СПИСОК ПАТЕНТОВ С УПОМИНАНИЕМ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ
-
- 2017751 Способ получения гиалурона
- 2192150 БАД для профилактики йодной недостаточности
- 2112542 Препарат для лечения патологий соединительных тканей
- 2225206 Препарат для лечения рака молочной железы
- 2299733 Лечение опорно-двигательного аппарата
- 2299732 Способ лечения глаукомы
- 2299726 Противоинфекционная губная помада
- 2299725 Косметическое средство для ухода за кожей
- 2198878 Ароматическое соединение
- 2198702 Способ подготовки трофических язв к аутодермапластике
- 2198653 Вагинальные суппозитории
- 2197946 Композиция для ухода за волосами
- 2197923 Фармацевтическая композиция для лечения отеков роговицы
- 2298410 Биотрансплантант и способ лечения ревматических и аутоиммунных заболеваний
- 2197501 Фотоотверженный гель на основе сшитой гиалуроновой кислоты
- 2197228 Твердые лекарственные формы
- 2197222 Водная компазиция для ухода за волосами, лица и тела
- 2297425 Полипептиды
- 2297240 Композиция с гиалуроновой кислотой
- 2297230 Фармацевтическая компазиция с ксантоновой смолой
- 2196588 Глазные капли
- 2195955 Применение биологически активных веществ
- 2195926 Дерматологические композиции
- 2295954 Микрочастицы для доставки нуклеиновых кислот
- 2295951 Косметика для ухода за кожей лица и век
- 2195262 Фармакологическое средство на основе гиалуроновой кислоты
- 2194512 Способ профилактики и коррекции процесса старения кожи
- 2194478 Лечение экземы
- 2294716 Расширяемый стент
- 2194055 Сшитые сополимеры
- 2099350 Ассоциаты депротонированной гиалуроновой кислоты
- 2293557 Средство для лечения кожи и слизистых
- 2292878 Приготовление микроцастиц, содержащих метопропол
- 2292746 БАД
- 2192256 Защита кишечника
- 2191782 Получение модифицированной гиалуроновой кислоты
- 2292219 Паратиреоидный гормон человека
- 2291686 Микроцастицы
- 2191000 Косметическая маска
- 2290921 Фармацевтические и косметические средства против старения кожи
- 2290900 Модифицированный биоматериал для использования в офтальмологии
- 2290899 Получение биоматерьяла
- 2290397 Новые инданилиденовые соединения
- 2290186 Лечение сирингомиелии
- 2288702 Иррингационный раствор для офтальмологии
- 2288699 Гель для лечения стоматологических заболеваний
- 2188011 Активирующая остеогенез фармацевтическая композиция
- 2187327 Средство с антисептиком
- 2187325 Средство с радиопротекторным действием
- 2287330 Композиции миноксидила
- 2186786 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2186593 Лечение раненого процесса кожи
- 2286801 Очищение воды
- 2286781 Лечение ожогов пищевода у детей
- 2286764 Средство лечения воспалений полости рта
- 2185840 Лечение инфекционных заболеваний
- 2286151 Альфа-2-Дельта-Лиганда
- 2185149 Ранозаживляющий гель
- 2285527 Лечение ИЛ-6 заболеваний
- 2184448 Раствор хранения роговицы, включающий гиалуроновую кислоту
- 2090179 Крем для кожи
- 2183961 Способ лечения кожи
- 2284331 Соли алифотических аминов
- 2284187 Производные амида
- 2089191 Снизить внутрение давление
- 2283320 Получение гликозаминогликанов
- 2283129 Лечение опухолей
- 2283098 Косметические средства с Q
- 2182574 Ароматические соединения
- 2088257 Средство с гипохолестеролемическим действием
- 2088218 Состав для гигиенических салфеток
- 2088206 Способ получения препарата, создающего исскуственный загар
- 2282462 Противомикробные средства
- 2182008 Интровагинальная компазиция
- 2181999 Препарат с отсроченным высвобождением
- 2181998 Новые композиции липидов
- 2181995 Лечение болевого синдрома
- 2181295 Вирионная вакцина
- 2087144 Витамин Е
- 2379336 Способ стирки
- 2379052 Вакцинация
- 2180855Композиция в виде ионного комплекса
- 2379025 Противоинфекционный гель
- 2180825 Лечение травм роговицы
- 2281082 Способ коррекции эстетических и возрастных проблем кожи
- 2180576 Биоактивная добавка для косметических средств
- 2280459 Средство для изменения скорости роста или репродукции клеток
- 2179981 Соли переходного металла
- 2378010 Жидкие вакцины
- 2378008 Комбинированные вакцины
- 2378007 Анаболическое средство
- 2377973 Растительные экстракты
- 2280041 Способ получения водорастворимых комплексов гиалурил
- 2280038 Биополимеры
- 2323733 Йодный обмен
- 2377260 Гель
- 2178693 Противовирусное средство на основе гиалуроновой кислоты
- 2178692 Облегчающие зуд косметическое средство
- 2377022 Гемостатические спреи
- 2376982 Увлажняющая сыворотка для лица
- 2376974 Трансдермальный гель для лица
- 2362784 Гипо-и гиперацетилированные менингокковые капсульные сахариды
- 2177789 Устройство для доставки лекарства к шейке матки
- 2277954 Крем для лица омолаживающий
- 2376378 Способ получения метионина
- 2177332 Биоматериал для предотвращения послеоперационных спаек, с производной гиалуроновой кислотой
- 2177310 Способ получения таблеток
- 2376011 Средство для позвоночника
- 2277410 Косметическое средство
- 2323748 Медицинская повязка
- 2276998 Гидрогелевые композиции
- 2082416 Способ получения препарата с коллагенном из животного сырья
- 2375081 Адсорбирующее изделие
- 2375049 Охлаждающий пластырь
- 2346049 Способ получения гиалурона
- 2275913 Фармацевтические средства
- 2174985 Полисахарид с антиоксидантом
- 2373957 Носитель для лекарственных средств и биологически активных веществ
- 2373941 Способ коррекции возрастных и патологических изменений кожных покров
- 2174845 Композиции и способы доставки генетического материала
- 2174830 Средство для укрепления волос
- 2373769 Синбиотическая композиция
- 2274472 Лечение апорно-двигательного аппарата и болевых синдромов
- 2372929 Профилактическая композиция на основе веществ фенольной природы в липосомной форме
- 2173563 Способ нанесения на поверхность предметов покрытия на основе гиалуроновой кислоты, её производных и полусинтетических полимеров
- 2079304 фармацевтическая композиция, обладающая иммуносупрессорной и антимикробной активностью
- 2273645 Полипептид ожирения
- 2173154 Фракция кератансульфатолигосахаридов и содержащий ее фармацевтический препарат
- 2173136 Грязная мазь
- 2173128 Способ хирургического лечения центральных разрывов сечатки
- 2078561 Косметическое средство предотвращающее старение кожи
- 2172490 Способ прогнозирования воспалительных заболеваний молочной железы при эндопластике
- 2272645 Способ лечения ЦМВ-Инфекции у детей раннего возроста
- 2272636 Фармацевтическая композиция для местного лечения воспаления
- 2272635 Фармацевтически активная субстанция для офтальмологии
- 2272599 Биоматерьял для стабилизации прогрессирующей миопии "Коллаплант"
- 2172168 Средство для заживления ран на основе гиалуроновой кислоты
- 2371172 Фармацевтическая композиция для лечения нервной системы на основе стефаглабрина
- 2171470 Способ прогнозирования послеоперационной трансформации доброкачественных опухолей нервной системы
- 2077317 Состав для ванн
- 2271213 Комбинированные композиции, содержащие экстракты из растений и морских животных
- 2076872 Способ получения окрашенной гиалуроновой кислоты
- 2076671 Раствор для защиты роговицы
- 2370281 Конъюгаты гидроксиалкилкрахмал
- 2370275 Способ лечения (коррекции) косметических и возрастных дефектов кожи
- 2370258 Фармацевтическая композиция для парентальной доставки в форме лиофилизата
- 2270023 Способ экстракции и очистки протеогликана хрящего типа (варианты)
- 2369408 Гемостатическая композиция, включающая гиалуроновую кислоту
- 2369387 Фармацевтическая композиция для лечения нервной системы
- 2369379 Нетаблитированные жевательные формы для индивидуального введения
- 2169136 Производное коричной кислоты
- 70792 Медицинский аппликатор
- 20741717 Способ стабилизации аскорбиновой кислоты
- 2074712 Способ получения препарата, препятствующего преждевременной эякуляции
- 2367954 Способ прогнозирования развития кожной патологии у женщин с синдромом склерополикистозных яичников (СПКЯ)
- 2268075 Устройство для электрокинетической доставки
- 2268052 Средство для лечения воспалительных и дегенеративных заболеваний суставов
- 2167649 Способ получения твердой дисперсии умеренного водорастворимого лекарственного вещества
- 2167647 Гель для бритья
- 2073520 Лечение урологических инфекций
- 2367476 Биопластический материал
- 2367475 Мембрана для использования при направленной регенерации тканей
- 2367469 Фармацевтическая композиция на основе лизоамидазы
- 2367456 Фармацевтическая композиция обладающая антибактериальным и некролитическим действием
- 2367455 Фармацевтическая композиция обладающая некролитическим и антибактериальным действием
- 2267324 Применение антиадгезивных углеводов, препарат для уменьшения и /или блокирования адгезии патогенных веществ
- 2166934 Композиции включающие биологический агент
- 2166510 Псевдодипептиды
- 2366460 Композиции, имеющие высокую противовирусную и антибактериальную активность
- 2360901 Производные феноксиуксусной кислоты
- 2165749 Способ восстановления эндотелия роговицы
- 2265441 Способ укрепления склеры
- 2365382 Композиции и способы для регуляции развития сосудов
- 2070879 Соли гликозаминогликанов
- 2164914 Циклические и гетероциклические N - замещенные - иминогидроксамовые карбоновые кислоты
- 2264627 Хламидийный конъюктивит
- 2364399 Фармацевтический препарат на основе стефаглабрина
- 2264230 Препарат с замедленным высвобождением активного вещества
- 2363497 Фармацевтические композиции
- 2363496 Способ увеличения объема мягких тканей
- 2363473 Способ антифлогистической активации в эксперементе
- 2363461 Фармацевтический препарат на основе сигетина
- 2363459 Средства для введения в роговицу глаз для предотвращения офтальмологических нарушений
- 2363448 Фармацевтические композиции
- 2163123 Глазные капли
- 2162687 Усовершенствованнная лекарственная форма индуктора интерферана
- 2162343 Биосовместимый полимерный материал и способ его получения
- 2162327 Лечение рака
- 2067841 Способ получения ароматизатора
- 2161478 Способ консервированого лечения гонартроза
- 2361617 Вольфрамовые частицы в качестве рентгеноконтрастных веществ
- 2361552 Способы и устройства для дренирования жидкостей и понижения внутриглазного давления
- 2066996 Способ изготовления пленочного материала для офтальмохирургии
- 2361417 Корм с глюкозамином и экстрактом ивы для профилактики артроза у животных
- 2161002 Пищевой общеукрепляющий лечебно-профилактический продукт из хрящевой ткани акул
- 2360928 Комплексная матрица для медико-биологического применения
- 2160574 Способ лечения глаукомы
- 2360688 Способ лечения повреждений переферических нервов
- 2360670 Фармацевтическая композиция при климактерических расстройствах
- 2360646 Эндолюминальный протез
- 2260445 Способ усовершенствования транспортировки через легко прспосабливаемый полупроницаемый барьер
- 2260007 Производные амида
- 2359975 Способ получения модифицированных арабиногалактанов
- 2359974 Антигенные Пептиды
- 2159775 Псевдопептидный продукт
- 2259833 Фармацевтическая композиция для лечения роговицы глаза
- 2259816 Ранозаживляющее средство
- 2259815 Способ коррекции возрастных изменений, связанных с процессами старения кожи
