют важное значение для регулирования ВИЧ инфекции in vivo.

Vif является цитоплазмическим белком в 23 кД, называемым "фактором инфекционности вируса". Хотя Vif-дефектные мутанты и не являются компромиссными в отношении трансмиссии типа клетка-к-клетке, такие мутанты характеризуются заметным снижением способности инфицировать многие CD4+ клеточные линии. В отсутствие Vif наблюдается снижение отмочковывания и снижение инфекционности. В опытах на приматах мутанты Vif с делецией проявляют жестко сниженную способность создавать инфекцию in vivo. Эти исследования подтверждают клиническую роль Vif в репликации вируса в хозяине.

Vpu является белком в 15-20 кД (81 аминокислота). Хотя Vpu(+) и Vpu(-) вирусы продуцируют одинаковое количество белка, последние отличаются повышенным внутриклеточным аккумулированием вирусных белков одновременно с уменьшением внеклеточного вируса. Это предполагает участие Vpu в сборке и/или выделении вирусных частиц.

Простые ретровирусы, например: мышиные к птичьи вирусы не имеют белков, аналогичных ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV регуляторным белкам. У таких животных ретровирусная инфекция имеет тенденцию к самоограничению с клиренсом вируса и сниженной патогенностью. Аналогично, HTLV-1, включающий только Tax (действующий почти как Tat и, кроме того, проявляющий vpr-подобную активность) и Rex (действующий почти, как Rev), подвергается клиренсу в организме многих индивидуумов. Генетическая вакцинация регуляторными генами, как считают, уместна не только от ВИЧ, но также в случае ВЭБ (X генный продукт), HCV и HTLV-I (Tax) и (Rex). У всех указанных вирусов регуляторные гены, как полагают, играют решающую роль в жизненном цикле вируса и создании инфекции.

Пример 51. Конструирование ВИЧ-1 регуляторной плазмиды (рРЕС)

Плазмиду рРЕС конструируют постадийно, и каждое промежуточное вещество перед продолжением конструирования может быть проверено на экспрессию белка. Экспрессионный вектор, поддерживающий экспрессию tat и rev, конструируют в две стадии. Вначале продукт амплификации, содержащий 5' NheI сайт, ВИЧ-1 основной сплайс-донорный участок, основную часть области кодирования tat, область кодирования, кодирующей аминоконцевую область rev белка, и AvaII сайт, амплифицируют из синтетической матрицы. Такая синтетическая матрица создана применением опубликованных последовательностей НХВ2 штамма ВИЧ-1, полученных из базы данных GenBank, и последовательности изменены мутацией в белке tat цистеиновых остатков в положениях 22 и 30. Такие мутации, как показано, придают tat нефункциональность (Kuppuswany и др. (1989) Hucleic Acids Research 17(9), 3551-3561).

ПЦР продукт лигируют в вектор, гидролизованный в присутствии NheI и AvaII и содержащий ген устойчивости к канамицину и рВР322 ориджин репликации. Кроме того, эта плазмида содержит цитомегаловирусный промотор, усилитель вируса саркомы Рауса, область кодирования rev и ОВ40 сигнал полиаденилирования. Присутствующая в указанной плазмиде rev последовательность происходит из провирусного клона ВИЧ-1 III8. В результате создают экспрессионный вектор, содержащий полную, но мутированную область кодирования tat и полную область кодирования rev.

Проведением последующей стадии создают ПЦР продукт, содержащий AvaII сайт у своего 5'-конца, мутацию у аминокислоты в положении 81 rev, примерно 30% области кодирования rev, примерно 30% области кодирования nef и MluI сайт и 3'-конца. Замена аминокислоты в положении 81, как показано, приводит к удалению rev функции, вследствие чего полученная плазмида будет продуцировать нефункциональный rev белок (Bogard Н., Greene W.C. (1993) J. Virol. 67(5), 2496-2502). Считается, что основная делеция в nef области кодирования приведет к продуцированию нефункционального nef белка. 5' AvaII сайт и мутацию у аминокислоты в положении 81 rev белка вводят в 5' ПЦР праймер, комплементарный области кодирования rev, содержащей как AvaII сайт, так и нуклеотид, кодирующий аминокислоту 81. Применением 3' ПЦР праймера вводятся терминирующая кодон, вызывающий обрыв Nef у аминокислоты в положении 63, и 3' кодирующий клонирование MluI сайт. Матрицей для такой ПЦР амплификации служит плазмида или синтетическая матрица, содержащие области кодирования rev и nef из MN штамма ВИЧ-1. Полученный ПЦР продукт гидролизуют в присутствии AvaII и MluI и применяют для замены меньшего AvaII-MluI фрагмента, образующегося после гидролиза в присутствии AvaII и MluI описанной в предыдущем параграфе tat-rev плазмиды.

Возможно введение в один из двух сайтов этой плазмиды vpr. В одном из подходов vpr может быть амплифицирован применением 5' ПЦР праймера, содержащего MluI сайт в восходящем направлении в последовательности, охватывающей vpr трансляционный инициирующий кодон, и 3' ПЦР праймера, комплементарного vpr терминирующему кодон и последовательностям, фланкирующих кодон и содержащих также MluI сайт клонирования. Последовательности в восходящем направлении от инициирующего кодона содержат сплайс-акцептор. ПЦР продукт может быть гидролизован в присутствии Mlul и вставлен в tat rev net плазмиду, описанную выше, после ее гидролиза в присутствии Mlul.