- 2359706 Способ сохранения офтальмологических растворов
- 2359704 Антисептическое средство
- 2359662 Микрокапсулы
- 2159253 Катионные полимеры
- 2159111 Средство для ухода за кожей лица
- 2159105 Композиция для защиты кожи от опасных химических веществ Получение
- 2158593 Биосовместимый водный раствор
- 2358728 Способ лечения и предупреждения потери костной ткани
- 2258517 Способ хирургического лечения травмотических повреждений селезенки пленкой на основе гиалуроновой кислоты
- 2357968 Кристалические формы производной имидазола
- 2357957 Ингибиторы P38 и их применение
- 2157647 Пищевая добавка и ее получение
- 2357758 Препараты для чрескожной и чересслизистой добавки
- 2063244 Способ стабилизации растворов
- 2063140 Способ получения препарата для консервирования мяса
- 2157381 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2257198 Композиции микроцастиц
- 2356909 Белковый комплекс
- 2356570 Косметическая композиция
- 2256434 Способ закрытия перфорации барабанной перепонки
- 2356520 Способ лечения постконтузионного повреждения сечатки глаза
- 2156133 Гель
- 2255945 Полимерная композиция
- 2355761 Средства повторной дифференцировки
- 2061043 Способ повышения устойчивости урокиназы к нагреванию
- 2061005 Способ получения красителей для гистологических исследований
- 2355420 Зубная паста
- 2355385 Композиции пролонгированного действия с контролируемым высвобождением
- 2355240 Способ получения пищевого препарата хондропротекторного действия
- 2155057 Пихтово репейный бальзам
- 2354409 Способ производства высвобождающих лекарственные средчтва медицинских устройств
- 2254145 Раневое покрытие на основе коллаген-хитозанового комплекса
- 2254133 Лечение и профилактика ВИЧ-инфекции у человека
- 2253439 Фармацевтическая композиция для защиты и улучшения оптических свойств роговици при проведении эндовитреальных вмешательств
- 2253437 Способ омоложения кожи
- 2153352 Фармацевтическая композиция обладающая ранозаживляющим и противовоспалительным действием
- 2353354 Фармацевтический препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2252787 Способ получения искусственной матрицы кожи
- 2252767 Способ нормализации иммунобиохимического гомеостаза коров в предродовом и послеродовом периодах
- 2352583 Фармацевтическая композиция содержащая Fc-область иммуноглобулина в качестве носителя
- 2152403 Модифицированные полисахариды
- 2352356 Иммуногенная композиция
- 2352342 Исскусственный физиологический солевый раствор Способ его получения
- 2352330 Фармацевтический препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2352323 Фармацевтический препарат с модифицированным высвобождением
- 2152027 Способ подготовки ткани мозга для определения гликозаминогликанов
- 2251842 Интектицидный состав для борьбы с личинками оводов
- 2151580 Способ активации пролиферации эндотелия роговицы
- 2351648 Дифференцировка стромальных клеток, полученных из жировой ткани, в эндокринные клетки поджелудочной железы и их использование
- 2351595 N - гидроксиформамидные соединения в качестве ингибиторов металлопротеина
- 2251411 Косметическое средство в лиофилизированной фармацевтической форме
- 2251405 Косметика...ее композиции для косметических препаратов
- 2251367 Средство со сшитой гиалуроновой кислотой для наращивания тканей
- 2351359 Косметика для профилактики и лечения избыточной массы тела
- 2351322 Препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2351153 Диета при остеортрите собак
- 2350958 Способ определения групповой принадлежности синовальной жидкости
- 2350625 Производные гиалуроновой кислоты с пониженной биодеградируемостью
- 2150266 Крем после бритья
- 2350354 Фармацевтическое средство содержащие антагонист и фактор некроза
- 2350340 Способ коррекции процессов регенерации
- 2350309 Способ лечения избыточной массы тела с помощью рефлексотерапии
- 2250047 Профилактический продукт из хрящевой ткани гидробионтов
- 2249467 Медицинский матерьял и изделия на его основе
- 2055079 Способ получения препарата гиалуроновой кислоты
- 2349599 Биоадгезив мидии
- 2054903 Способ лечения коллагеноза у бычков на откорме
- 2249210 Способ прогнозирования предрасположенности к развитию и тяжести течения деформирующего остеоартроза коленного сустава у взрослых
- 2349339 Средство для соединительной ткани
- 2148988 Человеческий интерферона
- 2148399 Лечение атеросклероза
- 2148396 Способ определения активного вещества в дифильных мазевых основах
- 2148375 Способ диагностики близорукости
- 2348415 Способ противоспаечной терапии после хирургического вмешательства
- 2348400 Препарат на основе низкомолекулярного индуктора интерферона
- 2348386 Способ непроникающего хирургического лечения первичной открытоугольной глаукомы
- 2248213 Лечение Галактозидальной А недостаточности
- 2347586 Микрофлюидизированные эмульсии типа "масло в воде" и вакцинные средства
- 2147243 Контрастное средство
- 2146526 Лечебный препарат дисбактериоза и урогенитальных инфекций
- 2146148 Терапевтическое применение фактора роста кератиноцитов (ФРК)
- 2146139 Способ повышения активности макрофагов и комбинации для его осуществления
- 2346277 Способ диагностики специфического синовита
- 2345793 Ультразвуковые контрастные вещества и их получение
- 2345782 Терапевтические комбинации на основе PORIFERA для лечения и предотвращения кожных заболеваний
- 2245131 Способ коррекции косметических недостатков кожи
- 2245130 Способ активации восстановительных процессов в коже
- 2144833 Хондроитиназа
- 2344809 Получение твердых дозированных форм с использованием сшитого нетермопластичного носителя
- 2244540 Косметический гель для ухода за кожей лица
- 2244536 Способ лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний тазобедренного сустава
- 2344167 Хмелевый экстракт
- 2143884 Агент регулирования дифференциации клеток кожи, культурная среда для клеток или тканей и способ регулирования дифференциации клеток кожи
- 2343932 Способ получения обладающих пониженной растворимостью в воде пленночных материалов
- 2343903 Устройство доставки лекарств для контролируемого введения препаратов
- 2048817 Способ получения материала для лечения ожогов и гнойно - некронических ран
- 2048803 Гидратантный крем
- 2242974 Средства и способы лечения воспалительных заболнваний
- 2142816 Способ получения антигерпетической вакцины
- 2342923 Средство для обработки рук с увлажняющим эффектом
- 2142781 Косметика для макияжа ресниц и бровей и агент ингирирующий рост микроорганизмов в косметических средствах
- 2242251 Трансплантируемые стенты с биоактивными покрытиями
- 2142257 Способ обработки глазных имплантантов и контакных линз
- 2342389 Мононатриевая соль
- 2342107 Способ устранения западения верхнего века при анофтальме
- 2141828 Средство, пролонгирующее эффективность чесночного порошка
- 2241489 Косметическое средство матриксных протеинов для залечивания ран
- 2241443 Средство для лечения герпеса
- 2241414 Способ получения протезов кровеносных сосудов
- 2341539 Гидрогель
- 2141324 Регулятор скорости воздействия препарата для инъекций
- 2141312 Косметическое средство для ухода за кожей лица
- 2341296 Средства и способы покрытия медицинских имплантантов
- 2341272 Средство для неспецифической иммунотерапии
- 2341266 Стенты с нанесенным покрытием содержащим N - (5-(4-(4-
- 2341257 Иммуномодулирующее средство
- 2341255 Средство для лечения климактерических расстройств
- 2240821 Способ лечения урологических инфекций
- 2140786 Способ лечения лишая
- 2140243 Способ хирургического лечения диабетической ретинопатии и отслоек сечатной оболочки
- 2240140 Медицинская многослойная повязка и изделия на ее основе
- 2240135 Культура клеток, содержащая клетки - предшественники остеонегеза, имплантант на ее основе и его использование для восстановления целостности кости
- 2240123 Экзогенные биологически активные коньюгирующие вещества
- 2139886 Фотоотвержаемое производное гликозаминогликата, сшитое производное гликозаминогликата и способы их получения, способ предотвращения клеточной и тканевой адгезии
- 2139729 Вакцина. Способ стимулирования иммунной системы
- 2339386 Средство обладающее радио - и химиозащитным действием
- 2339369 Лечение офтальмологических нарушений с использованием мочевины и ее производных
- 2139041 Гидратантный регенерирующий крем и способ его получения
- 2139039 Косметический суперкрем для ухода за кожей
- 2139017 Способ получения боисовместимого материала
- 2138503 Производные камптотецина, способы их получения, уникальное средство
- 2338556 Средство содержащие антагонист Р2Х - рецептора и нестероидное противоспалительное лекарственное средство
- 2338514 Косметическое средство для профилактики старения кожи
- 2138297 Медицинские устройства, подверженные вызываемому разложению
- 2138295 Покрытие для ран
- 2337906 Ингибиторы цитозольной фосфолипазы А2 Применение физиологически допустимого корпускулярного ферримагнитного или ферромагнитного материала. Способ формирования магнитометрического изображения
- 2137501 Устройство формирования изображения
- 2137477 Способ лечения заболеваний характеризующихся аутоиммунной агрессией
- 2137467 Крем для кожи лица и тела
- 2137449 Способ коррекции дефектов преломления в глазу млекопитающего
- 2137402 Пищевая Добавка БАД
- 2336899 Способ стимуляции миелопоэза
- 2336862 Способ получения раствора для лечения роговицы
- 2336830 Способ восстановления костных структур челюсти
- 2136696 Новый полипептид и средство против ВИЧ - Инфекции
- 2336092 Биоадгезивное средство, по существу свободное от воды
- 2336089 Средство и способ лечения заболеваний периодонтальных и пульпы
- 2336074 Средства и способы лечения заднего сегмента глаза
- 2235548 Ранозаживляющее средство
- 2135186 Способ лечения рефлекторных синдромов при остеохондрозе
- 2234945 Стабилизатор водного раствора и водосодержащего сырья
- 2334762 Растворимая ассоциативная карбоксиметилцеллюлоза
- 2234514 Макропористые хитозановые гранулы и способ их получения. Способ культивирования клеток
- 2133615 Средство для лечения неврологических заболеваний
- 2233164 Способ профилактики развития послеоперационных спаек брюшной полости
- 2133127 Неткатный материал, способ его получения и способ лечения
- 2333223 Альдегидные производные сиаловой кислоты и средства на их основе
- 2333007 Полипептидные вакцины для широкой защиты против рядов поколений менингококов с повышенной вирулентностью
- 2332985 Дозированные формы анестезирующих средств с длительным высвобождением для обезболивания
- 2132677 Косметическая маска
- 38603 Пленочный аппликатор
- 2232594 Средство содержащие ингибирующие остеокластогенез фактор и полисахарид
- 2332238 Средство для прокладок, раневых повязок и других изделий, контактирующих с кожей
- 2331668 Стромальные клетки, получение из жировой ткани, для заживления дефектов роговицы и внутриглазных дефектов и их использование
- 2331438 Альфа - 2 - Дельта Лигант для лечения симптомов нижних мочевыводящих путей
- 2331411Электропряденые аморфные фармоцевтические средства
- 2331367 Способ профилактики образования спаек и их рецидива
- 2130767 Масло в воде для получения косметических и дерматологических средств, способ косметической обработки
- 2230752 Поперечносшитые гиалуроновые кислоты и их применение в медицине
- 2230558 Способ восстановления и сохранения здоровья скмьи
- 2230550 Средства длительного высвобождения, способ их получения и применения
- 2230458 Поддержания здоровья суставов
- 2330290 Способ определения состояния метаболических процессов в ткани суставного хряща
- 2230073 Способ поперечного сшивания карбоксилированных полисахаридов
- 2329059 Способ лечения полипозного риносинусита
- 2329037 Комбинированная терапия для лечения иммуновоспалительных заболеваний
- 2128666 Гиалуроновая кислота и ее соли, способ очистки гиалуроновой кислоты, способ получения гиалуроновой кислоты. Фармацевтический препарат с гиалуроновой кислотой и средства с гиалуроновой кислотой используемые в офтальмологии
- 2328740 Способ экспресс - оценки действия зубных паст
- 2128502 Косметический гель
- 2328272 Суппозитории индуктора интерферона
- 2328268 Косметика содержащая амфолитный сополимер
- 2128057 Композиционная мембрана, способ ее получения и способ направленной регенерации тканей с ее применением
- 2128055 Средство замедленного освобождения и способ его получения
- 2128049 Свечи
- 2227743 Полипептидные варианты с повышенной гепаринсвязывающей способностью
- 2326893 Ковалентное и нековалентное сшивание гидрофильных полимеров
- 2326697 Новый перевязочный материал для быстрого заживления раневой поверхности кожи
- 2126264 Фармацевтическое средство с гиалуроновой кислотой
- 2326137 Способ получения содержащих альгинат пористых формованных изделий
- 2325902 Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани
- 2225195 Репелленты против насекомых
- 2325193 Сосудистый стент
- 2325184 Улучшенные везикулы наружной мембраны бактерий
- 2325153 Многокомпонентная фармацевтическая дозированная форма
- 2325152 Удерживаемая в желудке система регулируемой доставки лекарственного средства
- 2029955 Способ предоперационного определения помутнения задней капсулы хрусталика при экстракции катаракты
- 2324688 Производные бисбензизоселеназолонила с противоопухолевым, противовоспалительным и антитромбоническим действием
- 2323017 Устройство и способ контролируемый доставки активных веществ в кожу
- 2323011 Содержащий Коллаген I и Коллаген II способный к рассасыванию внеклеточный матрикс, предназначенный для реконструирования хряща
- 2322955 Способ изготовления имплантанта для пластики дефектов хрящевой ткани
- 2322454 Антитело против CCR5
- 2322263 Система продолжительного высвобождения растворимого лекарственного средства
- 2221561 Витамин Е и его сложные эфиры
- 2321634 Гены участвующие в метаболизме углерода и продуцировании энергии
- 2321597 Биоматерьял, способ его приготовления и его применение, медицинское средство, имплантант и вкладыш
- 2121340 Средство для похудения
- 2220737 Средство для улучшения состояния опорно-двигательного аппарата
- 2220729 Гель используемый в стоматологии
- 2320720 Способ культивирования фибропластов для заместительной терапии
- 2320378 Накожный аппликатор
- 2320369 Средства, содержащие Альфа - 2 - Дельта Лиганды и ингибиторы обратного захвата серотонина/норадреналина
- 2320362 Местные фармацевтические средства, содержащие проантоцианидины, для лечения дерматитов
- 2320322 Биоадгезивная доставка лекарств
- 2320318 Чувствительное к температуре изменяющие состояние средство гидрогеля
- 2025120 Способ получения препарата, содержащего Фактор /G-CSF/, стимулирующий рост колоний гранулоцитов
- 2319490 Средство для введения железа при лечении синдрома беспокойных ног
- 25995 Содержащее адгезив приспособление для фиксации зубных протезов в полости рта
- 2218907 Средство для ухода за кожей лица и веками
- 2318830 Способ получения модифицированного дерматансульфата
- 2118153 Косметика - туш для ресниц
- 2217441 Способ получения полимера
- 2317296 Изетионатная соль селективного ингибитора CDK4
- 2217171 Мембрана для использования при направленной регенерации тканей
- 2317095 Экстракты ECHINACEA ANGUSTIFOLIA
- 2216332 Препарат для лечения астроза
- 2216314 Крем - маска для обезвоженной кожи
- 2316333 Средство оздоровительно-восстановительных косметических панто-магниевых ванн
- 2021304 Способ получения биологически активного средства
- 2115662 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2315627 Впрыскиваемые имплантанты на керамической основе для заполнения морщин, кожных впадин, шрамов
- 2315623 Средство получаемое путем лиофилизации препарата
- 2114862 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2314791 Лечебно-Косметическое средство
- 2314791 Косметический крем-бальзам для ухода за кожей лица и шеи
- 2214600 Способ оценки эффективности лечения неврологических проявлений
- 2114602 Способ косметической обработки
- 2114587 Раствор для защиты роговицы
- 2214283 Имплантант для подкожного или внутрикожного введения
- 2313370 Медицинские протезы, имеющие улучшенную биологическую совместимость
- 2313356 Препарат для лечения демодекоза
- 2313338 Средство на основе этиллинолеата и триэтилцитрата для лечения себореи и угрей
- 2313328 Косметика содержащая тонкодисперный и пористый порошок
- 2212880 Способ получения препарата содержащего антибиотик, с замедленным высвобождением активного вещества
- 2312640 Способ лечения Блефароконьюнктивальной формы синдрома сухого глаза
- 2017751 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2312145 Гены CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM, кодирующие белки, участвующие в синтезе мембран и мембранном транспорте
- 2311458 Белки вызывающие измененную иммуногенную реакцию. Способ их получения и использования
- 2311183 Улучшенное разделение с использованием гталуроновой кислоты
- 2311177 Ингибиторы интегрина для лечения заболевания глаз
- 2300069 Косметическая маска
- 2211024 Уход за сухой кожей
- 2310440 Раствор для защиты роговицы от повреждений
- 2309684 Лечение межфалангового остеоатроза узелковой формы
- 2309406 Способ мониторинга фиброза печени у больных хроническим гепатитом с (ХГС)
- 2209088 Опосредованная рецепторами доставка генов с использованием векторов на основе бактериофагов
- 2308967 Уменьшение объема ткани
- 2308962 Средство для опорно-дигательного аппарата
- 2308957 Способ получения препарата для мезотерапии
- 2308954 Средство для лечения ран, содержащее плазму или сыворотку крови
- 2308951 Комплексный способ профилактики вагинальных дисбактериозов
- 2308937 Косметическая биологически активная добавка и косметический литофитокомплекс на ее основе
- 2208638 ДНК (варианты), способ получения белка
- 2207885 Способ подачи небольшого объема лечебного раствора к целевому месту
- 2207858 Лишенные побочных эффектов производные простагландинов для лечения глаукомы
- 2207845 Твердая лекарственная форма пролонгированного действия
- 2207844 Препарат для местного неинвазивного применения
- 2207841 Средства с антиферментативным действием
- 2306335 Стволовые клетки и решетки полученные из жировой ткани
- 2306140 Новые рецепторы для Helicobacter pylori и их применение
- 2205612 Способ эндотелизации IN VITRO протезов кровеносных сосудов
- 2105540 Депигментирующее средство
- 2304960 Косметическое средство для кожи
- 2304616 Гены участвующие в гомеостазе и адаптации
- 2204550Способ получения длинноцепочечной N-Ацилированной кислотой Аминокислот
- 2204415 Способ получения изображения
- 2204394 Средство для лечения грибковых инфекций, желудочных язв
- 2204366 Способ хирургического лечения глаукомы
- 2104034 Вагинальное увлажняющие средство, способ его получения
- 2303991 Биологически активная добавка
- 2303990 БАД
- 2303973 Адсорбирующее изделие
- 2203676 Средство обладающее иммунокорригирующим действием
- 2203672 Способ предупреждения беременности
- 2303635 Гены кодирующие белки резистентности и толерантности к стрессам
- 2303529 Способ фиксации альгинатного геля на твердой фазе, способ получения клеточного чипа на его основе
- 2203078 Способ лечения гнойных ран
- 2302412 Гидразоно-малонитрилы
- 2102400 Способ получения гиалуроновой кислоты
- 2202356 Способ стимуляции репаративных процессов длительно незаживающих ран и трофических язв
- 2202336 Средство для ухода за кожей
- 2302231 Глазные капли
- 2102082 Способ магнитометрического исследования тела человека или животного
- 2301814 Полиакриламидный гидрогель
- 2201765 Гибридные матричные имплантанты и эксплантанты
- 2301677 Биотрансплантант для лечения дегенеративных и трвматических заболеваний хрящевой ткани и способ его получения
- 2301676 Способ лечения ревматизма
- 2301674 Способ лечения больных с переломами нижней челюсти
- 2301661 Средство с регулируемым освобождением и способ его получения
- 2005488 Средство для лечения болезней соединительной ткани
- 2200001 Крем для кожи
|
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
|
Патент №2179981 |
(54) СОЛИ ПЕРЕХОДНОГО МЕТАЛЛА С ПОЛИПЕПТИДОМ И СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПОЛИПЕПТИДА ПРОТИВ ВИЧ
(57) Реферат:
Изобретение относится к соединениям соли полипептида, представленного в формуле (I), где А1, А2, А3, А4, Х, Y и Z имеют значения, представленные в описании, и переходного металла, которые обладают высокой антивирусной активностью против вируса иммунодефицита человека. Описаны также способ повышения активности против ВИЧ соединения полипептида формулы (I), заключающийся в том, что указанный полипептид переводят в соль с переходным металлом, а также фармацевтическая композиция, включающая в себя соединение соли полипетида (I) с переходным металлом, обладающая антивирусной активностью. 3 c. и 4 з.п. ф-лы, 2 табл.  