Или же vpr амплификация может быть осуществлена аналогичным путем, однако ПЦР праймеры должны содержать рестрикционные сайты, совместимые с клонированием в другой вектор так, что тот экспрессируется под контролем второго эукариотного промотора. Происходящая из такой плазмиды кассета, содержащая второй промотор, за которым следует область кодирования vpr, затем поли(А), может быть получена гидролизом ферментами рестрикции, фланкирующими кассету, но не вклинивающимися в ее пределы. Полученный ДНК фрагмент необходимо клонировать в единственный сайт tat, rev, vpr плазмиды выпадающей из области, необходимой для экспрессии tat rev vpr. Таким путем образуют плазмиду с двумя экспрессионными единицами.

Пример 52. Конструирование HCV и HTLV-I плазмид

Аналогичный подход может быть использован для создания плазмиды, экспрессирующей HTLV-1 или HCV кодируемые белки, обладающей ферментативными свойствами, необходимыми для жизненного цикла вируса и/или для регуляторных белков указанных вирусов. В случае HTLV-1 применением плазмидного скелета и стратегии клонирования, аналогичных вышеприведенным, создают плазмиду, кодирующую регуляторный белок Tax. Подобные HCV гены, кодирующие ферментативные белки, включают РНК-зависимую РНК-полимеразу, белок с функциями геликазы/протеазы. Сведения о необходимых последовательностях опубликованы и они могут быть получены в Генбанке. Данные о строении HTLV-1 и HCV приводятся в издании: Cann A.J., Chen I.S.Y. "Вирусология", 2-ое издание, под редакцией B.N. Fiddr, Равен Пресс, Лтд., Нью-Йорк, 1990 и работе: Bradley V.W. Transfusion Medicine Peviews 1(2), 93-102, 1992, соответственно.

Пример 53. Генетическая вакцинация ферментативными генами

Генетическая вакцинация генами, кодирующими белки с функцией ферментов, например ВИЧ pol геном, может также являться важной стратегией борьбы с вирусом, поскольку такие ферменты, как Pol необходимы для продуцирования живого вируса. Без полимеразы или ее любого функционального компонента ВИЧ непатогенен и неинфекционен. Аналогично, ферментативные гены других вирусов, например HBV полимеразы, представляются привлекательными целями для генетической вакцинации. См., напр., Radziwill и др. "Мутационный анализ генного продукта вируса Р гепатита В. Строение домена и активность РНазы Н", J. Virol. 64(2), 613-620 (1990).

Одна из причин привлекательности вирусных ферментов в качестве иммунологических мишений состоит в ограниченной способности аминокислотных последовательностей таких ферментов к мутации с сохранением ими при этом своей ферментативной способности. К примеру, в случае ВИЧ-1 фермент Pol характеризуется ограниченным числом "ускользнувших" мутаций, ассоциируемых с устойчивостью к нуклеотидным аналогам, например АЗТ. Однако подавляющее большинство иммунологических мишеней в белке сохраняются даже в ускользнувших от лекарственного средства мутантах.

Пример 54. Конструирование HBV полимеразной плазмиды

Освещенные в литературе опыты указывают на то, что экспрессия HBV полимеразы достигается в тканевой культуре клеток в случае присутствия в молекуле мРНК как коровой, так и полимеразной открытых рамок считывания. Также показано, что в такой ситуации мутация в АТС ядра не влияет на экспрессию полимеразы.

HBV геном амплифицируют из плазмиды, содержащей димер типа голова-к-хвосту ADW HBV штамма. Поскольку желательна экспрессия только полимеразы, но не ядра, созданный 5' ПСР праймер приводит к мутации трансляционных инициирующих кодонов преядра и ядра. Кроме того, такой праймер вводит также мутантную DRI последовательность с целью исключить возможность образования репликационно-компетентной HBV геномной РНК. Этот ПЦР продукт помещают в плазмиду, содержащую ген устойчивости к канамицину и pBR322 ориджин репликации. Кроме того, такая плазмида содержит цитомегаловирусный промотор, усилитель вируса саркомы Payса и ОВ40 сигнал полиаденилирования. Для предотвращения экспрессии HBV и X генных продуктов трансляционные инициирующие кодоны для поверхностного антигена и продукта области кодирования X подвергают мутации.

Согласно другому подходу к достижению экспрессии HBV полимеразы ПЦР продукт, кодирующий область кодирования полной полимеразы, амплифицируют и клонируют в вектор, содержащий ген устойчивости к канамицину и pBR322 ориджин репликации. Кроме того, такая плазмида содержит цитомегаловирусный промотор, усилитель саркомы Рауса и ОВ40 сигнал полиаденилирования. 5' ПЦР праймер для такой амплификации содержит сайт клонирования и охватывает трансляционный инициирующий кодон гена полимеразы. 3' ПЦР продукт содержит сайт рестрикции для клонирования вставки в экспрессионный вектор и, кроме того, комплементарен традиционному терминирующему кодону гена HBV полимеразы и последовательностям, фланкирующим этот терминирующий кодон. После лигирования указанного ПЦР продукта в плазмиду, содержащую ген устойчивости к канамицину, pBR322 ориджин репликации, цитомегаловирусный промотор, усилитель вируса саркомы Рауса и ОВ40 сигнал полиаденилирования, трансляционные инициирующие кодоны для поверхностного антигена гепатита В и X генов подвергают мутации с целью предотвратить экспрессию этих генных продуктов. Применяемая альтернативная стратегия аналогична вышеприведенной, однако 3' ПЦР праймер в этом случае включает HBVполи(А) сигнал и фланкирующие этот сигнал последовательности. Такой 3' праймер применяют в том случае, если последовательности, включающие и/или окружающие HBVполи(А) сигнал, имеют важное для экспрессии значение. Мутационный анализ показал, что функционирование HBV полимеразного генного продукта можно исключить заменой конкретного нуклеотида (Radziwell G. и др. (1990) J. Virol. 64(2), 613-620). Перед употреблением плазмиды, сконструированной вышеприведенным образом, экспрессируемая полимераза может быть подвергнута мутации созданием одной из таких мутаций или других аналогичных мутаций.

Пример 55

Гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор (GM-CSF) оказывает стимулирующее действие на разнообразные клеточные линии, в том числе нейтрофилы, моноциты/макрофаги и эозинофилы. Действие GM-CSF делает его привлекательной терапевтической моделью. GM-CSF одобрен FDA для применения в аутологичной пересадке костного мозга, и начаты клинические испытания эффективности фактора в лечении различных нейтропений. В настоящее время GM-CSF вводят в виде белка, обычно требующего введения многими дозами. Необходимо получить и очистить такие белки.

Альтернативный подход к применению GM-CSF белка состоит в прямом введении генного конструкта, содержащего ген, кодирующий GM-CSF, в сочетании с введением бупивакаина. Генетически конструкт создают методом ПЦР из GM-CSF гена, включающего сигнальную последовательность. Генетический конструкт предпочтительно содержит ген устойчивости к канамицину (ген аминогликозид-3'фосфотрансферазы), бактериальный ориджин репликации, последовательности, поддерживающие экспрессию области кодирования GM-CSF в клетках, в которые вводят плазмиду, например, векторов, охарактеризованных в виде скелетов в Примере 46. Плазмида предпочтительно содержит ориджин репликации млекопитающего, индуцируемый клеточной репликацией, связанной с введением бупивакаина. В случае применения ВЭБ ориджина репликации включают также последовательность, кодирующую ядерный антиген EBNA-1, вместе с соответствующими регуляторными последовательностями. Праймеры для ПЦР амплификации вставки сайты рестрикции ферментами, позволяющими проводить клонирование в экспрессионный вектор, и комплементарными 5'- и 3'-концам GM-CSF кодирующей последовательности. ПЦР реакцию осуществляют с кДНК клоном по методике Lee и др., Proc. Natl. Acad. Sci. США 82, 4360- 4364.

Пример 56

Хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ) является клональным миелопролиферативным нарушением кроветворных стволовых клеток, ассоциируемым с Филадельфийской хромосомой, т.е. хромосомой, возникающей в результате транслокации между хромосомами 9 и 22. Точечный разрыв в хромосоме 22 образует кластер в области в 6 к. о., называемой кластерной областью точечного разрыва (КОКР), в то время как в хромосоме 9 точечные разрывы рассеяны по всей области в 90 к. о. в восходящем направлении от c-abl экзона 2. Различные возникающие 9:22 транслокации могут быть подразделены на два типа: К28 транслокации и L6 транслокации. Транскрипция через bcr-abl приводит к образованию слитых мРНК. Антисмысловая молекула, нацеленная на bcr-abl сочленение мРНК, как показано, снижает способность кроветворных клеток, отобранных у больных ХМЛ, образовывать колонии.

Генетический конструкт, кодирующий антисмысловую молекулу, вводят вместе с бупивакаином в клетки индивидуума, страдающего ХМЛ, ex vivo. Обработанные клетки затем вновь вводят индивидууму.

Пример 57

Генные конструкты, применимые в фармацевтических наборах и препаратах для вакцинации от HBV и его лечения, конструируют с векторами, охарактеризованными в виде скелетов в Примере 46. Плазмиды содержат HBV структурные гены, в частности генов, кодирующих HBV поверхностный антиген и/или HBV антиген ядра, и/или HBV антиген преядра.

Пример 58

Генные конструкты, применимые в фармацевтических наборах и препаратах для вакцинации от HCV и его лечения, конструируют с векторами, охарактеризованными в виде скелета в Примере 46. Плазмиды содержат HCV структурные гены, в частности гены, кодирующие HCV белок ядра и/или HCV белок оболочки.

Пример 59

Создают генный конструкт pREV, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую ВИЧ rev в качестве единственного целевого белка. Кодирующую rev последовательность клонируют в скелете В, описанный в Примере 46, из ВВС35 (RD Системе Инк., Миннеаполис, МН), содержащей область кодирования rev из ВИЧ штамма НХ3В в pUC19.

ТАБЛИЦА 1

Семейство пикорнавирусов.

Род

Риновирусы: (медицина) ответственны за 50% общих простудных состояний.

Этеровирусы: (медицина) включают полиовирусы, вирус коксаки, эховирусы и энтеровирусы человека, например вирус гепатита А.

Аптовирусы: (ветеринария) включают вирусы ящура.