Изобретение касается соли переходного металла с полипептидом, который проявляет сильное сродство к липополисахаридам, в частности к эндотоксинам, и кроме того, изобретение касается способа повышения антивирусной активности (например, активности против ВИЧ) полипептида, посредством которого указанная антивирусная активность проявляется стабильно и сильно, путем преобразования указанного полипептида в соль переходного металла, а также касается фармацевтической композиции или лекарственной композиции для ингибирования ВИЧ-активности, которая включает в себя в качестве активного ингредиента указанную соль переходного металла с полипептидом (которая здесь иногда называется солью полипептида и переходного металла). Как показано в упоминаемых ниже публикациях, из мечехвостов выделили два семейства антимикробных полипептидов, которые проявляют сродство к эндотоксинам. См. , например, Shigenaga et al., 1990, J.Biol. Chem., 265:21350-21354; Kawano et al., 1990, J.Biol. Chem., 265:15365-15367; Muta et al., 1990, J. Biochem., 108:261-266; выложенная заявка на патент Японии 167230/1990; выложенная заявка на патент Японии 1152987/1990; выложенная заявка на патент Японии 53799/1990; патент США номер 5068314 (опубликованная заявка с проведенным патентным поиском 500194/1990); Miyata et al., 1989, J.Biochem., 106: 663-668; Akaji et al., 1989; Chem. Pharm. Bull. 37:2661:2664; Tokunaga and Iwanaga, 1989, Taisha (Metabolism), 26:429-439); Shieh et al., 1989, FEBS Lett., 252:121-124; Nakamura et al., 1988, J. Biol. Chem., 263:16709-16713. Одно семейство - семейство тахиплесинов - выделили из японского меченосца Tachypleus. Идентифицировали три тахиплесина I, II и III. Другое семейство - семейство полифемузинов - выделили из американского меченосца Limulus polyphemus. Идентифицировали два полифемузина I и II. Было установлено, что оба указанные семейства тахиплесины и полифемузины ингибируют рост как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий при низких концентрациях, а также грибков, таких как Candida albicans, и образуют комплексы с бактериальным липополисахаридом (Shigenaga et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:21350-21354; Muta et al., 1990, J. Biochem., 108:261-266). Было также установлено, что полипептид семейства тахиплесинов оказывает ингибирующее действие на вирусы, такие как вирус гриппа, вирус везикулярного стоматита (Murakami et al., 1991, Chemotherapy, 37, 327-334) или вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) (Morimoto et al., 1991, Chemotherapy, 37, 206-211). С другой стороны, с точки зрения выживания высокоразвитых человеческих существ чрезвычайно необходима разработка лекарств, которые могут оказать профилактическое или терапевтическое действие в отношении синдрома приобретенного иммунодефицита человека (СПИДа), вызываемого заражением вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Авторы настоящего изобретения в результате исследований по корреляции между структурным преобразованием полипептида, обладающего сродством к эндотоксину, и его активностью против ВИЧ открыли серию неизвестных ранее полипептидов, которые принципиально отличаются от обычной структуры полипептида меченосцев и проявляют высокую степень активности против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), и эти результаты были опубликованы в нижеуказанных публикациях (Nakashima et al. , 1992, Antimicrob. Agents Chemother., 36: 1249-1255; Masuda et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun., 189:845-850; Tamamura et al. , 1993, Chem. Pharm. Bull., 41:978-980; Tamamura et al., 1993. Biochem. Biophys. Acta, 1163:209-216; Masuda et al., 1992, J. Pharmacobio. Dyn. , 15: s-90; патент США 5571892 (международная публикация WO 92/04374); патент США 5449752 (выложенная заявка на патент Японии 163298/1993)). В результате изучения требований к структуре, связанных с экспрессированием активности полипептида против ВИЧ, на основе базовой структуры полипептида, полученного из меченосцев, который состоит из 16-18 аминокислотных остатков, авторы настоящего изобретения разработали и представили в качестве изобретения неизвестную ранее концепцию, в которой фокусируется внимание на минимально необходимой структуре (Международная заявка WO 95/10534). В соответствии с вышеупомянутым изобретением структурная концепция взятого в качестве примера соединения - полипептида, происходящего из полипептида меченосцев как стандартного материала и проявляющего антивирусную активность, может быть выражена с помощью нижеприведенной формулы [I]
(в которой A1 независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из Lys (лизина), Аrg (аргинина) и Оrn (орнитина); остаток пептида, имеющий, по меньшей мере, два из указанных остатков основных аминокислот; или остаток N- -замещенной аминокислоты или остаток N--замещенного пептида, в которых атом водорода в N--положении остатка аминокислоты, находящийся в амино-конце указанного остатка основной аминокислоты или указанного остатка пептида, может быть заменен на ацильную группу или на группу замещенного тиокарбамоила;
A2 независимо представляет собой остаток аминокислоты, выбранной из Phe (фенилаланина), Тrр (триптофана) и Туr (тирозина);
А3 независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из Lys, Arg и Orn;
А4 представляет собой -ОН (происходящий из карбоксильной группы) или -NH2 (происходящий из группы кислого амида);
Х представляет собой пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, где в следующем положении одного остатка аминокислоты, выбранной из А1а (аланина), Val (валина), Leu (лейцина), Ilе (изолейцина), Sеr (серина), Met (метионина) и Суs (цистеина), одна из аминокислот из A2 присоединена через пептидную связь;
Y представляет собой пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Gly (глицина) и одного остатка аминокислоты, выбранной из А3, или пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Pro (пролина) и остатка одной аминокислоты, выбранной из D-Arg, D-Lys и С-Оrn;
Z представляет собой пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, где в следующем положении одного остатка аминокислоты, выбранной из Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met и A2, Cys присоединен через пептидную связь;
и остаток X-Y-Z, соединенный пептидными связями, присоединен к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях через пептидные связи, или из-за конкурентной делеции Х и Z, остаток Y может быть присоединен напрямую к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях через пептидные связи, где атом водорода находящейся в боковой цепи  -аминогруппы D-Lys, L-Lys, D-Orn или L-Orn, являющийся составной частью аминокислоты из Y, может быть замещен -аминоацильной группой. Уже установлено, что полипептиду, имеющему структуру вышеупомянутой формулы [I] , в дополнение к высокой активности против ВИЧ можно также придать свойство сохранять эту активность при модификации специфического сайта без снижения активности и при этом за счет такой модификации полипептид получает новые свойства, что позволяет иметь широкий выбор разнообразных физических и/или химических свойств и возможностей терапевтического использования, на основе свойств, которые имеет базовая структура, например, можно увеличивать или уменьшать гидрофильность или липофильность, селективно аккумулировать его в конкретной ткани, органе или клетке, увеличивать или уменьшать время удерживания его в организме или разрабатывать лекарственные формы со стандартными дозировками. В таблице 1 приведены примеры тех полипептидов формулы [I], которые проявляют высокую активность против ВИЧ. Авторы настоящего изобретения сделали это изобретение на основе полученного ими факта, что образование соли между полипептидом формулы [I] и соединением переходного металла позволяет проявлять и стабильно сохранять высокую активность полипептида против ВИЧ, и на основе выяснения причины того, почему полипептид, показанный в формуле [I], специфически проявляет активность против ВИЧ. Первой целью настоящего изобретения является создание не существовавшей ранее соли переходного металла с полипептидом, который проявляет высокую антивирусную активность и имеет специфическую структурную формулу, а вторая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы посредством преобразования указанного полипептида в соль переходного металла создать способ повышения физиологической активности, особенно антивирусной активности, такой как активность против ВИЧ, а также способ проявления фармацевтически стабильной активности в качестве терапевтического средства, а также создать лекарственную композицию. Настоящее изобретение касается соединения соли переходного металла с полипептидом, показанным в формуле [I], который проявляет сильное сродство к липополисахаридам, в частности к эндотоксинам, и кроме того, настоящее изобретение касается способа повышения антивирусной активности (например, активности против ВИЧ) этого полипептида, в результате чего она проявляется стабильно и сильно, посредством преобразования указанного полипептида в соль переходного металла. В частности, настоящее изобретение касается:
(1) соединения, являющегося солью переходного металла с полипептидом, показанного в следующей формуле:
(в которой A1 независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранный из Lys, Arg и Orn; остаток пептида, имеющий, по меньшей мере, два из указанных остатков основных аминокислот; или остаток N--замещенной аминокислоты или остаток N--замещенного пептида, в которых атом водорода в N--положении аминокислотного остатка в амино-конце указанного остатка основной аминокислоты или указанного остатка пептида может быть заменен ацильной группой или группой замещенного тиокарбамоила;
A2 независимо представляет собой остаток аминокислоты, выбранной из Phe, Trp и Туr;
А3 независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из Arg, Lys и Orn;
А4 представляет собой -ОН (происходящий из карбоксильной группы) или -NH2 (происходящий из группы кислого амида);
Х представляет собой пептидный остаток двух аминокислотных остатков, где в следующем положении одного остатка аминокислоты, выбранной из Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met и Cys, одна из аминокислот из А2 присоединена через пептидную связь;
Y представляет собой пептидный остаток двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Gly и остатка одной аминокислоты, выбранной из А3, или пептидный остаток двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Pro и остатка одной аминокислоты, выбранной из D-Arg, D-Lys и D-Orn;
Z представляет собой пептидный остаток двух аминокислотных остатков, где в следующем положении одного остатка аминокислоты, выбранной из Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met и А2, Cys присоединен через пептидную связь;
и остаток X-Y-Z, соединенный пептидными связями, присоединен к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях пептидными связями, или в результате конкурентной делеции Х и Z, остаток Y может быть присоединен напрямую к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях пептидными связями, где атом водорода находящейся в боковой цепи -аминогруппы D-Lys, L-Lys, D-Orn или L-Orn, являющийся составной частью аминокислоты из Y, может быть замещен -аминоацильной группой, или кислот соли присоединения указанного соединения соли переходного металла с полипептидом и кислоты;
(2) соединения соли переходного металла с полипептидом или кислот соли присоединения указанной соли переходного металла с полипептидом по п.(1), в котором соль переходного металла представляет собой комплексную соль;
(3) соединения соли переходного металла с полипептидом или кислот соли присоединения указанной соли переходного металла с полипептидом по пп. (1) или (2), в котором переходный металл выбирают из группы, состоящей из группы железа в составе Fe, Co и Ni, группы меди в составе Сu, Аg и Аu, группы цинка в составе Zn, Cd и Нg, группы марганца в составе Мn, Тc и Re;
(4) способа повышения и экспрессирования высокой и стабильной активности против ВИЧ соединения полипептида, показанного в следующей формуле:
(в которой A1 независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из Lys, Arg и Orn; остаток пептида, имеющий, по меньшей мере, два из указанных остатков основных аминокислот; или остаток N--замещенной аминокислоты или остаток N--замещенного пептида, в которых атом водорода в N--положении аминокислотного остатка, находящийся в амино-конце указанного остатка основной аминокислоты или указанного остатка пептида, может быть заменен на ацильную группу или на группу замещенного тиокарбамоила;