Целевые антигены: VP1, VP2, VP3, VP4, VPG.

Семейство кальцивирусов.

Род

Вирусы Группы Norwalk: (медицина) вирусы являются важными возбудителями эпидемического гастроэнтерита.

Семейство тогавирусов.

Род

Альфавирусы: (медицина и ветеринария) примеры включают вирус преждевременного старения, вирус Росс-Ривер, вирус восточного и западного энцефалита лошадей.

Реовирус: (медицина) вирус краснухи.

Семейство флавирусов.

Примеры включают: (медицина) вирус денге, желтой лихорадки, японского энцефалита, энцефалита Сент-Луис и клещевого энцефалита.

Вирус гепатита С: (медицина) эти вирусы не объединены в семейство до настоящего времени, но, как полагают, они относятся либо к тогавирусам, либо флавивирусам. Наибольшее сходство с семейством тогавирусов.

Семейство коронавирусов:

(медицина и ветеринария) вирус инфекционного бронхита (домашняя птица), переносимый вирус гастроэнтерита свиней (свиньи), вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита свиней (свиньи), вирус кошачьего инфекционного перитонита (кошки), кошачий брюшной коронавирус (кошки), собачий коронавирус (собаки). Респираторные коронавирусы человека вызывают 40% случаев общих простудных состояний, напр., 22КЕ, ОСК3.

Примечание: коронавирусы могут вызвать гепатит не-А, В или С.

Целевые антигены:

Е1, называемый также М или матриксным белком; Е2, называемый также S или белком шипов; Е3, называемый также НЕ или гемагглютинелтерозным гликопротеином (присутствует не во всех коронавирусах; N или нуклеокапсид.

Семейство рабдовирусов.

Род: везилиовирус, лиззавирус (медицина и ветеринария): бешенство.

Целевой антиген: G-протеин, N-протеин.

Семейство филовирусов.

Род

Парамиксовирус: (медицина и ветеринария) вирус эпидемического паратита, вирус ньюкастлской болезни (важный патоген у цыплят).

Морбилливирус: (медицина и ветеринария) корь, собачья чума.

Пневминвирус: (медицина и ветеринария) респираторный синцитиальный вирус.

Семейство ортомиксовирусов (медицина): вирус гриппа.

Семейство буньявирусов (Bungavirus Family).

Род

Буньявирус (медицина): калифорнийский энцефалит, ЛЯ Кросс.

Флебовирус (медицина): вирус лихорадки долины Рифт.

Хантавирус: пуремала, являющийся вирусом гемахагиновой (hemahagin) лихорадки.

Найрвирус (ветеринария): найробийская болезнь овец.

Кроме того, много неклассифицированных буньявирусов.

Семейство ареновирусов.

(медицина): LCM, вирус лихорадки Ласса.

Семейство Реовирусов.

Род

Реовирус (возможный патоген человека).

Ротавирус: острый гастроэнтерит у детей.

Орбивирусы (медицина и ветеринария): колорадская клещевая лихорадка, лемомбо (человек), лошадиный энцефалит, болезнь "синего языка".

Семейство ретровирусов.

Подсемейство: онковирусное (ветеринария и медицина): вирус кошачьего лейкоза, HTLV-1, HTLV-2.

Лентивирусно (медицина и ветеринария): ВИЧ, вирус иммунодефицита кошек, инфекции лошадей, вирус анемии.

Спумавирусное.

Семейство паповавирусов.

Подсемейства: полиомавирусы (медицина): BKU и JCU вирусы.

Папилломавирус (медицина): многие вирусные типы, ассоциируемые с раком или злокачественным развитием папилломы.

Аденовирус (медицина): напр. : AD7, ARD, А.В. - вызывают респираторные заболевания, некоторые аденовирусы, например, 275 вызывают энтерит.

Семейство парвовирусов (ветеринария): кошачий парвовирус, вызывает энтерит у кошек; кошачий вирус панлейкопении кошек; собачий парвовирус; парвовирус свиней.

Семейство герпесвирусов.

Подсемейство: альфагерпесвиридное.

Род: симплексвирус (медицина); HSVI, HSVII; варицелловирус (медицина и ветеринария): псевдобешенство - ветряная оспа.

Подсемейство: бетагерпесвиридное.

Род: цитомегаловирус; HCMV; мурамегаловирус.

Подсемейство: гаммагерпесвиридное.

Род: (медицина) лимфокриптовирус; ВЭБ (буркитт лимфо); радиновирус.

Семейство поксвируса.

Подсемейство: хордопоксвиридное (медицина и ветеринария)

Род вариола (натуральная оспа), вакциния (коровья оспа); парапоксвирус (ветеринария); ауипоксвирус (ветеринария); каприпоксвирус; лепорипоксвирус, суипоксвирус.

Подсемейство: энтемопоксвиридное.

Семейство гепадневируса: вирус гепатита В.

Неклассифицирован: вирус гепатита дельта.

ТАБЛИЦА 2

Бактериальные патогены

Патогенные грамположительные кокки включают: пнемококк, стафилококк, стрептококк. Патогенные грамотрицательные кокки включают: менингококк и гонококк.