А2 независимо представляет собой остаток аминокислоты, выбранной из Phe, Trp и Туr;
А3 независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из Arg, Lys и Оrn;
А4 представляет собой -ОН (происходящий из карбоксильной группы) или -NH2 (происходящий из группы кислого амида);
Х представляет собой пептидный остаток двух аминокислотных остатков, где в следующей позиции одного остатка аминокислоты, выбранной из Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met и Суs, одна из аминокислот из А2 присоединена через пептидную связь;
Y представляет собой пептидный остаток двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Gly и остатка одной аминокислоты, выбранной из А3, или пептидный остаток двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Pro и остатка одной аминокислоты, выбранной из D-Arg, D-Lys и D-Orn;
Z представляет собой пептидный остаток двух аминокислотных остатков, где в следующем положении одного остатка аминокислоты, выбранной из Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met и A2, Cys присоединен через пептидную связь;
и остаток X-Y-Z, присоединенный пептидными связями, присоединен к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях пептидными связями, или из-за одновременно действующей делеции Х и Z, остаток Y может быть присоединен напрямую к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях пептидными связями, где атом водорода находящейся в боковой цепи -аминогруппы D-Lys, L-Lys, D-Orn или L-Orn, являющийся составной частью аминокислоты из Y, может быть замещен -аминоацильной группой посредством преобразования указанного полипептида [I] в соль с переходным металлом;
(5) фармацевтической композиции или лекарственной композиции, включающей в себя эффективное количество соединения соли переходного металла с полипептидом или кислотной соли присоединения указанного соединения соли переходного металла с полипептидом согласно (1) и фармацевтический носитель;
(6) композиции по п. (5), ингибирующей вирусную активность; и
(7) композиции по п.(5), ингибирующей активность ВИЧ у пациента. В качестве примеров ацильных групп, на которые может быть заменен атом водорода в вышеупомянутом положении N-, приведены ацильные группы, имеющие от 2 до 18 атомов углерода, и в частности ацетильная группа, пропионильная группа, бутирильная группа, гексаноильная группа, октаноильная группа, деканоильная группа, лауроильная группа, миристоильная группа, пальмитоильная группа, стеароильная группа, никотиноильная группа и подобные им. В качестве примеров замещающих групп, которые могут быть использованы вместо групп замещенного тиокарбамоила, которые, в свою очередь, могут замещать атом водорода в вышеупомянутом положении N-, приведены флуоресцеиновая группа, фенильная группа, группа замещенного фенила (например, диметиламинофенил-азофенильная группа) и подобные им. В качестве примеров -аминоацильных групп, которые могут замещать атом водорода находящейся в боковой цепи -аминоацильной группы D-Lys, L-Lys, D-Orn или L-Orn, который является составной частью аминокислоты вышеупомянутого Y, приведены -аминоацильная группа, имеющая от 2 до 6 атомов углерода, и особенно -аминоацетильная группа, -аминобутирильная группа, -аминогексаноильная группа и подобные им. В приведенной здесь последовательности полипептида каждый символ представляет собой остаток аминокислоты или остаток замещенной аминокислоты, обозначенный в соответствии с международно принятой трехбуквенной аббревиатурой, и кроме особо оговоренных случаев, этот остаток аминокислоты или остаток замещенной аминокислоты представляет собой L-форму. Например, каждый символ представляет собой нижеследующую аминокислоту или замещенную аминокислоту:
Ala, Arg, Cys, Ile, Gly, Leu, Ser, Met, Lys, Orn, Phe, Pro, Trp, Tyr, Val, DArg, DLys, Dorn, Ac-Arg (N--ацетиларгинин), FTC-Arg (N--флуоресцеин тиокарбамоил аргинин), Laur-Arg (N-- лауроил аргинин), Myr-Arg (N--миристоил аргинин), Nicot-Arg (N--никотиноил аргинин), Oct-Arg (N--октаноил аргинин), Parm-Arg (N--пальмитоил аргинин), Parm-Orn (N--пальмитоил орнитин), PTC-Arg (N--фенилтиокарбамоил аргинин),  -N-Ac-Dlys(-N--аминоацетил-D-лизин)и-N-But-Dlys аминобутирил-D-лизин). Настоящее изобретение, которое было выполнено на основе вышеизложенных точек зрения, касается соли полипептида, включающей в себя соль переходного металла, выбранного из группы, состоящей из группы железа, группы меди, группы цинка и группы марганца, и полипептид, показанный в нижеследующей формуле:
(в которой A1 независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из Lys (лизина), Аrg (аргинина) и Оrn (орнитина); остаток пептида, имеющий, по меньшей мере, два из указанных остатков основных аминокислот; или остаток N--замещенной аминокислоты или остаток N--замещенного пептида, в которых атом водорода в N--положении аминокислотного остатка, находящийся на амино-конце указанного остатка основной аминокислоты или указанного остатка пептида, может быть заменен на ацильную группу или на группу замещенного тиокарбамоила;
A2 независимо представляет собой остаток аминокислоты, выбранной из Phe, Trp и Туr;
А3 независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из Аrg, Lys и Оrn;
А4 представляет собой -ОН (происходящий из карбоксильной группы) или -NH2 (происходящий из группы кислого амида);
Х представляет собой пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, где в следующем положении одного остатка аминокислоты, выбранной из Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met и Суs, одна из аминокислот из А2 присоединена через пептидную связь;
Y представляет собой пептидный остаток двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Gly и остатка одной аминокислоты, выбранной из А3, или пептидный остаток двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Pro и остатка одной из аминокислот, выбранной из D-Arg, D-Lys и D-Orn;
Z представляет собой пептидный остаток двух аминокислотных остатков, где в следующем положении одного остатка аминокислоты, выбранной из Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met и А2, Суs присоединен через пептидную связь;
и остаток X-Y-Z, присоединенный через пептидную связь, присоединен к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях через пептидные связи, или в результате конкурентной делеции Х и Z, остаток Y может быть присоединен напрямую к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях через пептидные связи, где атом водорода находящейся в боковой цепи -аминогруппы D-Lys, L-Lys, D-Orn или L-Orn, являющийся составной частью аминокислоты из Y, может быть замещен -аминоацильной группой), а также касается соли указанного полипептида, в которой соль переходного металла является комплексной солью, и целью настоящего изобретения является посредством преобразования указанного полипептида формулы [I], имеющего высокую активность против ВИЧ, в продукт в виде соли, создать способ повышения и стабилизации активности этого полипептида. Ранее не существовавшее соединение соли переходного металла с полипептидом согласно изобретению ниже описывается более подробно. ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ
Полипептид, показанный в формуле [I] настоящего изобретения, можно непосредственно получить известными способами, например с помощью метода твердофазного синтеза, описанного в "Solid Phase Peptide Synthesis", Stuart&Young, Pierce Chemical Co. , Rockford, Illinois (1984). В случае остатка N--ацилоаминокислоты или остатка N--ацилпептида, где атом водорода в N--положении на амино-конце остатка аминокислоты заменен ацильной группой в A1 формулы [I] , полипептид с прямой цепью формулы [I] связывают с нерастворимым полимером, для того, чтобы получить полипептидный полимер, и осуществляют реакцию указанного полипептидного полимера с ангидридом карбоновой кислоты или с карбоновой кислотой, соответствующими ацильной группе, с использованием конденсирующего агента, для того, чтобы ацилировать указанную N-концевую аминогруппу и получить N-ацилированный полипептидный полимер. Затем этот нерастворимый полимер и защитные группы из аминокислот удаляют и получают полипептид с прямой цепью формулы [I]. В случае остатка N--замещенной тиокарбамоильной аминокислоты или остатка N--замещенного тиокарбамоильного пептида, где атом водорода в N--положении в аминном конце остатка аминокислоты заменен тиокарбамоильной группой в A1 формулы [I], N-концевой N--замещенный тиокарбамоильный полипептид согласно изобретению может быть получен посредством реакции вышеупомянутого полипептида с соединением замещенного изотиоцианата, осуществленной в условиях слабощелочной среды. У полученного таким образом полипептида карбоксильный конец аминокислотного остатка в 14-м положении может быть либо свободным (А4 соответствует -ОН), либо преобразованным в кислый амид (А4 соответствует -NH2). За исключением особо оговоренных случаев, индивидуальные аминокислоты, используемые в вышеупомянутом методе твердофазного синтеза, находятся в L-форме, а основная аминокислота, спаренная с пролином в 8-м положении, обозначенная через Y, ограничена D-формой. В качестве альтернативы полипептид согласно изобретению может быть также получен способом, предусматривающим использование рекомбинантной ДНК. В соответствии с этим способом последовательности, кодирующие нуклеотиды для полипептида согласно изобретению, можно клонировать и экспрессировать посредством методов, хорошо известных специалистам в данной области техники. См. , например, Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory anual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1991. Полипептид согласно изобретению можно выделить и очистить с помощью методов, известных в области техники, связанной с полипептидами, например, таких как экстрация, перекристаллизация, различные виды хроматографии (гельфильтрационная, ионообменная, распределительная, адсорбционная хроматография, хроматография с обращенной фазой), электрофорез, метод противоточного распределения и т.п., и среди них наиболее эффективным является метод жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной фазой. В качестве примеров работ, в которых описаны такие способы изготовления, можно сослаться на следующие публикации: патент США 5571892 (международная заявка WO 92/04374); Патент США 5449752 (выложенная заявка на патент Японии 163298/1993) и международная публикация WO 95/10534. Полипептид, показанный в формуле [I], содержит в своей молекуле остатки цистеина, аргинина и лизина, и согласно стереоструктурной информации, по меньшей мере, одна пара остатков цистеина или остатков аргинина принимает такую конформацию, что боковая цепь -SH или гуанидиновая боковая цепь непосредственно располагается на той же самой стороне в стереоструктуре, так что указанная боковая цепь способна стабильно образовывать комплексную соль с соединением переходного металла. Однако указанный полипептид обычно принимает окисленную форму -S-S, поэтому предпочтительно, чтобы указанный полипептид предварительно изменили до восстановленной (-SH) формы, что облегчит образование комплексной соли с переходным металлом. Например, комплексную соль с переходным металлом можно получить путем добавления к водному нейтральному раствору указанной восстановленной формы полипептида, по меньшей мере, двух эквивалентов соли переходного металла, предпочтительно водорастворимой соли переходного металла и органической или неорганической кислоты (например, ацетата цинка). Соединение соли переходного металла с полипептидом, показанным в формуле [I] настоящего изобретения, проявляет чрезвычайно сильную основность. Благодаря этой сильной основности соль присоединения образуют путем добавления кислоты. Образуют соль с фармацевтически пригодной кислотой, например с неорганической кислотой, такой как соляная кислота, бромистоводородная кислота, фосфорная кислота, азотная кислота, серная кислота и подобные им, с органической карбоновой кислотой, такой как уксусная кислота, с галогенизированной уксусной кислотой, такой как трифторуксусная кислота, пропионовая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, лимонная кислота, винная кислота, салициловая кислота и подобные им, с кислыми сахарами, такими как глюкуроновая кислота, галактуроновая кислота, глюконовая кислота, аскорбиновая кислота и подобные им, с кислыми полисахаридами, иногда включающими в себя сульфаты полисахаридов, такими как гиалуроновая кислота, хондроитинсульфаты, альгиновая кислота и подобные им, с органическими сульфоновыми кислотами, такими как метансульфоновая кислота, р-толуолсульфоновая кислота и подобные им. Соль переходного металла с полипептидами, показанными в формуле [I] настоящего изобретения, можно использовать для приготовления лекарственной композиции, в качестве соли присоединения с указанной фармацевтически пригодной кислотой. ПРИМЕНЕНИЕ СОЕДИНЕНИЯ СОЛИ ПЕРЕХОДНОГО МЕТАЛЛА С ПОЛИПЕПТИДОМ СОГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЮ
Соединение соли переходного металла с полипептидом формулы [I] имеет свойство связывать эндотоксины, обладает антибактериальной активностью и способностью гемолизировать форменные элементы крови, чувствительные к эндотоксинам. Кроме того, соединение соли переходного металла с полипептидом согласно изобретению обладает чрезвычайно высокой антивирусной активностью. В конкретном варианте осуществления изобретения соединение соли переходного металла с полипептидом согласно изобретению обладает активностью против ВИЧ. Лекарство, в частности средство против ВИЧ, согласно изобретению можно приготовить в виде лекарственной композиции, включающей в себя соединение соли переходного металла с полипептидом, показанным в формуле [I], или соль присоединения указанного соединения соли переходного металла и полипептида с фармацевтически пригодной кислотой в качестве эффективного компонента, а также фармацевтически пригодный носитель, выбранный в соответствии со способом назначения и способом приема лекарственного средства. В качестве примеров фармацевтически пригодных носителей приведены физиологически совместимые буферы, такие как растворы Хэнкса или Рингера, физиологический раствор, физиологический раствор глюкозы или их смесь, а также гепаринизированный раствор из лимонной кислоты, цитрата натрия и декстрозы. Средство против ВИЧ согласно изобретению назначают для приема внутрь или для парентерального введения, в зависимости от объекта, против которого проводят лечение, или для дезинфекции от вирусной болезни внутри тела, либо для дезинфекции пораженных вирусом наружных участков тела, таких как поверхность тела, и его можно приготовить в такой препаративной форме как порошок, гранулы, раствор для инъекций или для приема внутрь, таблетки, суппозитории, пессарии, мазь, крем или аэрозоль, с использованием подходящего фармацевтически пригодного носителя, в соответствии со способом назначения и приема лекарственного средства. В случае, когда средство против ВИЧ согласно изобретению назначают пациенту напрямую в виде инъекций, то полипептид или его соль согласно изобретению растворяют в физиологическом растворе и вводят постоянно или прерывисто в количестве от 10 до 5000 мг на кг веса тела человека в день или путем внутривенного вливания через капельницу. ПРИМЕРЫ
Ниже показаны примеры осуществления настоящего изобретения, которые не исчерпывают объема данного изобретения. В нижеприведенных примерах описаны примеры получения солей переходного металла с полипептидом (1) и полипептидом (2) и приведены результаты анализов на активность против ВИЧ для солей переходного металла с полипептидом согласно изобретению, а также для известных полипептидов, обладающих сродством к эндотоксинам. ПРИМЕР 1: ПОЛУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСНОЙ СОЛИ ЦИНКА С ПОЛИПЕПТИДОМ (1)
Следующий полипептид (1) (см. в конце описания) синтезировали и получили с помощью способа, описанного в патенте США 5571892 (международная публикация WO 92/04374) и в патенте США 5449752 (выложенная заявка на патент Японии 163298/1993). 1.1. ПОЛУЧЕНИЕ ВОССТАНОВЛЕННОЙ ФОРМЫ ПОЛИПЕПТИДА (1)
Ацетат полипептида (1) (10,2 мг, 3,37 мкмоль), полученный в соответствии с вышеупомянутой международной публикацией РСТ, растворяли в очищенной воде (0,5 мл). К этому раствору добавляли дитиотрейтол (производства корпорации Сейкагаку) (26,0 мг, 169 мкмоль), в количестве 50-кратного эквивалента по отношению к полипептиду (1), промывали газообразным азотом и перемешивали в потоке азота при комнатной температуре в течение двух часов. Ход указанной реакции восстановления отслеживали с помощью ВЭЖХ, чтобы подтвердить окончание процесса восстановления. После завершения реакции восстановления указанный реакционный раствор загружали в колонку (2,5 х 70 см) с сефадексом G-25 (тонкий), (производства компании фармация Биотех. Кo Лтд.), который предварительно уравновешивали водным раствором 25%-ной уксусной кислоты, извлекли из адсорбента с помощью того же самого водного раствора 25%-ной уксусной кислоты и затем подвергли фракционированию (1 фракция = 224 капли). Фракционные порции с номерами фракций 26 и 27, которые проявили положительную реакцию Элльмана (G.L.Ellman, Arch. Biochem. Biophys. , 82, 70 (1959); способ обнаружения тиоловых групп) и при реакции флуоресценции (A.M.Felix et al., J. Chromatogr., 89, 361 (1974), способ флуоресцентного обнаружения аминогрупп), собирали раствор указанных фракций, концентрировали в условиях вакуума и после разбавления водным раствором 10%-ной уксусной кислоты этот раствор подвергали лиофилизации и в результате получали желаемый ацетат восстановленной формы полипептида (1), что и требовалось. Выход: 6,8 мг (67%). 1.2. АНАЛИЗ ВОССТАНОВЛЕННОЙ ФОРМЫ ПОЛИПЕПТИДА (1)
Ацетат восстановленной формы полипептида (1), полученный в разделе 1.1, подвергали кислотному гидролизу в 4М метансульфоновой кислоте, содержащей 0,2% триптамина, при 115oС в течение 24 часов, по методу Лю и др. (T.-Y. Liu et al. , J.Biol. Chem., 251, 1936 (1976)). Его аминокислотный состав хорошо согласовывался с аминокислотным составом восстановленной формы полипептида (1). Удельное оптическое вращение []20D полученного ацетата восстановленной формы полипептида (1) составило -26,0o (с = 0,09, водный раствор 1М уксусной кислоты). Более того, полученный ацетат восстановленной формы полипептида (1) показал единственный пик при анализе методом ВЭЖХ при нижеследующих условиях. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА МЕТОДОМ ВЭЖХ И ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Колонка: TSK-гель ОДС - 120 Т (0,46  15 см) (Тосо К0., Лтд) + TSK жесткий гель ОДС - 120 Т (0,32 1,5 см) (Тосо К0., Лтд). Градиентное элюирование:
Элюенты:
10% ацетонитрил / 0,1% трифторуксусная кислота (раствор A). 80% ацетонитрил / 0,1% трифторуксусная кислота (раствор B). Условия градиента:
Время градиента: 1,0 мин; 29,4 мин; 35,0 мин. Концентрация раствора В соответственно: 0%; 42%; 100%. Концентрация раствора А соответственно: 10%; 39,4%; 80%. Температура: 40oС. Расход: 0,8 мл/мин. Обнаружение: 220 нм и 280 нм. Использованное количество: 5 мкл
(концентрация пептида: 1 мг/мл). Время элюирования:
ацетат восстановленной формы полипептида (I): 19,27 мин,
ацетат полипептида (I): 18,24 мин. 1.3. ПОЛУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСНОЙ СОЛИ ВОССТАНОВЛЕННОЙ ФОРМЫ ПОЛИПЕПТИДА (1) И ИОНА ЦИНКА (II)
Ацетат восстановленной формы полипептида (1), полученный в разделе 1.1., растворяли в очищенной воде или в 1М буферном растворе ацетата аммония (рН 7.2). К этому водному раствору или буферному раствору добавляли водный раствор 0,005 М ацетата цинка, соответствующий двум эквивалентам иона цинка (II) по отношению к восстановленной форме полипептида (1). Окончательную концентрацию полипептида довели до 5 мг/л и получили комплексный раствор восстановленной формы полипептида (1) и иона цинка (II). 1.4. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСНОЙ СОЛИ ВОССТАНОВЛЕННОЙ ФОРМЫ ПОЛИПЕПТИДА (1) И ИОНА ЦИНКА (II) С ПОМОЩЬЮ ИОННО-РАСПЫЛИТЕЛЬНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
Порцию комплексного раствора восстановленной формы полипептида (1) и иона цинка (II), полученного в разделе 1.3, использовали в качестве тестируемого раствора для структурного анализа и провели структурный анализ методом ионно-распылительной масс-спектрометрии при нижеследующих условиях. УСЛОВИЯ ИОННО-РАСПЫЛИТЕЛЬНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
Оборудование: трехстадийный квадрупольный масс-спектрометр типа АР IIIE (изготовитель - Перкин-Эльмер Сайекс К0., Лтд., обслуживание - Такара Шузо К0., Лтд). Инфузия образца: для инфузии образца со скоростью расхода в 5 мкл/мин использовали шприцевый насос для инфузии 22 Харвард Аппаратус (Саут Нейтик, МАСС). Напряжение на диафрагме: 130 вольт. Область масс-спектров и тому подобное: масса против электрического заряда (m/z) 600 - 1800
(в положительном режиме ионов, с шагом в 0,5 атомных единиц массы, в среднем из 30 циклов сканирования). Анализ полученных данных проводили с помощью Масsрес 3/22 (Sciex). РЕЗУЛЬТАТЫ ИОННО-РАСПЫЛИТЕЛЬНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
Измеряли значения массы для состояния зарядов +2 и +3 (m/z: 1277,00 и 851,67 соответственно), и реконструированное значение массы (m/z: 2552,48) хорошо согласовывалось с расчетным значением массы для восстановленного полипептида (1) + Zn - 4Н (m/z: 2552,40). Иначе говоря, было показано, что полипептид (1) и ион цинка (II) образуют комплекс, в котором соотношение пептид: Zn равно 1:1. ОБСУЖДЕНИЕ