Патогенные энтерические грамотрицательные бациллы включают: энтеробактерии, псевдомонады, ацинетобактерии и эйкенеллы, мелиоидоза, сальмонеллы, шигеллоза, гемофилии, шанкроида, бруцеллоза, тулеремии, йерсинии (пастеурелла), стрептобацилла монилиформис, спирилла, листериозные моноцитогены, эризипелотриксные рузиопаты, дифтерии, холеры, сибирской язвы, донованоза (паховой грануломы) и бартенеллоза.

Патогенные анаэробные бактерии включают: столбняка, ботулизма, другие клостридии, туберкулеза, проказы и другие микробактерии. Патогенные спирохетные заболевания включают: сифилис, трепонематоз, тропическую гранулему, пинту, эндемический сифилис и лептоспироз. Другие инфекции, возбудителями которых являются высшие патогенные бактерии и патогенные грибки, включают: актиномикоз, нокардиоз, криптококкоз, бластомикоз, гистоплазмоз, мукормикоз, споротрихоз, паракокцидиомукоз, петриеллидиоз, торулопсоз, мицетому, хромомикоз и дерматофитоз.

Риккетсиозные инфекции включают риккетсиоз.

Примеры микоплазмических и хламидиальных инфекций включают: микоплазмической пневмонии, венерической лимфогрануломы, пситакоз и перинатальные хламидиальные инфекции.

Патогенные эукариоты

Патогенные простейшие и гельминты и создаваемые ими инфекции включают: амебиоз, малярию, лейшманиоз, трипаносомоз, токсоплазмоз, пневмоцистизный каринез, бебизиоз, гиардиаз, трихиноз, филариоз, шистосомоз, нематоды, трематоды или трематоды и цестодные (ленточные черви) инфекции.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 1:

(I) Характеристики последовательности

(А) Длина:; 32 пары оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(IX) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 1:

AGGCGTCTCG AGACAGAGGA GAGCAAGAAA TG

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 2:

(I) Характеристики последовательности

(А) Длина: 30 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 2:

ТТТСССТСТА GATAAGCCAT ССААТСАСАС

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 3:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 29 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 3:

GAAGGATCCA TGAAAAAATA TTTATTGGG

(2) Описание для ПОСЛЕД. N 4:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 30 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 4:

ACTGTCGACT TATTTTAAAG CGTTTTTAAG

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 5:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 30 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 5:

GCCAGTTTTG GATCCTTAAA AAAGGCTTGG

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 6:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 27 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 6:

TTGTGAGGGA CAGAATTCCA ATCAGGG

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 7:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 24 пары оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 7:

CAGTGATATC CCGGGAGACT CCTC

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 8:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 25 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 8:

GAATAGAAGA ACTCCTCTAG ААТТС

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 9:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 27 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 9:

GCCTTAGGCG GATCCTATGG CAGGAAG

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 10:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 24 пары оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 10:

TAAGATGGGT GGCCATGGTG AATT

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 11:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 22 аминокислоты

(В) Тип: аминокислота

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: пептид

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 11:

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 12:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 25 аминокислот

(В) Тип: аминокислота

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: пептид

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 12:

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 13:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 27 аминокислот

(В) Тип: аминокислота

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: пептид

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 13:

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 14:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 25 аминокислот

(В) Тип: аминокислота

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: пептид

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 14:

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 15:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 27 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 15:

TTGTTTAACT TTTGATCGAT ССАТТСС

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 16:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 21 пара оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 16:

GATTTGTATC GATGATCTGA С

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 17:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 25 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 17:

TGTAGTAGCA AAAGAAATAG TTAAG

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 18:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 25 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 18:

ААТТСТТААС ТАТТТСТТТТ GCTAC

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 19:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 40 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 19:

ATTTGTCGAC TGGTTTCAGC CTGCCATGGC AGGAAGAAGC

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 20:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 29 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 20:

ACGACGCGTA TTCTTTAGCT CCTGACTCC

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 21:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 24 пары оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 21:

GCTGACGGTA GCGGCCGCAC ААТТ

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 22:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 22 пары оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 22:

GTATTAAGCG GCCGCAATTG ТТ

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 23:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 78 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 23:

AAAAAGCTTC GCGGATCCGC GTTGCGGCCG CAACCGGTCA CCGGCGACGC GTCGGTCGAC CGGTCATGGC TGGGCCCC

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 24:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 29 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 24:

CCCAGCTTA GACATGATAA GATACATTG

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 25:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 22 пары оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 25:

CTAGCAGCTG GATCCCAGCT TC

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 26:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 24 пары оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 26:

GGATTTCTGG GGATCCAAGC TAGT

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 27:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 31 пара оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 27:

TATAGGATCC GCGCAATGAA AGACCCCACC Т

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 28:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 31 пара оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 28:

ATATGGATCC GCAATGAAAG ACCCCCGCTG А

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 29:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 30 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 29:

TAAAGCGGCC GCTCCTATGG CAGGAAGACG

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 30:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 34 пары оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 30:

ATTACGCGTC TTATGCTTCT AGCCAGGCAC AATG

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 31:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 40 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 31:

ATTACGCGTT TATTACAGAA TGGAAAACAG ATGGCAGGTG

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 32:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина; 32 пары оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 32:

ATTACGCGTT ATTGCAGAAT TCTTATTATG GC

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 33:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 38 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 33:

GAGGCTTGGA GAGGATTATA GAAGTACTGC AAGAGCTG

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 34:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 39 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 34:

GAATCCTCTC CAAGCCTCAG CTACTGCTAT AGCTGTGGC

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 35:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 39 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 35:

AAAAATAAAG CGGCCGCTCC TATGGCAGGA AGAGAAGCG

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 36:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 39 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 36:

ААААААТТАС GCGTCTTATG CTTCTAGCCA GGCACAATG

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 37:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 31 пара оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 37:

CCCAAGCTTG GGAATGCTCT GCCAGTGTTA С

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 38:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 36 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 38:

GGGGGCCGGA AGGGCACAAT AAAACTGTCT GCTTAC

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 39:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 33 пары оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 39:

CCTGATTCAG GTGAAAATAT TGTTGATGCG CTG

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 40:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 111 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 40:

ААСАТСААТА СААССТАТТА АТТТССССТС GTCAAAAATA AGGTTATCAA GTGAGAAATC ACCATCAGTG ACGACTGAAT CCGGTGAGAA TGGCAAAAGT TTATGCATTT С

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 41:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 55 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 41:

CTAGCTCGGG GATCCGCGTT GCGGCCGCAA AAAGTCGACG GGCGACGCGT AAAAA

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 42:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 55 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 42:

GATCTTTTTA CGCGTCGCCC GTCGACTTTT TGCGGCCGCA ACGCGGATCC CCGCG

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 43:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 48 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 43:

ATGTCGACTG GTTTCAGCCT GCCATGGCAG GAAGAAGC

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 44:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 35 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 44:

CCCCACGACG CGTCTATTCT TTAGCTCCTG АСТСС

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 45:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 35 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 45:

TTTGCGGCCG CGTAAGTGGA GAGAGATGGT GCGAG

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 46:

(1) Характеристики последовательности

(А) Длина: 21 пара оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 46:

CTGGTGGGGC TGTTGGCTCT G

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 47:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 80 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 47:

ААТТТААТАА GTAAGTAAGT GTCATATGTT TGTTTGAATT CTGCAACAAC TGCTGTTTAT CCATTTTCAG AATTGGGTG

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 48:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 80 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 48:

TCGACACCCA ATTCTGAAAA TGGATAAACA GCACTTGTTG CAGAATTCAA АСАААСАТАТ GACACTTACT ТАСТТАТТА

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 49:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 41 пара оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 49:

GGGGTTTTTG GGCATATGTA TGAGGGACAA TTGGAGAAGT G

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 50

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 70 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 50:

AAGCTTGTGG AATTCTTAAT TTCTCTGTCC GGGGTTTTTG GGCATATGTA TGAGGGACAT TGGAGAAGTG

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 51:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 29 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 51:

CAGTATCTGG CATGGGTAC

(2) Информация для ПОСЛЕД. N 52:

(I) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 29 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Число нитей: одна

(D) Топология: линейная

(II) Тип молекулы: ДНК

(XI) Описание последовательности: ПОСЛЕД. N 52:

CCATGCCAGA TACTGGTACй

Формула изобретения

1. Способ введения в клетки индивидуума генетического материала, отличающийся тем, что осуществляют контактирование клеток с усилителем функции полинуклеотида и вводят в клетки молекулы нуклеиновой кислоты, не содержащей частиц ретровируса.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что усилитель функции полинуклеотида представлен бупивакаином.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок и операбельно связанную с регуляторными последовательностями.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, в состав которого входит по меньшей мере один эпитоп, идентичный или, по существу, аналогичный эпитопу антигена, против которого желателен иммунный ответ, причем нуклеотидная последовательность операбельно связана с регуляторными последовательностями.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, в состав которого входит по крайней мере один эпитоп, идентичный или, по существу, подобный эпитопу антигена патогена.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что усилитель функции полинуклеотида представлен бупивакаином.

7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что молекула нуклеиновой кислоты представлена молекулой ДНК.

8. Способ по п.5, отличающийся тем, что белок представлен антигеном патогена или его фрагментом.

9. Способ по п. 5, отличающийся тем, что молекулу нуклеиновой кислоты вводят внутримышечно.

10. Способ по п.5, отличающийся тем, что патоген представлен вирусом, выбранным из группы, включающей вирус иммунодефицита человека (ВИЧ); вирус Т-клеточного лейкоза человека (TRVL), вирус гриппа, вирус гепатита А (HAV), вирус гепатита В (HBV), вирус гепатита С (HCV), вирус папилломы человека (HPV), вирус простого герпеса 1 (HSV1), вирус простого герпеса 2 (HSV2), цитамегаловирус (CMV), вирус Эпштейна-Барра (NBV), риновирус и коронавирус.

11. Способ по п.5, отличающийся тем, что патоген представлен ВИЧ и молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ВИЧ.

12. Способ по п.5, отличающийся тем, что патоген представлен ВИЧ и молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидные последовательности, кодирующие более одного структурного белка ВИЧ.

13. Способ по п.5, отличающийся тем, что патоген представлен ВИЧ и молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидные последовательности, кодирующие более одного регулярного белка ВИЧ.

14. Способ по п.5, отличающийся тем, что по крайней мере молекулы двух или более разных нуклеиновых кислот вводят в разные клетки индивидуума, причем разные нуклеиновые кислоты включают каждая нуклеотидные последовательности, кодирующие один или более антигенов одного и того же патогена.