Уже сообщалось, что структуру комплекса, состоящего из пептида или белка и металла, можно идентифицировать с помощью ионно-распылительной масс-спектрометрии или электрораспылительной масс-спектрометрии. Например, см. анализ цинковой пальцевой структуры домена связывания ДНК глюкокортикоидного рецептора (H. E. Witkowska et al., J. Amer. Chem. Soc., 117, 3319 (1995)), анализ координации структуры меди по отношению к цинковой пальцевой области белка (T. W. Hutchens et al., FEBS Lett., 309, 170 (1992)), обзор Umeda по ионно-распылительной масс-спектрометрии (Tanpakyshitsu Kakusan Koso, 36, 1655 (1991)) и подобные им работы. С помощью этого эксперимента также установили, что структуру комплекса восстановленной формы полипептида (1) и иона цинка (II) можно идентифицировать с помощью ионно-распылительной масс-спектрометрии. 1.5 ПОДТВЕРЖДЕНИЕ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСНОЙ СОЛИ ВОССТАНОВЛЕННОЙ ФОРМЫ ПОЛИПЕПТИДА (1) И ИОНА ЦИНКА (II) С ПОМОЩЬЮ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОЙ АДСОРБЦИОННОЙ СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ
Порции водного раствора восстановленной формы полипептида (1), полученной в р.1.1, и комплексного раствора восстановленной формы полипептида (1) и иона цинка (II), полученного в разделе 1.3, использовали в качестве тестируемого раствора для структурного анализа, и структурный анализ проводили посредством измерения спектров ультрафиолетового поглощения и их дифференциальных спектров в указанных ниже условиях. ИЗМЕРЕНИЕ СПЕКТРОВ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ПОГЛОЩЕНИЯ
Оборудование: спектрофотометр ультрафиолетового-видимого излучения Ubest 30 (Нихон-Бунко К0., Лтд). Измеряемая длина волны: 200 - 340 нм. Образец: после помещения каждого свежеприготовленного тестируемого образца в измерительную трубку его промывали газообразным азотом и немедленно проводили измерение. Нормальные спектры ультрафиолетового поглощения:
Контроль: дистиллированная вода. Тестируемый образец: раствор восстановленной формы полипептида (1) и комплексный раствор восстановленной формы полипептида (1) и иона цинка (II). Дифференциальные ультрафиолетовые спектры:
Контроль: раствор восстановленной формы полипептида (1). Тестируемый образец: комплексный раствор восстановленной формы полипептида (1) и иона цинка (II). РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗМЕРЕНИЙ СПЕКТРОВ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ПОГЛОЩЕНИЯ
Нормальные спектры ультрафиолетового поглощения:
Раствор восстановленной формы полипептида (1):
Продемонстрировали наличие большого пика поглощения при 250-300 нм, который характерен для поглощения, обусловленного триптофаном - аминокислотой, входящей в состав полипептида (1). Продемонстрировали максимум поглощения при 278 нм и плечо спектральной линии при 280 нм, которые характерны для поглощения, обусловленного триптофаном. Комплексный раствор восстановленной формы полипептида (1) и иона цинка (II):
Получили кривую поглощения, которая была уширена по отношению к кривой поглощения вышеупомянутого раствора восстановленной формы полипептида (I), с диапазоном от 250 до 200 нм. Для того чтобы уточнить длины волн поглощения, провели измерения нижеследующего дифференциального спектра. Дифференциальный ультрафиолетовый спектр:
Получили дифференциальный спектр с пиком от 215 до 235 нм и его разницу поглощения. АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ СПЕКТРОВ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ПОГЛОЩЕНИЯ
Как показано выше, при добавлении иона цинка (II) к восстановленной форме полипептида (1) ультрафиолетовое поглощение уширяется главным образом в диапазоне от 215 до 235 нм. Это дает основание полагать, как обсуждается ниже, что в растворе восстановленной формы полипептида (1) и иона цинка (II) SH-группа цистеина восстановленной формы полипептида (1) образует комплекс с ионом цинка через меркаптидную связь. ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что металлотионеин, белок, имеющий отношение к детоксикации тяжелого металла, имеет структуру, в которой SH-группа являющегося его составной частью остатка цистеина образует комплекс с ионом кадмия (II), цинка (II), меди (I, II), ртути (II) или им подобных через меркаптидную связь, и когда металл связывается с апо-металотионеином (SH-форма), то ультрафиолетовое поглощение увеличивается в пределах спектра с длинами волн, характерных для меркаптидной связи каждого металла. Например, известно, что в случае меркаптидного комплекса связи с ионом цинка (II) ультрафиолетовое поглощение увеличивается и уширяется главным образом в диапазоне 220-230 нм (см. J.H.R. Kagi and B.L.Vallee, J. Biol. Chem., 236, 2435 (1961); M.Vasak et al., Biochemistry, 20, 2852 (1981); A.R.Thrower et al., J. Biol. Chem., 263, 7037 (1988); J.H.R.Kagi et al., Environmental Health Perspectives, 54, 93 (1984) и подобные работы). Широкий диапазон, в котором увеличивается ультрафиолетовое поглощение (220-230 нм) благодаря меркаптидной связи этого иона цинка (II) согласуется с увеличенным диапазоном длин волн дифференциального спектра, наблюдавшегося для вышеупомянутого раствора восстановленной формы полипептида (1) и иона цинка (II). Иначе говоря, выяснили, что в растворе восстановленной формы полипептида (1) и иона цинка (II) SН-группа цистеина восстановленной формы полипептида (1) образует меркаптидную связь с ионом цинка (II). 1.6 АКТИВНОСТЬ ПРОТИВ ВИЧ КОМПЛЕКСНОЙ СОЛИ ВОССТАНОВЛЕННОЙ ФОРМЫ ПОЛИПЕПТИДА (1) И ИОНА ЦИНКА (II)
Порцию комплексного раствора восстановленной формы полипептида (1) и иона цинка (II), полученного в п.1.3, использовали в качестве тестируемого раствора для измерения активности против ВИЧ и измеряли эту активность против ВИЧ. ПРИМЕР 2: ПОЛУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСНОЙ СОЛИ ЦИНКА С ПОЛИПЕПТИДОМ (2)
Полипептид (2) (см. в конце описания), показанный в нижеследующей формуле, получали согласно способу, описанному в международной публикации РСТ WO 95/10534. 2.1 ПОЛУЧЕНИЕ ВОССТАНОВЛЕННОЙ ФОРМЫ ПОЛИПЕПТИДА (2)
Ацетат полипептида (2) (10,0 мг, 3,94 мкмоль), полученный в соответствии с вышеупомянутой международной публикацией РСТ, растворяли в очищенной воде (0,5 мл). К этому раствору добавляли дитиотреитол (32,0 мг, 207,5 мкмоль) (производства корпорации Сейкагаку) в количестве 53-кратного эквивалента по отношению к полипептиду (2), промывали газообразным азотом и перемешивали в потоке азота при комнатной температуре в течение двух часов. Протекание указанной реакции восстановления отслеживали с помощью ВЭЖХ и подтвердили полное восстановление. После завершения реакции восстановления указанный реакционный раствор загружали в колонку (2,5 х 70 см) с сефадексом G-25 (тонкий), (производства компании фармация Биотех. К0., Лтд.), который предварительно уравновешивали водным раствором 25%-ной уксусной кислоты, извлекали из адсорбента с помощью того же самого водного раствора 25%-ной уксусной кислоты и затем подвергали фракционированию (1 фракция = 224 капли). Фракционные порции с номерами фракций 26 и 27, которые проявляли положительную реакцию при анализе с помощью реакции Элльмана и с помощью реакции флуоресценции, собирали, раствор указанных фракций концентрировали в вакууме, и после разбавления водным раствором 10%-ной уксусной кислоты этот раствор подвергали лиофилизации, в результате чего получали ацетат восстановленной формы полипептида (2), что и требовалось. Выход: 9,8 мг (98%). 2.2 АНАЛИЗ ВОССТАНОВЛЕННОЙ ФОРМЫ ПОЛИПЕПТИДА (2)
Ацетат восстановленной формы полипептида (2), полученный в разделе 2.1, подвергали кислотному гидролизу в 4М метансульфоновой кислоте, содержащей 0,2% триптамина, при 115oС в течение 24 часов, по методу Liu et al., таким же образом, как это делали для полипептида (1) в разделе 1.2. Его аминокислотный состав хорошо согласовывался с аминокислотным составом восстановленной формы полипептида (2). Удельное оптическое вращение []20D полученного ацетата восстановленной формы полипептида (2) составило -23,3o (с = 0,04, водный раствор 1М уксусной кислоты). Более того, полученный ацетат восстановленной формы полипептида (2) показал единственный пик при анализе методом ВЭЖХ, проведенном при таких же условиях, что и анализ ВЭЖХ, выполнявшийся для полипептида (1) в разделе 1.2. РЕЗУЛЬТАТЫ АНАЛИЗА ВЭЖХ
Время элюирования:
ацетат восстановленной формы полипептида (2) - 16,14 мин
ацетат полипептида (2) - 15,87 мин
2.3. ПОЛУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСНОЙ СОЛИ ВОССТАНОВЛЕННОЙ ФОРМЫ ПОЛИПЕПТИДА (2) И ИОНА ЦИНКА (II)
Ацетат восстановленной формы полипептида (2), полученный в разделе 2.1, растворяли в очищенной воде или в 1М буферном растворе ацетата аммония (рН 7.2). К этому водному раствору или буферному раствору добавляли водный раствор 0,005 М ацетата цинка, соответствующий одному эквиваленту иона цинка (II) по отношению к восстановленной форме полипептида (2). Окончательную концентрацию полипептида доводили до 5 мг/л и получили комплексный раствор восстановленной формы полипептида (2) и иона цинка (II). 2.4. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСНОЙ СОЛИ ВОССТАНОВЛЕННОЙ ФОРМЫ ПОЛИПЕПТИДА (2) И ИОНА ЦИНКА (II) С ПОМОЩЬЮ ИОННО-РАСПЫЛИТЕЛЬНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
Порцию комплексного раствора восстановленной формы полипептида (2) и иона цинка (II), полученного в разделе 2.3, использовали в качестве тестируемого раствора для структурного анализа, и проводили структурный анализ методом ионно-распылительной масс-спектрометрии, при тех же самых условиях, при которых проводили ионно-распылительную масс-спектрометрию комплексного раствора восстановленной формы полипептида (1) и иона цинка (II), как описано в разделе 1.4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИОННО-РАСПЫЛИТЕЛЬНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
Наблюдали значения массы для состояний зарядов +2 и +3 (m/z: 1030,50 и 687,34 соответственно), и реконструированное значение массы (m/z: 2059,98) хорошо согласовывалось с расчетным значением массы для восстановленного полипептида (2) +Zn-4H (m/z: 2059,83). Иначе говоря, показали, что восстановленный полипептид (2) и ион цинка (II) образуют комплекс, в котором соотношение пептид : Zn равно 1:1. 2.5 ПОДТВЕРЖДЕНИЕ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСНОЙ СОЛИ ВОССТАНОВЛЕННОЙ ФОРМЫ ПОЛИПЕПТИДА (2) И ИОНА ЦИНКА (II) ПОСРЕДСТВОМ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОЙ АДСОРБЦИОННОЙ СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ
Порции водного раствора восстановленной формы полипептида (2), полученного в разделе 2.1, и комплексного раствора восстановленной формы полипептида (2) и иона цинка (II), полученного в разделе 2.3, использовали в качестве тестируемого раствора для структурного анализа, и структурный анализ проводили посредством измерения спектров ультрафиолетового поглощения и их дифференциальных спектров, в тех же самых условиях, которые использовали для полипептида (1) в р.1.5. ИЗМЕРЕНИЕ СПЕКТРОВ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ПОГЛОЩЕНИЯ
Нормальные спектры ультрафиолетового поглощения:
Контроль: дистиллированная вода. Тестируемый раствор: раствор восстановленной формы полипептида (2) и раствор комплексной соли восстановленной формы полипептида (2) и иона цинка (II). Дифференциальные ультрафиолетовые спектры:
Контроль: раствор восстановленной формы полипептида (2). Тестируемый раствор: комплексный раствор восстановленной формы полипептида (2) и иона цинка (II). РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗМЕРЕНИЙ СПЕКТРОВ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ПОГЛОЩЕНИЯ
Нормальные спектры ультрафиолетового поглощения:
Раствор восстановленной формы полипептида (2): обнаружили наличие большого пика поглощения при 250 - 300 нм, который характерен для поглощения, обусловленного триптофаном - аминокислотой, входящей в состав полипептида (2). Продемонстрировали максимум поглощения при 278 нм и плечо спектральной линии при 280 нм, которые характерны для поглощения, обусловленного триптофаном. Комплексный раствор восстановленной формы полипептида (2) и иона цинка (II): получили кривую поглощения, которая была уширена по отношению к кривой поглощения вышеупомянутого раствора восстановленной формы полипептида (2), с диапазоном примерно от 250 до 200 нм. Дифференциальный ультрафиолетовый спектр:
Получили дифференциальный спектр с пиком в диапазоне от 215 до 235 нм и его разницу поглощения. АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННОГО СПЕКТРА УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ПОГЛОЩЕНИЯ
Как было показано выше, при добавлении иона цинка (II) к восстановленной форме полипептида (2) наблюдали, что ультрафиолетовое поглощение уширяется главным образом в диапазоне от 215 до 235 нм. Соответственно, показали, что в растворе восстановленной формы полипептида (2) и иона цинка (II) SH-группа цистеина восстановленной формы полипептида (2) образует комплекс с ионом цинка через меркаптидную связь. 2.6 АКТИВНОСТЬ ПРОТИВ ВИЧ КОМПЛЕКСНОЙ СОЛИ ВОССТАНОВЛЕННОЙ ФОРМЫ ПОЛИПЕПТИДА (2) И ИОНА ЦИНКА (II)
Порцию комплексного раствора восстановленной формы полипептида (2) и иона цинка (II), полученного, как описано выше, использовали в качестве тестируемого раствора для измерения активности против ВИЧ и измеряли эту активность против ВИЧ. ПРИМЕР 3: АНТИВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРОТИВ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (ВИЧ)
Антивирусную активность против ВИЧ комплекса цинка с полипептидом (1), полученного в соответствии с примером 1, и комплекса цинка с полипептидом (2), полученного в соответствии с примером 2, испытывали и определяли согласно нижеследующему способу. В 96-луночный микротитрационный планшет непосредственно после заражения поместили ВИЧ-инфицированные клетки МТ-4 (2,5 х 104 клеток/лунку, множественность заражения: 0,001), наряду с испытуемыми материалами в разных концентрацииях. После инкубации в инкубаторе с CO2 при 37oС в течение 5 дней определяли количество выживших клеток, с помощью метода МТТ (Pauwels et al., J. Virol. Methods 20, 309-321 (1998)). Антивирусную активность выражали в виде концентрации, которая предотвращала на 50% гибель клеток, вызванную заражением ВИЧ (ЕС50: концентрация с 50%-ной эффективностью). С другой стороны, для того чтобы выяснить цитотоксичность испытуемых веществ для клеток МТ-4, культивировали не зараженные вирусом клетки вместе с испытуемыми материалами в различных концентрациях, как описано выше. Цитотоксичность выражали в виде концентрации, вызывающей 50%-ную цитотоксичность (CC50), обусловленную испытуемыми материалами, а примерное отношение СС50 к EC50 обозначали как эффективное отношение (SI). Результаты измерений активности против ВИЧ показаны в таблице 2, наряду с результатами по другим соединениям. ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Идентификационный номер последовательности: 1
Длина последовательности: 14
Тип последовательности: аминокислотный
Топология: линейная
Молекулярный тип: пептид
Характеристика:
Местоположение: 1
Прочая информация:
Хаа независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из лизина, аргинина и орнитина; остаток пептида, имеющий, по меньшей мере, два из указанных остатков основных аминокислот; или остаток N--замещенной аминокислоты или остаток N--замещенного пептида, в которых атом водорода в N--положении остатка аминокислоты на амино-конце указанного остатка основной аминокислоты или указанного остатка пептида может быть заменен ацильной группой или группой замещенного тиокарбамоила. Местоположение: 2
Прочая информация:
Хаа независимо представляет собой остаток аминокислоты, выбранной из фенилаланина, триптофана и тирозина. Местоположение: 4
Прочая информация:
Хаа независимо представляет собой остаток аминокислоты, выбранной из фенилаланина, триптофана и тирозина. Местоположение: 5, 6
Прочая информация:
Хаа независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из аргинина, лизина и орнитина. Местоположение: 7
Прочая информация:
Хаа независимо представляет собой пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, в котором в следующем положении остатка одной аминокислоты, выбранной из аланина, валина, лейцина, изолейцина, серина, метионина и цистеина, одна из следующих аминокислот - фенилаланин, триптофан или тирозин -присоединена через пептидную связь. Местоположение: 8
Прочая информация:
Хаа представляет собой пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка глицина и остатка одной аминокислоты, выбранной из аргинина, лизина и орнитина, или пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка пролина и остатка одной аминокислоты, выбранной из D-аргинина, D-лизина и D-орнитина. Местоположение: 9
Прочая информация:
Хаа представляет собой пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, в котором в следующем положении одного остатка аминокислоты, выбранной из аланина, валина, лейцина, изолейцина, серина, метионина, фенилаланина, триптофана и тирозина, цистеин присоединен через пептидную связь. Местоположение: 7, 8, 9
Прочая информация:
Остаток Хаа-Хаа-Хаа, присоединенный через пептидную связь, присоединен к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях через пептидные связи, или из-за одновременно действующей делеции Хаа в 7-м положении и Хаа в 9-м положении, остаток Хаа в 8-м положении может быть присоединен напрямую к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях, через пептидные связи, где водород находящейся в боковой цепи -аминогруппы D-лизина, L-лизина, D-орнитина или L-орнитина, являющийся составной частью аминокислоты 8-го Хаа, может быть замещен -аминоацильной группой. Местоположение: 10
Прочая информация:
Хаа независимо представляет собой остаток аминокислоты, выбранной из фенилаланина, триптофана и тирозина. Местоположение: 11, 12
Прочая информация:
Хаа независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из аргинина, лизина и орнитина. Местоположение: 14
Прочая информация:
Хаа независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из аргинина, лизина и орнитина.
Формула изобретения
1. Соединение соли переходного металла с полипептидом, показанным в следующей формуле:
(Идентификационный последовательности: 1), в которой
A1 независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из Lys, Arg и Orn, или остаток пептида, имеющий по меньшей мере два из указанных остатков основных аминокислот;
А2 независимо представляет собой остаток аминокислоты, выбранной из Phe, Trp и Туr;
А3 независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из Lys, Arg и Orn;
А4 представляет собой -ОН (происходящий из карбоксильной группы) или -NH2 (происходящий из группы кислого амида);
Х представляет собой пептидный остаток двух аминокислотных остатков, где первый аминокислотный остаток выбран из Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met и Cys, а второй аминокислотный остаток выбран из A2, присоединенных через пептидную связь;
Y представляет собой пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Gly и остатка аминокислоты, выбранной из А3, или пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Pro и остатка одной аминокислоты, выбранной из D-Arg, D-Lys и D-Orn;
Z представляет собой пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, где к одному остатку аминокислоты, выбранной из Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met и А2, присоединен Cys через пептидную связь; и остаток X-Y-Z, соединенный пептидными связями, присоединен к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях пептидными связями, или в результате конкурентной делеции Х и Z, остаток Y может быть присоединен напрямую к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях пептидными связями. 2. Соединение соли переходного металла с полипептидом по п. 1, в котором соль переходного металла представляет собой комплексную соль. 3. Соединение соли переходного металла с полипептидом по п. 1 или 2, в котором переходный металл выбирают из группы, состоящей из группы железа в составе Fе, Со и Ni, из группы меди в составе Сu, Аg и Аu, из группы цинка в составе Zn, Cd и Нg и из группы марганца в составе Мn, Тc и Re. 4. Способ повышения активности против ВИЧ соединения полипептида, показанного в следующей формуле:
(Идентификационный последовательности: 1), в которой
A1 независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из Lys, Arg и Orn, или остаток пептида, имеющий по меньшей мере два из указанных остатков основных аминокислот;
А2 независимо представляет собой остаток аминокислоты, выбранной из Phe, Trp и Туr;
А3 независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из Lys, Arg и Orn;
А4 представляет собой -ОН (происходящий из карбоксильной группы) или -NH2 (происходящий из группы кислого амида);
Х представляет собой пептидный остаток двух аминокислотных остатков, где первый аминокислотный остаток выбран из Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met и Cys, а второй аминокислотный остаток выбран из A2, присоединенных через пептидную связь;
Y представляет собой пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Gly и остатка аминокислоты, выбранной из А3, или пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Pro и остатка одной аминокислоты, выбранной из D-Arg, D-Lys и D-Orn;
Z представляет собой пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, где к одному остатку аминокислоты, выбранной из Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met и А2, присоединен Cys через пептидную связь; и остаток X-Y-Z, соединенный пептидными связями, присоединен к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях пептидными связями, или в результате конкурентной делеции Х и Z, остаток Y может быть присоединен напрямую к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях пептидными связями, заключающийся в том, что указанный полипептид (I) переводят в соль с переходным металлом. 5. Фармацевтическая композиция, обладающая антивирусной активностью, включающая в себя эффективное количество соединения соли переходного металла с полипептидом по п. 1, и фармацевтически приемлемый носитель. 6. Фармацевтическая композиция по п. 5, ингибирующая вирусную активность. 7. Фармацевтическая композиция по п. 5, ингибирующая активность ВИЧ в организме пациента. |