15. Способ по п.5, отличающийся тем, что усилитель функции полинуклеотида и молекулу нуклеиновой кислоты вводят одновременно.

16. Способ по п.5, отличающийся тем, что индивидуумом является человек; усилитель функции полинукдеотида представлен бупивакаином; патоген представлен вирусом иммунодефицита человека; молекула нуклеиновой кислоты представлена ДНК и включает ДНК-последовательность, кодирующую структурные белки gag и pol ВИЧ с делецией psi, причем кодирующая gag и pol ДНК-последовательность операбельно связана с усилителем вируса саркомы Рауса, непосредственно ранним промотором цитомегаловируса и малым сигналом полиаденилирования SV 40 и необязательно точкой начала репликации SV 40.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что ДНК-последовательность дополнительно включает rev-респондирующий элемент ВИЧ и делецию интегразы ВИЧ.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что ДНК-последовательность дополнительно включает сплайс-акцептор ВИЧ.

19. Способ по п. 16, отличающийся тем, что ДНК-молекула дополнительно включает ДНК-последовательность, кодирующую последовательность, дополнительно содержащую ВИЧ rev, операбельно связанную с промотором SV 40 и малым сигналом полиаденилирования SV 40 и необязательно с точкой начала репликации SV 40.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что кодирующая rev ДНК-последовательность кодирует кроме того vpu ВИЧ и env ВИЧ.

21. Способ по п.19, отличающийся тем, что ДНК-последовательность, кодирующая gag и pol, дополнительно включает rev-респондирующий элемент ВИЧ и делецию интегразы ВИЧ.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что ДНК-последовательность, кодирующая gag и pol, дополнительно включает сплайс-акцектор ВИЧ.

23. Способ по п.5, отличающийся тем, что индивидуумом является человек усилитель функции полинуклеотида представлен бупивакаином; патоген представлен вирусом иммунодефицита человека; молекула нуклеиновой кислоты является ДНК и содержит ДНК-последовательность, кодирующую rev-, vpu- и env-белки H1V, операбельно связанную с усилителем вируса саркомы Рауса, непосредственно ранним промотором цитомегаловируса и малым сигналом полиаденилирования SV 40 и необязательно точкой начала репликации SV 40.

24. Способ по п.5, отличающийся тем, что индивидуумом является человек, усилитель функции полинуклеотида представлен бупивакаином; патоген представлен вирусом иммунодефицита человека, молекулы двух различных ДНК вводят в разные клетки индивидуума, причем молекула одной из нуклеиновых кислот является ДНК и включает ДНК-последовательность, кодирующую структурные белки gag и pol ВИЧ с делецией psi, причем ДНК-последовательность, кодирующая gag и pol, операбельно связана с усилителем вируса саркомы Рауса, непосредственно ранним промотором цитомегаловируса и малым сигналом полиаденилирования SV 40 и необязательно с точкой начала репликации SV 40, молекула другой нуклеиновой кислоты является ДНК и включает ДНК-последовательность, кодирующую ВИЧ-белки rev, vpu и env, операбельно связанную с усилителем вируса саркомы Рауса, непосредственно ранним промотором цитомегаловируса и малым сигналом полиаденилирования SV 40 и необязательно с точкой начала репликации SV 40.

25. Способ по п.5, отличающийся тем, что осуществляют введение в клетки человека молекул двух разных нуклеиновых кислот, при этом молекула каждой нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, идентичный или, по существу, аналогичный эпитопу по меньшей мере одного антигена ВИЧ, операбельно связанную с регуляторными последовательностями, причем нуклеотидные последовательности способны экспрессироваться в клетках, нуклеотидные последовательности каждой из двух разных нуклеиновых кислот кодируют различные белки, указанные белки имеют по меньшей мере один эпитоп, идентичный или, по существу, аналогичный эпитопу по меньшей мере одного белка ВИЧ, кодируемого генами ВИЧ, выбранными из группы, включающей gag, pol и env.

26. Способ по п.1, отличающийся тем, что молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую целевой белок, содержащий эпитоп, идентичный или, по существу, подобный эпитопу белка, ассоциированного с клетками, характеризующими заболевание.

27. Способ по п.26, отличающийся тем, что усилитель функции полинуклеотида представлен бупивакаином.

28. Способ по п.26, отличающийся тем, что заболевание характеризуется гиперпролиферацией клеток.

29. Способ по п.26, отличающийся тем, что заболевание является аутоиммунным заболеванием.

30. Способ по п.26, отличающийся тем, что молекула нуклеиновой кислоты является молекулой ДНК.

31. Способ по п.26, отличающийся тем, что молекулу нуклеиновой кислоты вводят внутримышечно.

32. Способ по п.26, отличающийся тем, что молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую целевой белок, выбранный из группы, включающей белковые продукты онкогенов myb, myc, fyn, ras, sarc, neu и trk; белковые продукты транслокационного гена bcl/abl; P53; EGRF; вариабельные области антител, полученных с помощью В-клеточных лимфом, и вариабельные области Т-клеточных рецепторов Т-клеточных лимфом.

33. Способ по п. 26, отличающийся тем, что белок выбирают из группы, включающей вариабельные области антител, участвующих в опосредуемом В-клетками аутоиммунном заболевании, и вариабельные области Т-клеточных рецепторов, участвующих в опосредуемом Т-клетками аутоиммунном заболевании.

34. Способ по п.1, отличающийся тем, что молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, присутствие которого будет компенсировать отсутствующий, нефункциональный или частично функциональный белок или обеспечивать терапевтический эффект у индивидуума.

35. Способ по п.34, отличающийся тем, что усилитель функции полинуклеотида представлен бупивакаином.

36. Способ по п.34, отличающийся тем, что молекула нуклеиновой кислоты представлена молекулой ДНК.

37. Способ по п.34, отличающийся тем, что молекула нуклеиновой кислоты вводится внутримышечно.

38. Способ по п.34, отличающийся тем, что молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, выбранный из группы, состоящей из ферментов, структурных белков, цитокинов, лимфокинов и факторов роста.

39. Фармацевтическая композиция для введения генетического материала, который кодирует ВИЧ-белки, в клети индивидуума, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, представленную молекулой ДНК, которая включает ДНК-последовательность, кодирующую белок, необязательно связанную с регуляторными элементами, и усилитель функции полинуклеотида.

40. Фармацевтическая композиция по п.39, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, выбранный из группы, состоящей из белков, включающих по крайней мере один эпитоп, идентичный или, по существу, подобный эпитопу антигена патогена; белков, содержащих эпитоп, идентичный или, по существу, подобный эпитопу белка, ассоциированного с гиперпролиферирующими клетками; белков, содержащих эпитоп, идентичный или, по существу, подобный эпитопу белка, ассоциированного с клетками, характеризующими аутоиммунное заболевание; белков, присутствие которых будет компенсировать отсутствующий нефункциональный или частично функционирующий белок у индивидуума; и белков, обеспечивающих терапевтический эффект у индивидуума.

41. Фармацевтическая композиция по п.39, отличающаяся тем, что патоген представляет собой вирус, выбранный из группы, состоящей из вируса иммунодефицита человека (HIV); вируса Т-клеточного лейкоза человека (HTLV); вируса гриппа; вируса гепатита А (HAV); вируса гепатита В (HBV); вируса гепатита С (HCV); вируса папилломы человека (HPV); вируса простого герпеса 1 (HSV1); вируса простого герпеса 2 (HSV2); цитомегаловируса (CMV); вируса Эпштейна-Барра (EBV); риновируса и коронавируса.

42. Фармацевтическая композиция по п.39, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты представляет собой ДНК-последовательность, кодирующую структурные белки gag и pol ВИЧ с делецией psi, причем последовательность ДНК, кодирующая gag и pol, операбельно связана с усилителем вируса саркомы Рауса, непосредственно ранним промотором цитомегаловируса, малым сигналом полиаденилирования SV 40 и необязательно с точкой начала репликации SV.40.

43. Фармацевтическая композиция по п.39, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу ДНК, включающую последовательность ДНК, кодирующую белки rev, vpu и env ВИЧ, операбельно связанную с усилителем вируса саркомы Рауса, непосредственно ранним промотором цитомегаловируса, малым сигналом полиаденилирования SV 40 и необязательно точкой начала репликации SV 40.

44. Фармацевтическая композиция по п.39, отличающаяся тем, что усилитель функции полинуклеотида представлен бупивакаином.

45. Фармацевтический набор для введения генетического материала, который кодирует ВИЧ-белки, в клетки индивидуума, включающий первый инокулят, содержащий фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и молекулу первой нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один белок ВИЧ, операбельно связанную с регуляторными последовательностями, причем нуклеиновая последовательность способна экспрессироваться в клетках человека, и второй инокулят, содержащий фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и молекулу второй нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один белок ВИЧ, операбельно связанную с регуляторными последовательностями, причем нуклеотидная последовательность способна экспрессироваться в клетках человека, при этом молекула первой нуклеиновой кислоты неидентична молекуле второй нуклеиновой кислоты.

46. Фармацевтический набор по п.45, отличающийся тем, что первый и второй инокуляты включают усилитель функции полинуклеотида или третий инокулят, содержащий усилитель функции полинуклеотида.

47. Фармацевтический набор по п.45, отличающийся тем, что молекула первой нуклеиновой кислоты и молекула второй нуклеиновой кислоты вместе кодируют белки gag, pol и env ВИЧ.

48. Фармацевтический набор по п.45, отличающийся тем, что включает первый инокулят, содержащий первую фармацевтическую композицию, включающую молекулу ДНК, которая содержит последовательность ДНК, кодирующую структурные белки gag и pol ВИЧ с делецией psi, причем упомянутая последовательность, кодирующая gag и pol, операбельно связана с усилием вируса саркомы Рауса, непосредственно ранним промотором цитомегаловируса, малым сигналом полиаденилирования SV 40 и необязательно с точкой начала репликации SV 40, и второй инокулят, содержащий вторую фармацевтическую композицию, включающую молекулу ДНК, которая содержит последовательность ДНК, кодирующую белки rev, vpu и env ВИЧ, операбельно связанную с усилителем вируса саркомы Рауса, непосредственно ранним промотором цитомегаловируса, малым сигналом полиаденилирования SV 40 и необязательно с точкой начала репликации SV 40.

Приоритеты по пунктам:

26.01.1993 по пп.2, 17, 44, 45 и 48;

11.03.1993 по пп.6, 18 - 25 и 27.